本发明涉及一种工程菌及其以廉价底物生产丹参素的应用，属于生物工程
技术领域：
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提取自丹参的丹参素，学名r-(+)-3-(3，4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸、d-(+)-β-(3，4-二羟基苯基)乳酸，英文名为：danshensu、d-dss、r-dss、(r)-(+)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)-lacticacid、(r)-(+)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoicacid，是一种右旋酚酸类化合物。目前不存在天然的左旋丹参素。丹参素是丹参水提液中的重要有效成份，国内于1980年从丹参水提液中得到并鉴定了结构(丹参水溶性有效成分的研究，ⅱ.d(+)β(3，4-二羟基苯基)乳酸的结构，上海第一医学院学报，1980，05(7)，384-385)，各种研究表明丹参素具有重要的药理药效作用，在心脑血管疾病的治疗等方面具有独特治疗作用。当前丹参素主要从丹参中提取得到(专利cn200810038853.9)。丹参素在丹参中的含量较低，并且丹参素种植成本高且产量有限，因此当前丹参素不仅价格高而且远远无法满足市场的需求。专利cn201310559498.0提出了一种构建大肠杆菌基因工程图利用葡萄糖发酵产丹参素的方法，由于合成代谢途径涉及利用羟基化酶，该酶很容易使代谢过程产物氧化而影响丹参素的产率，同时由于大肠杆菌发酵是高耗氧过程，也会氧化丹参素，因此当前该方法产率较低，成本将会高于植物提取过程。专利cn201210190171.6提出了水解丹酚酸b生产丹参素的方法，丹酚酸b需从丹参提取，并且化学水解过程有大量副反应，同样不适用于规模化生产。手性合成丹参素(专利cn201210420488.4)的催化剂极为昂贵，当前也仅停留在实验室水平。早在1988年roth等人提出了先以化学法处理左旋多巴得到对应的3，4-二羟基苯丙酮酸，再酶法合成s-(+)-3-(3，4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸(s-dss，l-dss)的方法(enzymaticsynthesisof(s)-(-)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)lacticacid，arch.pharm.(weinheim)321，179-180(1988))。z.findrik，等人采用蛇毒氨基酸氧化酶将左旋多巴转化成3，4-二羟基苯丙酮酸，然后再用d-乳酸脱氢酶还原生成d-(3，4-二羟基苯基)乳酸(modellingandoptimizationofthe(r)-(+)-3,4-dihydroxyphenyllacticacidproductioncatalyzedwithd-lactatedehydrogenasefromlactobacillusleishmanniiusinggeneticalgorithm，chem.biochem.eng.q.19(4)351–358(2005))。这两种方法制备3，4-二羟基苯丙酮酸中间体的成本较高，且操作复杂。技术实现要素：基于目前各种方法的缺陷，本发明提出了一种新型的丹参素的生产方法，并构建了多酶共表达的工程菌，实现了丹参素的高效生产。本发明所要解决的技术问题是提供一种能以廉价底物高效生产丹参素的重组菌，同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。本发明的第一个目的是提供能低成本生产光学纯丹参素的重组菌；所述重组菌同时表达4种酶，分别为酪氨酸酚裂解酶、l-氨基酸氧化酶、l-乳酸脱氢酶、α-羟基羧酸脱氢酶。在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶来自于erwiniaherbicolaatcc214344。在一种实施方式中，所述酪氨酸酚裂解酶的氨基酸序列是ncbi上accessionno为p31011.2。在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为d型α-羟基羧酸脱氢酶，来自lactobacillusplantarumatcc14917、enterococcusfaecalisatcc35038或者lactobacillusfermentumatcc14931。在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为l型α-羟基羧酸脱氢酶，来自bacilluscoagulansdsm1、weissellaconfusastraindsm20196或者lactobacillusfermentumatcc14931。在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为d-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.为wp_003643296.1、wp_002335374.1、或eei22188.1的序列；α-羟基羧酸脱氢酶为l-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_013858488.1、wp_003607654.1或wp_035430779.1的序列。在一种实施方式中，d-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno.为nz_gl379761region:complement(533562..534560)、nz_kb944641region:161892..162830、acgi01000078region:20793..21791的序列；l-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno.为nz_atum01000014region:39316..40254、nz_jqay01000006region:69708..70640、nz_gg669901region:45517..46470的序列。在一种实施方式中，所述l-乳酸脱氢酶来自lactococcuslactisatcc19257。在一种实施方式中，所述l-乳酸脱氢酶的氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_003131075.1序列。在一种实施方式中，所述l-乳酸脱氢酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno为：nz_jxjz01000017region:18532..19509的序列。在一种实施方式中，所述l-氨基酸氧化酶为的来自proteusmirabilisatcc29906、cosenzaeamyxofaciensatcc19692、morganellamorganiiatcc49993、providenciarettgeridsm1131或ignatzschinerialarvaedsm13226中的不产过氧化氢的l-氨基酸氧化酶。在一种实施方式中，l-氨基酸氧化酶的氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_004244224.1、oat30925.1、efe55026.1、wp_036414800.1或wp_026879504.1的序列。在一种实施方式中，l-氨基酸氧化酶的核苷酸序列如序列表中的：nz_gg668576region:1350390..1351805、lxen01000066region:20563..21963、acci02000030region:21025..22443、nz_lagc01000006region:309569..310993、nz_ki783332region:35799..37217。在一种实施方式中，所述重组菌，包括将编码酪氨酸酚裂解酶、l-氨基酸氧化酶、α-羟基羧酸脱氢酶和l-乳酸脱氢的酶的基因，连接到2个质粒上，然后将重组质粒转化宿主大肠杆菌，得到重组工程菌。在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶基因和l-乳酸脱氢酶基因是连接到质粒petduet-1后表达、l-氨基酸氧化酶和酪氨酸酚裂解酶基因是连接到质粒pacycdue-1后表达。在一种实施方式中，所述宿主菌为escherichiacolibl21(de3)。在一种实施方式中，所述重组菌还敲除了酚类物质分解基因。在一种实施方式中，所述敲除的酚类物质分解基因为hpad、mhpb中的任意一种或者两种组合。在一种实施方式中，所述酚类物质分解基因的核苷酸序列是ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(4505585..4506436)和nc_012892region:339806..340750。在一种实施方式中，所述重组菌还强化表达了乳酸转运基因、邻苯二酚转运基因、辅酶合成相关基因中的任意一种或多种。在一种实施方式中，所述强化表达是通过将escherichiacolibl21(de3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。在一种实施方式中，所述强化表达的基因为lldp(乳酸转运基因)、hpax(邻苯二酚转运基因)、mhpt(邻苯二酚转运基因)、nada(nad合成基因)、pdxj(磷酸吡多醛合成基因)、ribf(fad合成基因)中的任意一种或多种。在一种实施方式中，所述lldp在ncbi上accessionno为：nc_012892region:3646638..3648293；hpax为；nc_012892region:complement(4502025..4503401)；mhpt为nc_012892region:344788..345999；nada为nc_012892region:740487..741530；pdxj为nc_012892region:complement(2567591..2568322)；ribf为nc_012892region:25479..26420。在一种实施方式中，所述重组菌是在敲除了hpad和mhpb的大肠杆菌宿主的基础上，强化表达了lldp、hpax、mhpt、nada、pdxj和ribf，并且同时表达了酪氨酸酚裂解酶、l-氨基酸氧化酶、l-乳酸脱氢酶和α-羟基羧酸脱氢酶。本发明的第二个目的是提供一种生产丹参素的方法，所述方法是利用本发明的重组菌。在一种实施方式中，所述生产丹参素，是进行全细胞转化生产。在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，细胞湿重为1-200g/l，邻苯二酚浓度为1-200g/l，l-乳酸浓度为1-200g/l，ph6.0-9.0，氨根离子浓度1-30g/l；于15-40℃反应，时间1-48小时。转化结束后液相色谱测定丹参素产量及构型。本发明的第三个目的是提供本发明重组菌或者本发明方法在化工、食品、医药等领域的应用。本发明的有益效果：本发明构建了一种新型的四酶共表达基因工程菌，该菌可应用于光学纯丹参素的生产。本发明选择的(d/l)-α-羟基羧酸脱氢酶均具有底物专一性差，光学专一性强的特点，可生产光学纯的d-丹参素和l-丹参素。该生产过程简单且原料易得，具有良好的工业化应用前景。具体实施方案本发明的工程菌的功能核心在于可以同时表达4种酶，分别为酪氨酸酚裂解酶、l-氨基酸氧化酶、α-羟基羧酸脱氢酶和l-乳酸脱氢酶。其原理为：在工程菌全细胞内，l-乳酸脱氢酶以菌体内的nad为辅酶将l-乳酸脱氢生成丙酮酸和nadh；酪氨酸酚裂解酶催化丙酮酸、氨根离子、邻苯二酚生成左旋多巴；左旋多巴则被l-氨基酸氧化酶脱氨生成3,4-二羟基苯丙酮酸；α-羟基羧酸脱氢酶利用乳酸脱氢过程生成的nadh将3,4-二羟基苯丙酮酸还原成丹参素、同时实现了辅酶nad的再生。同时敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：1.本发明所涉及的菌株及质粒购自美国菌种保藏中心atcc的lactobacillusplantarumatcc14917、enterococcusfaecalisatcc35038、lactobacillusfermentumatcc14931、escherichiacolibl21(de3)、proteusmirabilisatcc29906、cosenzaeamyxofaciensatcc19692、morganellamorganiiatcc49993、lactococcuslactisatcc19257、erwiniaherbicolaatcc214344、aeromonasphenologenesatcc7966。购自德国微生物菌种保藏中心dsmz的weissellaconfusastraindsm20196、providenciarettgeridsm1131、ignatzschinerialarvaedsm13226。购自novagen公司的petduet-1、pacycdue-1、pcoladuet-1、prsfduet-1质粒和escherichiacolibl21(de3)。pcasred、pcrispr-gdna购自镇江爱必梦生物科技有限公司。2.大肠杆菌中相关基因的敲除及组成型强化表达(1)大肠杆菌酚类物质分解基因的敲除本发明中的酚类物质都极易被大肠杆菌中的酶分解，根据文献(biodegradationofaromaticcompoundsbyescherichiacoli，microbiolmolbiolrev.2001,65(4):523–569.)，将相关基因敲除，避免产物和底物的分解。选择的基因是hpad和mhpb,ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(4505585..4506436)和nc_012892region:339806..340750。(2)大肠杆菌乳酸、邻苯二酚转运基因的组成型强化表达在全细胞转化过程中，需把底物转运至细胞内才能进行，增强乳酸转运蛋白有助于快速并长时间维持胞内底物的高浓度，有利于反应的进行。选择乳酸转运相关的基因是lldp，ncbi上accessionno为：nc_012892region:3646638..3648293。邻苯二酚转运相关的基因是hpax和mhpt，ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(4502025..4503401)和nc_012892region:344788..345999。(3)大肠杆菌辅酶合成相关重要基因的组成型强化表达在α-羟基羧酸脱氢酶还原过程中需要以nadh为辅酶，强化表达大肠杆菌nad合成途径的关键酶，可以提高菌体内的nad水平，从而有利于丹参素的生成。选择的基因有nada。ncbi上accessionno为：nc_012892region:740487..741530。磷酸吡多醛(胺)是酪氨酸酚裂解酶的辅酶，过表达该辅酶途径中的核心基因pdxj,有利于左旋多巴的合成。ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(2567591..2568322)。fad是l-氨基酸氧化酶的辅酶，过表达该辅酶途径中的重要基因ribf，有利于强化l-氨基酸氧化酶活性。ncbi上accessionno为：nc_012892region:25479..26420。3.四酶偶联催化反应中酶的选择(1)l-乳酸脱氢酶的选择l-乳酸是最为廉价的有机酸，脱氢后成的丙酮酸具有较高的附加值。目前主要以l-乳酸氧化酶氧化l-乳酸生产丙酮酸，在此过程中l-乳酸上脱下的氢被浪费了。也有以酵母发酵生产酮酸的方法。l-乳酸脱氢酶广泛存在多种微生物中，以l-乳酸为底物将l-乳酸上生成的氢传递给辅酶nad或nadp，从而生成nadh或nadph。nadh或者nadph可以作为前述的α-羟基酸脱氢酶的供氢体。通常来讲以nad(nadp)为辅酶的乳酸脱氢酶更趋向于以丙酮酸为底物合成乳酸，但当乳酸过量等情况下乳酸脱氢酶会脱掉乳酸的氢生成丙酮酸。本发明从lactococcuslactisatcc19257中得到l-乳酸脱氢酶基因llldh(氨基酸序列是wp_003131075.1)。(2)酪氨酸酚裂解酶的选择酪氨酸酚裂解酶(tyrosinephenollyase,tpl,e.c.4.1.99.2)，又名β-酪氨酸酶，酪氨酸酚裂解酶可以催化l-酪氨酸发生β-消去反应生成苯酚、丙酮酸和氨，也可催化多巴发生β-消去反应生成邻苯二酚、丙酮酸和氨。该反应是可逆的，邻苯二酚、丙酮酸和氨可在酪氨酸酚裂解酶催化下生成l-多巴。本发明从erwiniaherbicolaatcc214344中分别克隆得到酪氨酸酚裂解酶基因ehtpl，其氨基酸序列是p31011.2。(3)l-氨基酸氧化酶的选择l-氨基酸氧化酶广泛存在于细菌、真菌、哺乳动物细胞、蛇毒、昆虫毒素及藻类中(l-aminoacidoxidaseasbiocatalyst:adreamtoofar.appl.microbiol.biotechnol.2013,97:9323-41)。l-氨基酸氧化酶将α氨基和cα上的氢转移到fad上，绝大部份利用分子氧直接氧化还原型fad，再生氧化型fad，同时生成过氧化氢。例如poljanac等采用东部菱背响尾蛇毒l-氨基酸氧化酶氧化多巴生成3,4-二羟基苯丙酮酸，然后再加乳酸脱氢酶和甲酸脱氢酶生成成3,4-二羟基苯乳酸，在此过程中另外必须添加过氧化氢酶以消除过氧化氢的毒性(modellingandoptimizationofthe(r)-(+)-3,4-dihydroxyphenyllacticacidproductioncatalyzed,chem.biochem.eng.q.2005,19(4)351–358)。另外还有一类l-氨基酸氧化酶与细胞膜上电子传递链相关，电子经过呼吸链传递给细胞色素氧化酶，使分子氧还原为水，从而不生成过氧化氢，这种酶类主要存在于变形杆菌属(proteussp.)、普罗威登菌属(providenciasp.)、摩根菌属(morganellasp.)等细菌中(crystalstructureofamembrane-boundl-aminoaciddeaminasefromproteusvulgaris.j.struct.biol.2016,195:306-15)。本发明选择了5种不产过氧化氢的l-氨基酸氧化酶，从proteusmirabilisatcc29906、cosenzaeamyxofaciensatcc19692、providenciarettgeridsm1131、morganellamorganiiatcc49993、ignatzschinerialarvaedsm13226中分别克隆得到l-氨基酸氧化酶基因pmaao、cmaao、praao、mmaao、ilaao，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.为wp_004244224.1、oat30925.1、efe55026.1、wp_036414800.1或wp_026879504.1的序列，这些酶都具有底物广泛和活性强的特点。(4)α-羟基羧酸脱氢酶的选择根据最适底物的情况，α-羟基羧酸脱氢酶包含有乳酸脱氢酶、α-羟酸异己酸脱氢酶、扁桃酸脱氢酶、乙醛酸还原酶等，这些酶能广泛作用于多种底物生成α-羟基羧酸，通常根据其最适作用的底物来命名。本发明从中选择光学性强且对3，4-二羟基苯丙酮酸具有较强活性的酶，用于d或l丹参素的生产。从lactobacillusplantarumatcc14917、enterococcusfaecalisatcc35038、lactobacillusfermentumatcc14931中分别克隆得到d型α-羟基羧酸脱氢酶基因lpldhd、efmdhd、lfldhd，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.为wp_003643296.1、wp_002335374.1、eei22188.1的序列。从bacilluscoagulansdsm1、weissellaconfusastraindsm20196、lactobacillusfermentumatcc14931中分别克隆得到l型α-羟基羧酸脱氢酶基因bcldhl、wcldhl、lfldhl，其氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_013858488.1、wp_003607654.1、wp_035430779.1的序列。4.共表达体系的构建及细胞的培养将以上选择的l-氨基酸氧化酶、(d/l)-α-羟基羧酸脱氢酶、酪氨酸酚裂解酶中每任选一个与l-乳酸脱氢酶进行四酶组合共表达。目前大肠杆菌多基因共表达的有多种方法(大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122)，本发明采用刘向磊(合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇，2016，上海医药工业研究院，博士论文)所述方法构建，每个基因前均包含t7启动子和rbs结合点，理论上来讲因为每个基因前都有t7和rbs，因此基因的表达强度受排列次序的影响不大。采用pacycdue-1和petduet-1两种质粒，每个质粒上包含两个基因，将构建好的质粒同时热转导入大肠杆菌感受态细胞中，并涂布于双抗(kan与cm)的固体平板上，筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。细胞的培养：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到lb发酵培养基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l)中，当细胞od600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mm的iptg，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。4.全细胞转化生产光学纯丹参素细胞转化生产的体系为：细胞湿重为1-200g/l，邻苯二酚浓度为1-200g/l，l-乳酸浓度为1-200g/l，ph6.0-9.0，氨根离子浓度1-30g/l；于15-40℃反应，时间1-48小时。转化结束后液相色谱测定丹参素产量及构型。5.样品的检测分析丹参素的定量分析：转化液采用perkinelmerseries200高效液相色谱仪检测分析，配紫外检测器。色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦megresc18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温30℃、进样量20μl、检测波长280nm。手性分析：perkinelmerseries200高效液相色谱仪检测分析，配示紫外检测器，chiralcelod-h手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷:异丙醇:三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5ml/min，柱温25℃，进样量20μl，检测波长280nm。丹参素溶解度较低，转化过程如有结晶析出，则稀释后测定。丹参素的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价。当生产r-丹参素时，对映体过量值％e.e＝[(sr-ss)/(sr+ss)×100％]当生产s-丹参素时，对映体过量值％e.e＝[(ss-sr)/(sr+ss)×100％]式中ss为转化液中s-丹参素的峰面积，sr为转化液中r-丹参素的液相色谱峰面积。为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1根据文献largescalevalidationofanefficientcrispr/cas-basedmultigeneeditingprotocolinescherichiacoli.microbialcellfactories,2017,16(1):68所述的方法将escherichiacolibl21(de3)上的hpad和mhpb进行单或双敲除。其中，本发明所用基因敲除的质粒为pcasred与pcrispr-gdna(hpadsgrna)与同源臂(hpaddonor)一起导入escherichiacolibl21(de3)上，cas9/sgrna诱发宿主在hpad基因位点发生双链断裂，重组酶red将hpaddonor整合到hpad基因上，实现基因的敲除，并测序验证。hpadsgrna、hpaddonor、mhpbsgrna、mhpbdonor分别如序列表seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13所示。mhpb以同样的方式敲除。配置ph为8的溶液，邻苯二酚或d-丹参素2g/l，湿菌体量100g/l，35℃放置10小时后测定浓度。表1中显示了反应体系中，邻苯二酚和d-丹参素的剩余量。表1不同菌株对底物和产物分解后的剩余浓度邻苯二酚g/ld-丹参素g/lescherichiacolibl21(de3)0.70.7escherichiacolibl21(δhpadδmhpb,de3)1.81.9escherichiacolibl21(δhpad,de3)1.31.6escherichiacolibl21(δmhpb,de3)1.41.3很显然escherichiacolibl21(δhpadδmhpb,de3)效果最好，将之命名为escherichiacolihm。实施例2α-羟基羧酸脱氢酶酶学性质的比较。通常这种酶类也可能具有还原丙酮酸生成乳酸的能力，因此不能还原或极微弱还原丙酮酸的酶是比较好的。以丙酮酸为底物，比较了不同酶的还原能力，根据文献(粘质沙雷氏菌h3010发酵型d-乳酸脱氢酶基因的克隆表达、纯化及酶学性质研究.工业微生物,2012,42(04):30-37.)所述的方法测定以nad为辅酶还原丙酮酸的活性，实验结果如表1所示。诱导表达方法：将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到lb发酵培养基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l)中，当细胞od600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mm的iptg，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。表2各种α-羟基羧酸脱氢酶还原丙酮酸活性比较重组菌活性u/mlescherichiacolihm/petduet-1-lpldhd6.6escherichiacolihm/petduet-1-efmdhd0escherichiacolihm/petduet-1-lfldhd0.7escherichiacolihm/petduet-1-bcldhl5.2escherichiacolihm/petduet-1-wcldhl0.2escherichiacolihm/petduet-1-lfldhl6.3实施例3重组大肠杆菌构建：首先将编码酪氨酸酚裂解酶、l-氨基酸氧化酶、α-羟基羧酸脱氢酶和l-乳酸脱氢酶的基因，分别连接到petduet-1或pacycduet-1质粒上。得到两种双基因共表达重组质粒，将两种质粒转化大肠杆菌escherichiacolihm，利用氯霉素和氨苄青霉素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。将重组大肠杆菌诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，细胞湿重为20g/l，邻苯二酚浓度为10g/l，l-乳酸浓度为10g/l，ph8.0，氨根离子浓度30g/l；于35℃反应，时间12小时。转化结束后液相色谱测定丹参素产量及构型。表3各种重组菌的比较实施例4采用文献largescalevalidationofanefficientcrispr/cas-basedmultigeneeditingprotocolinescherichiacoli.microbialcellfactories,2017,16(1):68所述的方法，将escherichiacolihm基因组上对应基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpda)前的中等表达强度组成型启动子(pg)，序列如seqidno:9所示。强化基因lldp表达时，以escherichiacolihm基因组为模板，以引物lldp-ff/lldp-fr、lldp-gpda-f/lldp-gpda-r、lldp-rf/lldp-rr,扩增出上游、启动子、下游序列，并以lldp-ff和lldp-rr为引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含lldpsgrna)一起转入escherichiacolihm后，cas9/sgrna诱发宿主在lldp基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到lldp基因之前，并测序验证。强化基因hpax表达时，采用类似强化基因lldp表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含hpaxsgrna)一起转入escherichiacolihm后，cas9/sgrna诱发宿主在hpax基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到hpax基因之前，并测序验证强化基因mhpt表达时，采用类似强化基因lldp表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含mhptsgrna)一起转入escherichiacolihm后，cas9/sgrna诱发宿主在mhpt基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到mhpt之前，并测序验证下表为引物名称与序列表序号的对应索引。表4引物名称与序列表序号对照名称序列表中编号lldpsgrnaseqidno:1hpaxsgrnaseqidno:14mhptsgrnaseqidno:15lldp-ffseqidno:3lldp-frseqidno:4lldp-gpda-fseqidno:5lldp-gpda-rseqidno:6lldp-rfseqidno:7lldp-rrseqidno:8根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表5所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重10g/l，l-乳酸200g/l，邻苯二酚10g/l，ph8.0，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间12小时。表5转化结果比较将效果最好的escherichiacolihm(pg-lldp,pg-hpax,pg-mhpt)命名为escherichiacolihmlhm。实施例5根据实施例4的方法将escherichiacolihmlhm中nada、pdxj、ribf基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpda)前的中等表达强度组成型启动子(pg)，序列如seqidno:9所示。然后再将质粒导入。强化基因nada表达时，采用实施例4中类似强化基因lldp表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含nada-grna)一起转入escherichiacolihmlhm后，cas9/sgrna诱发宿主在nada基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到nada基因之前，并测序验证强化基因pdxj表达时，采用实施例4中类似强化基因lldp表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含pdxj-grna)一起转入escherichiacolihmlhm后，cas9/sgrna诱发宿主在pdxj基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到pdxj基因之前，并测序验证强化基因ribf表达时，采用实施例4中类似强化基因lldp表达的方法，先扩增出上游、启动子、下游序列，并设计引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含pdxj-grna)一起转入escherichiacolihmlhm后，cas9/sgrna诱发宿主在ribf基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到ribf基因之前，并测序验证下表为引物名称与序列表序号的对应索引。表6引物名称与序列表序号对照名称序列表中编号ribfsgrnaseqidno:17nadasgrnaseqidno:2pdxjsgrnaseqidno:16基因改造完成后，将共表达质粒导入。根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表7所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重为20g/l，l-乳酸200g/l，邻苯二酚200g/l，ph9.0，温度为30℃，摇床转速250转/分钟；转化时间24小时。表7转化结果比较将最好的escherichiacolihmlhm(pg-nada,pg-ribf,pg-pdxj)命名为escherichiacolinpr。实施例6根据实施例2所述诱导表达方法，将escherichiacolinpr/petduet-1-wcldhl-llldh+pacycduet-1-cmaao-ehtpl诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重1g/l，l-乳酸1g/l，邻苯二酚1g/l，ph6.0，温度为15℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1小时。测定结果，s-丹参素浓度为78mg/l。实施例7根据实施例2所述诱导表达方法，将表7中菌株诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重200g/l，l-乳酸200g/l，邻苯二酚200g/l，ph8.5，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间48小时。将沉淀全部稀释溶解后测定结果。表8转化结果比较以上所述的酶及其共表达基因工程菌的改造和构建、菌体的培养基组成及培养方法和全细胞生物转化仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，理论上来讲其它的细菌、丝状真菌、放线菌、动物细胞均可进行基因组的改造，并用于多基因共表达的全细胞催化。凡在本发明的原则和精神之内所作的任何修改、等同替换。序列表<110>江南大学<120>一种工程菌及其以廉价底物生产丹参素的应用<130>2018.3.15<160>17<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gattgccaccgtccacgagg20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2ttaacggcgtcggcttcggg20<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列<400>3aaatacaatctctgtaggttcttct25<210>4<211>50<212>dna<213>人工序列<400>4tcggccactcatcaacatgattcatgagtctgttgctcatctccttgtca50<210>5<211>50<212>dna<213>人工序列<400>5tgacaaggagatgagcaacagactcatgaatcatgttgatgagtggccga50<210>6<211>50<212>dna<213>人工序列<400>6cgtagttttgttgccagagattcatggttttctcctgtcaggaacgttcg50<210>7<211>50<212>dna<213>人工序列<400>7cgaacgttcctgacaggagaaaaccatgaatctctggcaacaaaactacg50<210>8<211>25<212>dna<213>人工序列<400>8taacacctgacccgcagtgtaaccg25<210>9<211>1100<212>dna<213>escherichiacolibl21(de3)<400>9atgaatcatgttgatgagtggccgatcgctacgtgggaagaaaccacgaaactccattgc60gcaatacgctgcgataaccagtaaaaagaccagccagtgaatgctgatttgtaaccttga120atatttattttccataacatttcctgctttaacataattttccgttaacataacgggctt180ttctcaaaatttcattaaatattgttcacccgttttcaggtaatgactccaacttattga240tagtgttttatgttcagataatgcccgatgactttgtcatgcagctccaccgattttgag300aacgacagcgacttccgtcccagccgtgccaggtgctgcctcagattcaggttatgccgc360tcaattcgctgcgtatatcgcttgctgattacgtgcagctttcccttcaggcgggattca420tacagcggccagccatccgtcatccatatcaccacgtcaaagggtgacagcaggctcata480agacgccccagcgtcgccatagtgcgttcaccgaatacgtgcgcaacaaccgtcttccgg540agcctgtcatacgcgtaaaacagccagcgctggcgcgatttagccccgacatagccccac600tgttcgtccatttccgcgcagacgatgacgtcactgcccggctgtatgcgcgaggttacc660gactgcggcctgagttttttaagtgacgtaaaatcgtgttgaggccaacgcccataatgc720gggcagttgcccggcatccaacgccattcatggccatatcaatgattttctggtgcgtac780cgggttgagaagcggtgtaagtgaactgcagttgccatgttttacggcagtgagagcaga840gatagcgctgatgtccggcggtgcttttgccgttacgcaccaccccgtcagtagctgaac900aggagggacagctgatagaaacagaagccactggagcacctcaaaaacaccatcatacac960taaatcagtaagttggcagcatcaccccgttttcagtacgttacgtttcactgtgagaat1020ggagattgcccatcccgccatcctggtctaagcctggaaaggatcaattttcatccgaac1080gttcctgacaggagaaaacc1100<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10tatgcccgtcgatcgcgccc20<210>11<211>120<212>dna<213>人工序列<400>11ccaagatcacgcacgtaccgtcgatgtatctctctgaactgccagggaaaaaccacggtt60agatcagcaagcgttgccgggaaatgggcgtcgataccattatcgttttcgacacccact120<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12tcatcgagtacctcttgcgc20<210>13<211>120<212>dna<213>人工序列<400>13tagcctgatatgcacgcttatcttcactgtctttcccactcgccgctggtgggatatgtc60aatggcgtgattgccagcgcccgcgagcgtattgcggctttctcccctgaactggtggtg120<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14cgaacagaaagacgatcagg20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<400>15gcgggatgaagatgatgaag20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<400>16cgtcgcggtcagtaatgtga20<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列<400>17cagcacacacccttcttgcg20当前第1页12