本发明涉及一种工程菌及其在丹参素和α-酮戊二酸联产中的应用，属于生物工程
技术领域：
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提取自丹参的丹参素，学名r-(+)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸、d-(+)-β-(3,4-二羟基苯基)乳酸，英文名为：danshensu、d-dss、r-dss、(r)-(+)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-lacticacid、(r)-(+)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoicacid，是一种右旋酚酸类化合物。目前不存在天然的左旋丹参素。丹参素是丹参水提液中的重要有效成份，国内于1980年从丹参水提液中得到并鉴定了结构(丹参水溶性有效成分的研究，ⅱ.d(+)β(3,4-二羟基苯基)乳酸的结构，上海第一医学院学报，1980，05(7)，384-385)，各种研究表明丹参素具有重要的药理药效作用，在心脑血管疾病的治疗等方面具有独特治疗作用。当前丹参素主要从丹参中提取得到(专利cn200810038853.9)。丹参素在丹参中的含量较低，并且丹参素种植成本高且产量有限，因此当前丹参素不仅价格高而且远远无法满足市场的需求。专利cn201310559498.0提出了一种构建大肠杆菌基因工程菌利用葡萄糖发酵产丹参素的方法，由于合成代谢途径涉及利用羟基化酶，该酶很容易使代谢过程产物氧化而影响丹参素的产率，同时由于大肠杆菌发酵是高耗氧过程，也会氧化丹参素，因此当前该方法产率较低，成本将会高于植物提取过程。专利cn201210190171.6提出了水解丹酚酸b生产丹参素的方法，丹酚酸b需从丹参提取，并且化学水解过程有大量副反应，同样不适用于规模化生产。手性合成丹参素(专利cn201210420488.4)的催化剂极为昂贵，当前也仅停留在实验室水平。早在1988年roth等人提出了先以化学法处理左旋多巴得到对应的3,4-二羟基苯丙酮酸，再酶法合成s-(+)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸(s-dss，l-dss)的方法(enzymaticsynthesisof(s)-(-)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)lacticacid，arch.pharm.(weinheim)321，179-180(1988))。z.findrik，等人采用蛇毒氨基酸氧化酶将左旋多巴转化成3,4-二羟基苯丙酮酸，然后再用d-乳酸脱氢酶还原生成d-(3,4-二羟基苯基)乳酸(modellingandoptimizationofthe(r)-(+)-3,4-dihydroxyphenyllacticacidproductioncatalyzedwithd-lactatedehydrogenasefromlactobacillusleishmanniiusinggeneticalgorithm，chem.biochem.eng.q.19(4)351–358(2005))。这两种方法制备3,4-二羟基苯丙酮酸中间体的成本较高，且操作复杂。技术实现要素：基于目前各种方法的缺陷，本发明提供了一种光学纯的丹参素与α-酮戊二酸联产的生产方法，并构建了多酶共表达的工程菌，实现了丹参素的高效生产。本发明所要解决的技术问题是提供一种能低成本生产丹参素的重组菌。同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。本发明的第一个目的是提供能低成本生产光学纯丹参素的重组菌；所述重组菌同时表达3种酶，分别为l-氨基酸氧化酶、l-谷氨酸脱氢酶、α-羟基羧酸脱氢酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了酚类化合物分解相关的基因。在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为d型α-羟基羧酸脱氢酶，来自lactobacillusplantarumatcc14917、enterococcusfaecalisatcc35038或者lactobacillusfermentumatcc14931。在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为l型α-羟基羧酸脱氢酶，来自bacilluscoagulansdsm1、weissellaconfusastraindsm20196或者lactobacillusfermentumatcc14931。在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为d-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.为wp_003643296.1、wp_002335374.1、或eei22188.1的序列；α-羟基羧酸脱氢酶为l-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_013858488.1、wp_003607654.1或wp_035430779.1的序列。在一种实施方式中，d-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno.为nz_gl379761region:complement(533562..534560)、nz_kb944641region:161892..162830、acgi01000078region:20793..21791的序列；l-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno.为nz_atum01000014region:39316..40254、nz_jqay01000006region:69708..70640、nz_gg669901region:45517..46470的序列。在一种实施方式中，所述l-谷氨酸脱氢酶来自escherichiacolibl21、rhodobactersphaeroidesatccbaa-808、clostridiumsymbiosumatcc14940、bacillussubtilis168。在一种实施方式中，l-谷氨酸脱氢酶的氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_000373021.1、wp_011338202.1、wp_003497202.1、wp_010886557.1序列。在一种实施方式中，l-谷氨酸脱氢酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno为：nc_012892region:1786741..1788084、nc_007493region:complement(2129131..2130558)、nz_ke992901region:complement(17603..18955)、nc_000964region:complement(2402067..2403350)的序列。在一种实施方式中，所述l-氨基酸氧化酶为的来自proteusmirabilisatcc29906、cosenzaeamyxofaciensatcc19692、morganellamorganiiatcc49993、providenciarettgeridsm1131或ignatzschinerialarvaedsm13226中的不产过氧化氢的l-氧基酸氧化酶。在一种实施方式中，l-氨基酸氧化酶的氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_004244224.1、oat30925.1、efe55026.1、wp_036414800.1或wp_026879504.1的序列。在一种实施方式中，l-氨基酸氧化酶的核苷酸序列如序列表中的：nz_gg668576region:1350390..1351805、lxen01000066region:20563..21963、acci02000030region:21025..22443、nz_lagc01000006region:309569..310993、nz_ki783332region:35799..37217。在一种实施方式中，所述重组菌，是将编码l-氨基酸氧化酶、α-羟基羧酸脱氢酶和l-谷氨酸脱氢的酶的基因，都连接到质粒上，构建得到三基因共表达重组质粒，然后将重组质粒转化相应菌株，得到重组工程菌。在一种实施方式中，所述重组菌是以escherichiacolibl21(de3)为宿主构建得到的。在一种实施方式中，所述酚类化合物分解相关的基因为hpad、mhpb中的任意一种或者两种组合。在一种实施方式中，所述酚类化合物分解相关的基因的核苷酸序列是ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(4505585..4506436)和nc_012892region:339806..340750。在一种实施方式中，所述重组菌还强化表达了谷氨酸转运基因、nad合成基因、fad合成基因一种或者多种。在一种实施方式中，所述强化表达是通过将escherichiacolibl21(de3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。在一种实施方式中，所述强化表达的基因为glts(谷氨酸转运基因)、nada(nad合成基因)、ribf(fad合成基因)中的任意一种或多种。在一种实施方式中，所述glts在ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(3694931..3696136)；nada为nc_012892region:740487..741530；ribf为nc_012892region:25479..26420。本发明的第二个目的是提供一种生产丹参素的方法，所述方法是利用本发明的重组菌。在一种实施方式中，所述生产丹参素，是进行全细胞转化生产。在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，包括细胞湿重1-200g/l，左旋多巴1-200g/l，l-谷氨酸1-200g/l，ph6.0-9.0；于15-40℃反应，时间1-48小时。本发明的有益效果：本发明构建了一种新型的三酶共表达基因工程菌，该菌可应用于光学纯的3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸的生产。本发明选择的(d/l)-α-羟基羧酸脱氢酶均具有底物专一性差，光学专一性强的特点，可生产光学纯的d-丹参素和l-丹参素，同时联产α-酮戊二酸。进一步地，通过敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解，提高了重组菌的生产效率。利用本发明的重组菌转化生产丹参素和α-酮戊二酸的方法简单且原料易得，具有良好的工业化应用前景。具体实施方案本发明的工程菌的功能核心在于可以同时表达3种酶，分别为l-氨基酸氧化酶、α-羟基羧酸脱氢酶和l-谷氨酸脱氢酶。其原理为：在工程菌全细胞内，l-谷氨酸脱氢酶以菌体内的nad为辅酶将l-谷氨酸脱氢生成α-酮戊二酸和nadh；左旋多巴被l-氨基酸氧化酶脱氨生成3,4-二羟基苯丙酮酸；α-羟基羧酸脱氢酶利用谷氨酸脱氢过程生成的nadh将3,4-二羟基苯丙酮酸还原成丹参素、同时实现了辅酶nad的再生。同时敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：1.本发明所涉及的菌株及质粒购自美国菌种保藏中心atcc的lactobacillusplantarumatcc14917、enterococcusfaecalisatcc35038、lactobacillusfermentumatcc14931、bacillussubtilisatcc13952、escherichiacolibl21(de3)、proteusmirabilisatcc29906、cosenzaeamyxofaciensatcc19692、morganellamorganiiatcc49993。购自德国微生物菌种保藏中心dsmz的bacilluscoagulansdsm1、weissellaconfusastraindsm20196、providenciarettgeridsm1131、ignatzschinerialarvaedsm13226。购自novagen公司的petduet-1、pacycdue-1、pcoladuet-1、prsfduet-1质粒和escherichiacolibl21(de3)。2.大肠杆菌中相关基因的敲除及组成型强化表达(1)大肠杆菌酚类化合物分解相关的基因的敲除本发明中的酚类物质都极易被大肠杆菌中的酶分解，根据文献(biodegradationofaromaticcompoundsbyescherichiacoli，microbiolmolbiolrev.2001,65(4):523–569.)，将相关基因敲除，避免产物和底物的分解。选择的基因是hpad和mhpb,ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(4505585..4506436)和nc_012892region:339806..340750。(2)大肠杆菌谷氨酸转运基因的组成型强化表达在全细胞转化过程中，需把底物转运至细胞内才能进行，增强谷氨酸转运蛋白有助于快速并长时间维持胞内底物的高浓度，有利于反应的进行。选择谷氨酸转运相关的基因是glts，ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(3694931..3696136)。多巴与芳香族氨基酸类似，细胞培养过程中需要吸收氨基酸等，因此菌体本身会表达大量的氨基酸转运蛋白，无须再强化表达。(3)大肠杆菌辅酶合成相关重要基因的组成型强化表达在α-羟基羧酸脱氢酶还原过程中需要以nadh为辅酶，强化表达大肠杆菌nad合成途径的关键酶，可以提高菌体内的nad水平，从而有利于丹参素的生成。选择的基因有nada。ncbi上accessionno为：nc_012892region:740487..741530。fad是l-氨基酸氧化酶的辅酶，过表达该辅酶途径中的重要基因ribf，有利于强化l-氨基酸氧化酶活性。ncbi上accessionno为：nc_012892region:25479..26420。3.酶的选择(1)l-氨基酸氧化酶的选择l-氨基酸氧化酶广泛存在于细菌、真菌、哺乳动物细胞、蛇毒、昆虫毒素及藻类中(l-aminoacidoxidaseasbiocatalyst:adreamtoofar.appl.microbiol.biotechnol.2013,97:9323-41)。l-氨基酸氧化酶将α氨基和cα上的氢转移到fad上，绝大部份利用分子氧直接氧化还原型fad，再生氧化型fad，同时生成过氧化氢。例如poljanac等采用东部菱背响尾蛇毒l-氨基酸氧化酶氧化多巴生成3,4-二羟基苯丙酮酸，然后再加乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶生成3,4-二羟基苯乳酸，在此过程中另外必须添加过氧化氢酶以消除过氧化氢的毒性(modellingandoptimizationofthe(r)-(+)-3,4-dihydroxyphenyllacticacidproductioncatalyzed,chem.biochem.eng.q.2005,19(4)351–358)。另外还有一类l-氨基酸氧化酶与细胞膜上电子传递链相关，电子经过呼吸链传递给细胞色素氧化酶，使分子氧还原为水，从而不生成过氧化氢，这种酶类主要存在于变形杆菌属(proteussp.)、普罗威登菌属(providenciasp.)、摩根菌属(morganellasp.)等细菌中(crystalstructureofamembrane-boundl-aminoaciddeaminasefromproteusvulgaris.j.struct.biol.2016,195:306-15)。本发明选择了5种不产过氧化氢的l-氧基酸氧化酶，从proteusmirabilisatcc29906、cosenzaeamyxofaciensatcc19692、providenciarettgeridsm1131、morganellamorganiiatcc49993、ignatzschinerialarvaedsm13226中分别克隆得到l-氨基酸氧化酶基因pmaao、cmaao、praao、mmaao、ilaao，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.为wp_004244224.1、oat30925.1、efe55026.1、wp_036414800.1或wp_026879504.1的序列，这些酶都具有底物广泛和活性强的特点。(2)α-羟基羧酸脱氢酶的选择根据最适底物的情况，α-羟基羧酸脱氢酶包含有乳酸脱氢酶、α-羟酸异己酸脱氢酶、扁桃酸脱氢酶、乙醛酸还原酶等，这些酶能广泛作用于多种底物生成α-羟基羧酸，通常根据其最适作用的底物来命名。本发明从中选择光学性强且对3,4-二羟基苯丙酮酸具有较强活性的酶，用于d或l丹参素的生产。从lactobacillusplantarumatcc14917、enterococcusfaecalisatcc35038、lactobacillusfermentumatcc14931中分别克隆得到d型α-羟基羧酸脱氢酶基因lpldhd、efmdhd、lfldhd，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.为wp_003643296.1、wp_002335374.1、eei22188.1的序列。从bacilluscoagulansdsm1、weissellaconfusastraindsm20196、lactobacillusfermentumatcc14931中分别克隆得到l型α-羟基羧酸脱氢酶基因bcldhl、wcldhl、lfldhl，其氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_013858488.1、wp_003607654.1、wp_035430779.1的序列。(3)l-谷氨酸脱氢酶的选择l-谷氨酸是最为廉价的一种氨基酸，脱氢后成的α-酮戊二酸具有较高的附加值，目前主要以l-谷氨酸氧化酶氧化l-谷氨酸生产α-酮戊二酸，在此过程中l-谷氨酸上脱下的氢被浪费了。l谷氨酸脱氢酶广泛存在于几乎所有生物中，以l-谷氨酸为底物将l-谷氨酸上生成的氢传递给辅酶nad或nadp，从而生成nadh或nadph。nadh或者nadph可以作为前述的羟基羟酸脱氢酶的供氢体。本发明从escherichiacolibl21、rhodobactersphaeroidesatccbaa-808、clostridiumsymbiosumatcc14940、bacillussubtilis168中分别得到l-谷氨酸基因ecgdh(氨基酸序列是wp_000373021.1)、rsgdh(氨基酸序列是wp_011338202.1)、csgdh(氨基酸序列是wp_003497202.1)、bsgdh(氨基酸序列是wp_010886557.1)。4.共表达体系的构建及细胞的培养目前大肠杆菌多基因共表达有多种方法(大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122)，本发明采用刘向磊(合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇，2016，上海医药工业研究院，博士论文)所述方法构建，每个基因前均包含t7启动子和rbs结合点，理论上来讲因为每个基因前都有t7和rbs，因此基因的表达强度受排列次序的影响不大。每个质粒上包含三个基因，将构建好的质粒热转导入大肠杆菌感受态细胞中，并涂布于抗生素固体平板上，筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。细胞的培养：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到lb发酵培养基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l)中，当细胞od600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mm的iptg，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。5.全细胞转化生产光学纯丹参素细胞转化生产的体系为：细胞湿重为1-200g/l，左旋多巴浓度为1-200g/l，l-谷氨酸浓度为1-200g/l，ph6.0-9.0，于15-40℃反应，时间1-48小时。转化结束后液相色谱测定丹参素产量及构型。左旋多巴溶解度较低，高浓度情况下是含有不溶物的混悬液。6.样品的检测分析丹参素和α-酮戊二酸的定量分析：转化液采用perkinelmerseries200高效液相色谱仪检测分析，配示差折光检测器。色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦megresc18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温30℃、进样量20μl。手性分析：perkinelmerseries200高效液相色谱仪检测分析，配示紫外检测器，chiralcelod-h手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷:异丙醇:三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5ml/min，柱温25℃，进样量20μl，检测波长280nm。丹参素溶解度较低，转化过程如有结晶析出，则稀释后测定。丹参素的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价。当生产r-丹参素时，对映体过量值％e.e＝[(sr-ss)/(sr+ss)×100％]当生产s-丹参素时，对映体过量值％e.e＝[(ss-sr)/(sr+ss)×100％]式中ss为转化液中s-丹参素的峰面积，sr为转化液中r-丹参素的液相色谱峰面积。为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1l-谷氨酸脱氢酶的筛选，分别从各菌株中克隆多种l-谷氨酸脱氢酶基因，并在escherichiacolibl21(de3)中得到表达。诱导表达方法：将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到lb发酵培养基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l)中，当细胞od600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mm的iptg，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。根据文献(纳豆芽孢杆菌谷氨酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶活性测定.上海交通大学学报·农业科学版，2010，1:82-86.)破胞测定粗酶液活性，所述的方法测定l-谷氨酸脱氢酶以nad为辅酶的活性，结果如表1所示。因此选择来源于枯草芽孢杆菌的l-谷氨酸脱氢酶bsgdh用于丹参素的生产为最佳。表1不同l-氨基酸氧化酶的活性比较重组菌活性u/mlescherichiacolibl21(de3)/petduet-1-ecgdh0.3escherichiacolibl21(de3)/petduet-1-rsgdh1.1escherichiacolibl21(de3)/petduet-1-csgdh1.6escherichiacolibl21(de3)/petduet-1-bsgdh3.5实施例2根据文献largescalevalidationofanefficientcrispr/cas-basedmultigeneeditingprotocolinescherichiacoli.microbialcellfactories,2017,16(1):68所述的方法将escherichiacolibl21(de3)上的hpad和mhpb进行单或双敲除。其中，本发明所用基因敲除的质粒为pcasred与pcrispr-gdna(hpadsgrna)与同源臂(hpaddonor)一起导入escherichiacolibl21(de3)上，cas9/sgrna诱发宿主在hpad基因位点发生双链断裂，重组酶red将hpaddonor整合到hpad基因上，实现基因的敲除，并测序验证。hpadsgrna、hpaddonor、mhpbsgrna、mhpbdonor分别如序列表seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19所示。mhpb以同样的方式敲除。配置ph为7的溶液，左旋多巴或d-丹参素4g/l，湿菌体量200g/l，35℃放置10小时后测定浓度，表2中显示了反应体系中左旋多巴和d-丹参素的剩余量。表2不同菌株对底物和产物分解后的剩余浓度左旋多巴g/ld-丹参素g/lescherichiacolibl21(de3)1.51.5escherichiacolibl21(δhpadδmhpb,de3)3.63.6escherichiacolibl21(δhpad,de3)2.12.7escherichiacolibl21(δmhpb,de3)1.61.6escherichiacolibl21(δhpadδmhpb,de3)效果最好，将之命名为escherichiacolihm。实施例3重组大肠杆菌构建：首先将编码酪氨酸酚裂解酶、l-氨基酸氧化酶、α-羟基羧酸脱氢酶和l-谷氨酸脱氢酶的基因，连接到质粒上。得到三基因共表达重组质粒，将质粒转化大肠杆菌escherichiacolihm，利用抗生素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。将重组大肠杆菌诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，细胞湿重为40g/l，左旋多巴浓度为40g/l，l-谷氨酸浓度为30g/l，ph8.0，于35℃反应，时间12小时。转化结束后液相色谱测定丹参素产量及构型。表3各种重组菌的比较实施例4采用文献largescalevalidationofanefficientcrispr/cas-basedmultigeneeditingprotocolinescherichiacoli.microbialcellfactories,2017,16(1):68所述的方法，将escherichiacolihm基因组上对应基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpda)前的中等表达强度组成型启动子(pg)，序列如seqidno:15所示。强化基因glts表达时，以escherichiacolihm基因组为模板，以引物glts-ff/glts-fr、glts-gpda-f/glts-gpda-r、glts-rf/glts-rr,扩增出上游、启动子、下游序列，并以glts-ff和glts-rr为引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含gltssgrna)一起转入escherichiacolihm后，cas9/sgrna诱发宿主在glts基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到glts基因之前，并测序验证。下表为引物名称与序列表序号的对应索引。表4引物名称与序列表序号对照名称序列表中编号gltssgrnaseqidno:1glts-ffseqidno:3glts-frseqidno:4glts-gpda-fseqidno:5glts-gpda-rseqidno:6glts-rfseqidno:7glts-rrseqidno:8根据实施例1所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表5所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重5g/l，l-谷氨酸50g/l，左旋多巴20g/l，ph8.0，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间12小时。表5转化结果比较将效果最好的escherichiacolihm(pg-glts)命名为escherichiacolihml。实施例5根据实例4的方法将escherichiacolihml中nada、ribf基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpda)前的中等表达强度组成型启动子(pg)，序列如seqidno:15所示。然后再将质粒导入。强化基因nada表达时，以escherichiacolihml基因组为模板，以引物nada-ff/nada-fr、nada-gpda-f/nada-gpda-r、nada-rf/nada-rr,扩增出上游、启动子、下游序列，并以nada-ff和nada-rr为引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含nadasgrna)一起转入escherichiacolihml后，cas9/sgrna诱发宿主在nada基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到nada基因之前，并测序验证。强化基因ribf表达时，以escherichiacolihml基因组为模板，以引物ribf-ff/ribf-fr、ribf-gpda-f/ribf-gpda-r、ribf-rf/ribf-rr,扩增出上游、启动子、下游序列，并以ribf-ff和ribf-rr为引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含ribfsgrna)一起转入escherichiacolihml后，cas9/sgrna诱发宿主在ribf基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到ribf基因之前，并测序验证。下表为引物名称与序列表序号的对应索引。表6引物名称与序列表序号对照名称序列表中编号ribfsgrnaseqidno:20nadasgrnaseqidno:2ribf-ffseqidno:21ribf-frseqidno:22ribf-gpda-fseqidno:23ribf-gpda-rseqidno:24ribf-rfseqidno:25ribf-rrseqidno:26nada-ffseqidno:9nada-frseqidno:10nada-gpda-fseqidno:11nada-gpda-rseqidno:12nada-rfseqidno:13nada-rrseqidno:14基因改造完成后，将共表达质粒导入。根据实施例1所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表7所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重为20g/l，l-谷氨酸120g/l，左旋多巴120g/l，ph9.0，温度为30℃，摇床转速250转/分钟；转化时间24小时。表7转化结果比较将最好的escherichiacolihml(pg-nada,pg-ribf)命名为escherichiacolihnr。实施例6根据实施例1所述诱导表达方法，将escherichiacolihnr/pcoladuet-1-efmdhd-bsgdh-cmaao诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重1g/l，l-谷氨酸1g/l，左旋多巴1g/l，ph6.0，温度为15℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1小时。测定结果，r-丹参素浓度为93mg/l，e.e％>99.9。实施例7根据实施例1所述诱导表达方法，将表8中菌株诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重200g/l，l-谷氨酸200g/l，左旋多巴200g/l，ph8.5，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间48小时。将沉淀全部稀释溶解后测定结果。表8转化结果比较以上所述的酶及其共表达基因工程菌的改造和构建、菌体的培养基组成及培养方法和全细胞生物转化仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，理论上来讲其它的细菌、丝状真菌、放线菌、动物细胞均可进行基因组的改造，并用于多基因共表达的全细胞催化。凡在本发明的原则和精神之内所作的任何修改、等同替换。序列表<110>江南大学<120>一种工程菌及其在丹参素和α-酮戊二酸联产中的应用<130>2018.3.15<160>26<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1ttatggcttcaccaatgcga20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2ttaacggcgtcggcttcggg20<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列<400>3taagggttacgttgacggttaagca25<210>4<211>50<212>dna<213>人工序列<400>4tcggccactcatcaacatgattcattgcttaaccgtcaacgtaaccctta50<210>5<211>50<212>dna<213>人工序列<400>5taagggttacgttgacggttaagcaatgaatcatgttgatgagtggccga50<210>6<211>50<212>dna<213>人工序列<400>6ttgctaaagtatcgagatgaaacatggttttctcctgtcaggaacgttcg50<210>7<211>50<212>dna<213>人工序列<400>7cgaacgttcctgacaggagaaaaccatgtttcatctcgatactttagcaa50<210>8<211>25<212>dna<213>人工序列<400>8agccagctcccacagtttcagcccc25<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列<400>9tcgaatcctgcacgacccaccacta25<210>10<211>50<212>dna<213>人工序列<400>10tcggccactcatcaacatgattcatcgacattagcgtaatattcgctgtt50<210>11<211>50<212>dna<213>人工序列<400>11aacagcgaatattacgctaatgtcgatgaatcatgttgatgagtggccga50<210>12<211>50<212>dna<213>人工序列<400>12tgtctggatcaaacattacgctcatggttttctcctgtcaggaacgttcg50<210>13<211>50<212>dna<213>人工序列<400>13cgaacgttcctgacaggagaaaaccatgagcgtaatgtttgatccagaca50<210>14<211>25<212>dna<213>人工序列<400>14catccacggacaatgcgcgcagctg25<210>15<211>1100<212>dna<213>escherichiacolibl21(de3)<400>15atgaatcatgttgatgagtggccgatcgctacgtgggaagaaaccacgaaactccattgc60gcaatacgctgcgataaccagtaaaaagaccagccagtgaatgctgatttgtaaccttga120atatttattttccataacatttcctgctttaacataattttccgttaacataacgggctt180ttctcaaaatttcattaaatattgttcacccgttttcaggtaatgactccaacttattga240tagtgttttatgttcagataatgcccgatgactttgtcatgcagctccaccgattttgag300aacgacagcgacttccgtcccagccgtgccaggtgctgcctcagattcaggttatgccgc360tcaattcgctgcgtatatcgcttgctgattacgtgcagctttcccttcaggcgggattca420tacagcggccagccatccgtcatccatatcaccacgtcaaagggtgacagcaggctcata480agacgccccagcgtcgccatagtgcgttcaccgaatacgtgcgcaacaaccgtcttccgg540agcctgtcatacgcgtaaaacagccagcgctggcgcgatttagccccgacatagccccac600tgttcgtccatttccgcgcagacgatgacgtcactgcccggctgtatgcgcgaggttacc660gactgcggcctgagttttttaagtgacgtaaaatcgtgttgaggccaacgcccataatgc720gggcagttgcccggcatccaacgccattcatggccatatcaatgattttctggtgcgtac780cgggttgagaagcggtgtaagtgaactgcagttgccatgttttacggcagtgagagcaga840gatagcgctgatgtccggcggtgcttttgccgttacgcaccaccccgtca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