本发明涉及一种产他克莫司的链霉菌高效发酵培养基及其应用。
【背景技术】
他克莫司(tacrolimus，fk506)是由链霉菌发酵产生的一种含哌可酰基的23元大环内酯类化合物，具有免疫抑制药效强、用药剂量低、急性排异反应发生率低等优点，在器官移植和自身免疫系统疾病方面疗效显著。目前不仅是肝脏及肾脏移植后排斥反应的一线药物，还广泛应用于斑秃、牛皮癣、银屑病、鱼鳞病、白塞氏病、变硬性皮炎、类风湿性关节炎及多发性硬化病等自身免疫疾病的治疗,具有广阔的应用前景。自从1984年首次发现他克莫司被以来，国内外对其进行了大量的基础及临床研究，1998年进入中国市场后，市场份额迅速上升。目前国内他克莫司市场上，进口原研药仍然占据80％左右的市场。国内微生物发酵法生产他克莫司的技术瓶颈主要是其产率低，生产成本高，给患者带来较大的负担。
申请号为201310644714.1的中国专利公开了一种发酵生产他克莫司的方法，最终的链霉菌产他克莫司为385μg/ml，且需中间补料，工艺繁琐。申请号为200810019003.4的中国专利公开了一种链霉菌及其应用，其公开的最高发酵单位为550μg/ml。申请号为201210447477.5的中国专利公开了一种高纯度他克莫司的制备方法，其公开的最高发酵单位为491μg/ml，但未提及发酵工艺。申请号为201710309551.x的中国专利公开了一种提高他克莫司产量的发酵方法，其在常规的他克莫司发酵过程中加入吸附树脂以及流加补充糊精，发酵170h后他克莫司含量可达1248mg/l；虽发酵水平较高，但发酵周期过长，生产产本仍较高。申请号为201611065060.7的中国专利公开了一种发酵生产他克莫司发酵的方法，其在发酵罐发酵过程中采用分批发酵的方式进行发酵培养，并在发酵的不同阶段向发酵培养基中添加有机溶剂及盐溶液；相对于传统的发酵法制备他克莫司，该发明能够提高他克莫司的产量约20～40％，且发酵周期缩短至90h；但该发明并未给出具体发酵水平。申请号为201610135737.3的中国专利公开了一种筑波链霉菌及其在制备他克莫司中的应用，主要是一种由筑波链霉菌hdw68发酵制备他克莫司中间体的方法，该发明提供的发酵工艺经1吨、4吨、20吨发酵罐的生产实践，证明其生产能力可达1100mg/l，且发酵副产物(fk520)约1.5％左右，该发明生产水平较高且副产物低，但发酵周期(6～7天)仍较长，且培养基复杂。申请号为201510664099.x的中国专利公开了一种基因工程菌株筑波链霉菌l21及其应用，其通过基因工程提高他克莫司生物合成途径中的特异性调控基因的拷贝数，作为基因改造他克莫司生物合成途径中的限速酶以提高他克莫司的产量，将他克莫司的发酵单位提高至945mg/l，但基因工程菌株的稳定性有待进一步验证，该发明未详细给出进一步说明。
综上所述，近年来国内开展大量的研究工作用于降低他克莫司的生产成本。效果显著，但与国外仍存在差距，导致目前国内的他克莫司市场还是由美日等国家主导。目前在链霉素高产他克莫司的发酵培养基中添加表面活性剂的研究未见报道，本发明从他克莫司的发酵工艺入手，通过培养基中添加表面活性剂优化培养基组成，罐上参数控制，提高发酵水平，缩短发酵周期，从而降低生产成本，提高综合竞争能力。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题之一，在于提供一种产他克莫司的链霉菌高效发酵培养基，其能够消除代谢产物他克莫司堆积对菌体生长的影响，提高他克莫司的产率，同时操作简单，便于大规模工业生产，降低生产成本。
本发明是这样实现上述技术问题之一的：
一种产他克莫司的链霉菌高效发酵培养基，所述发酵培养基中组分如下：碳源，有机氮源，无机盐和表面活性剂。
进一步地，所述发酵培养基中的各组分含量如下：碳源40-130g/l，有机氮源22-55g/l和无机盐2-10g/l，表面活性剂5-100g/l。
进一步地，所述碳源为淀粉、糊精、甘油、葡萄糖中的至少一种。
进一步地，所述有机氮源为豆粕粉、黄豆粉、酵母粉、玉米浆干粉、蛋白胨中的至少一种。
进一步地，所述无机盐为硫酸铵、氯化镁、硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钙中的至少一种。
进一步地，所述表面活性剂是非离子表面活性剂。
进一步地，所述非离子表面活性剂为tween80、tween60、peg系列或tritonx-100中的一种。
本发明要解决的技术问题之二，在于提供一种链霉菌发酵高产他克莫司的方法，其能够消除代谢产物他克莫司堆积对菌体生长的影响，提高他克莫司的产率，同时操作简单，便于大规模工业生产，降低生产成本。
本发明是这样实现上述技术问题之二的：
一种链霉菌发酵高产他克莫司的方法，所述方法中的培养基是基于上述一种产他克莫司的链霉菌高效发酵培养基中所述的培养基；
所述方法步骤如下：将产他克莫司的链霉菌经斜面活化和种子培养后，按0.2-1.0％接种量移种至种子罐种子培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.3～1.0(v/v)，搅拌速度200～250r/min，温度28℃下繁殖培养36-48小时，按5-20％移种量将生长良好的种子移入发酵罐发酵培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.5～1.5(v/v)，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为120～180r/min，24小时后搅拌速度控制在200～300r/min，25℃～29℃下发酵，发酵结束后获得代谢产物他克莫司。
本发明具有如下优点：
本发明通过对他克莫司产生菌链霉菌的发酵培养基进行改良，添加表面活性剂到发酵培养基中，改善细胞的通透性，有利于产物的分泌和营养物的运输，减少产物的反馈抑制，为微生物提供有利的生长环境，促进发酵产物产量的提高，消除代谢产物他克莫司堆积对菌体生长的影响，使得发酵培养基更加适合菌体生长，显著提高他克莫司的产量，本发明工艺操作简单，便于大规模工业生产，降低生产成本。
【具体实施方式】
本发明涉及一种产他克莫司的链霉菌高效发酵培养基，所述发酵培养基中各组分及其含量如下：碳源40-130g/l，有机氮源22-55g/l和无机盐2-10g/l，表面活性剂5-100g/l。
所述有机氮源为豆粕粉、黄豆粉、酵母粉、玉米浆干粉以及蛋白胨中的至少一种。
所述碳源为淀粉、糊精、甘油、葡萄糖中的至少一种。
所述无机盐为硫酸铵、氯化镁、硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钙中的至少一种。
所述表面活性剂是非离子表面活性剂。
所述非离子表面活性剂为tween80、tween60、peg系列或tritonx-100中的一种。
本发明还涉及一种链霉菌发酵高产他克莫司的方法，所述方法中的培养基是基于上述一种产他克莫司的链霉菌高效发酵培养基中所述的培养基；
所述方法步骤如下：将产他克莫司的链霉菌经斜面活化和种子培养后，按0.2-1.0％接种量移种至种子罐种子培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.3～1.0(v/v)，搅拌速度200～250r/min，温度28℃±1℃下繁殖培养36-48小时，按5-20％移种量将生长良好的种子移入发酵罐发酵培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.5～1.5(v/v)，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为120～180r/min，24小时后搅拌速度控制在200～300r/min，28℃±1℃下发酵，发酵结束后获得代谢产物他克莫司。
所述链霉菌菌株为本领域已知可用于生产他克莫司的链霉菌菌株，可市购或者从菌种库购买获得。
以下结合具体实施例对本发明作进一步地说明。
为验证本发明中利用添加表面活性剂提高他克莫司产量的发酵生产有益影响。将产他克莫司链霉菌经斜面活化和种子培养后，进行二级发酵生产他克莫司，测定发酵液中他克莫司效价。
实施例一
利用添加表面活性剂提高他克莫司产量的发酵工艺方法，是由产他克莫司的链霉菌做为出发菌株，经过常规的纯种扩大培养，然后二级发酵生产他克莫司。常规的纯种扩大培养一般包括砂土孢子制备工序、母瓶斜面孢子制备工序、子瓶斜面孢子制备工序、种子制备工序。
砂土孢子制备工序的步骤为：取河沙加入10％稀盐酸，加热煮沸30分钟，倒去酸水，用自来水冲洗至中性，烘干过40目筛。另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干碾碎，过100目筛。砂和土以3:1的比例混合均匀，装入10×100mm的小试管中，每管装1g左右，塞上棉塞，灭菌烘干。将他克莫司产生菌的斜面孢子在无菌条件下接入合格的砂土管中，标识菌株名称及保藏日期，置于放有干燥剂的容器中，盖紧密封，于4℃冰箱冷藏保存。
母瓶孢子斜面制备工序的步骤为：在无菌条件下从砂土管中挑取适量砂土接于母瓶斜面培养基上，标识后，放于温度28±1℃的恒温室培养8-12天，得母瓶孢子斜面，成熟后放于4℃冰箱冷藏备用。
子瓶孢子斜面制备工序的步骤为：在无菌条件下用接种铲从母瓶孢子菌种斜面上刮取一定量孢子，划线接至子瓶孢子斜面培养基上，同时做露碟和肉汤无试检查，接好的斜面标识后放于温度28±1℃恒温室培养8-12天，成熟后放于4℃冰箱冷藏备用。
子瓶孢子液制备工序的步骤为：选取生长合格的1个子瓶孢子斜面，在无菌条件下用接种铲将子瓶孢子斜面上的菌层刮下碾散后各加入20ml无菌水，搅拌均匀后过滤得到子瓶孢子液，标识后放于4℃冰箱保存。
种子制备工序的步骤为：在无菌条件下，将合格的子瓶孢子液按0.5％接种量以火焰法移种到20l种子罐种子培养基中，温度控制在28℃，罐压控制在0.04±0.01mpa，通气量1:0.8(v/v)，搅拌转速200r/min条件下进行培养，培养时间40小时，种子生长良好可移入发酵罐。
发酵制备工序中发酵工艺如下：将发酵培养基灭菌，灭菌完成后温度降至28～30℃时，将培养好的一级种子按5％接种量移入100l发酵罐发酵培养基中，移种后发酵生产采取变速发酵，接种后培养温度控制27～29℃，罐压控制在0.03～0.05mpa，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(v/v)；24小时后搅拌速度控制在200～220r/min，通气量1:1～1.5(v/v)，发酵周期140小时，发酵结束后检测发酵液效价。
所述发酵培养基组成如下：淀粉80g/l，葡萄糖25g/l，黄豆粉35g/l，蛋白胨10g/l，碳酸钙6g/l，表面活性剂为tween80含量为5g/l。
实施例二
子瓶孢子液的制备同实施例一。
将他克莫司产生菌链霉菌经斜面活化和种子培养后，按0.5％接种量移种至20l种子罐种子培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.3～1.0(v/v)，搅拌速度200r/min，温度28℃下繁殖培养40小时，按5％移种量将生长良好的种子移入100l发酵罐发酵培养基中，罐压0.04±0.01mpa，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(v/v)，24小时后搅拌速度控制在200～220r/min，通气量1:1～1.5(v/v)，27℃～29℃下发酵140h，发酵结束后获得代谢产物他克莫司。
所述发酵培养基组成如下：淀粉60g/l，葡萄糖25g/l，豆粕粉30g/l，蛋白胨8g/l，碳酸钙6g/l，表面活性剂为tween80含量为30g/l。
实施例三
子瓶孢子液的制备同实施例一。
将他克莫司产生菌链霉菌经斜面活化和种子培养后，按0.5％接种量移种至20l种子罐种子培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.3～1.0(v/v)，搅拌速度200r/min，温度28℃下繁殖培养40小时，按5％移种量将生长良好的种子移入100l发酵罐发酵培养基中，罐压0.04±0.01mpa，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(v/v)，24小时后搅拌速度控制在200～220r/min，通气量1:1～1.5(v/v)，27℃～29℃下发酵140h，发酵结束后获得代谢产物他克莫司。
所述发酵培养基组成如下：淀粉60g/l，葡萄糖25g/l，豆粕粉30g/l，蛋白胨8g/l，碳酸钙6g/l，表面活性剂tween80含量为35g/l。
实施例四
子瓶孢子液的制备同实施例一。
将他克莫司产生菌链霉菌经斜面活化和种子培养后，按0.5％接种量移种至20l种子罐种子培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.3～1.0(v/v)，搅拌速度200r/min，温度28℃下繁殖培养40小时，按5％移种量将生长良好的种子移入100l发酵罐发酵培养基中，罐压0.04±0.01mpa，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(v/v)，24小时后搅拌速度控制在200～220r/min，通气量1:1～1.5(v/v)，27℃～29℃下发酵140h，发酵结束后获得代谢产物他克莫司。
所述发酵培养基组成如下：淀粉60g/l，葡萄糖25g/l，豆粕粉30g/l，蛋白胨8g/l，碳酸钙6g/l，表面活性剂tween80含量为40g/l。
实施例五
子瓶孢子液的制备同实施例一。
将他克莫司产生菌链霉菌经斜面活化和种子培养后，按0.5％接种量移种至20l种子罐种子培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.3～1.0(v/v)，搅拌速度200r/min，温度28℃下繁殖培养40小时，按5％移种量将生长良好的种子移入100l发酵罐发酵培养基中，罐压0.04±0.01mpa，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(v/v)，24小时后搅拌速度控制在200～220r/min，通气量1:1～1.5(v/v)，27℃～29℃下发酵140h，发酵结束后获得代谢产物他克莫司。
所述发酵培养基组成如下：淀粉60g/l，葡萄糖25g/l，豆粕粉30g/l，蛋白胨8g/l，碳酸钙6g/l，表面活性剂tween80含量为45g/l。
实施例六
子瓶孢子液的制备同实施例一。
将他克莫司产生菌链霉菌经斜面活化和种子培养后，按0.5％接种量移种至20l种子罐种子培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.3～1.0(v/v)，搅拌速度200r/min，温度28℃下繁殖培养40小时，按5％移种量将生长良好的种子移入100l发酵罐发酵培养基中，罐压0.04±0.01mpa，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(v/v)，24小时后搅拌速度控制在200～220r/min，通气量1:1～1.5(v/v)，27℃～29℃下发酵140h，发酵结束后获得代谢产物他克莫司。
所述发酵培养基组成如下：淀粉60g/l，葡萄糖25g/l，豆粕粉30g/l，蛋白胨8g/l，碳酸钙6g/l，表面活性剂tween80含量为50g/l。
实施例七
子瓶孢子液的制备同实施例一。
将他克莫司产生菌链霉菌经斜面活化和种子培养后，按0.5％接种量移种至20l种子罐种子培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.3～1.0(v/v)，搅拌速度200r/min，温度28℃下繁殖培养40小时，按5％移种量将生长良好的种子移入100l发酵罐发酵培养基中，罐压0.04±0.01mpa，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(v/v)，24小时后搅拌速度控制在200～220r/min，通气量1:1～1.5(v/v)，27℃～29℃下发酵140h，发酵结束后获得代谢产物他克莫司。
所述发酵培养基组成如下：淀粉60g/l，葡萄糖25g/l，豆粕粉30g/l，蛋白胨8g/l，碳酸钙6g/l，表面活性剂tween80含量为55g/l。
实施例八
子瓶孢子液的制备同实施例一。
将他克莫司产生菌链霉菌经斜面活化和种子培养后，按0.5％接种量移种至20l种子罐种子培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.3～1.0(v/v)，搅拌速度200r/min，温度28℃下繁殖培养40小时，按5％移种量将生长良好的种子移入100l发酵罐发酵培养基中，罐压0.04±0.01mpa，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(v/v)，24小时后搅拌速度控制在200～230r/min，通气量1:1～1.5(v/v)，27℃～29℃下发酵140h，发酵结束后获得代谢产物他克莫司。
所述发酵培养基组成如下：糊精35g/l，葡萄糖15g/l，酵母粉40g/l，蛋白胨15g/l，碳酸钙6g/l，表面活性剂tween80含量为100g/l。
实施例九
子瓶孢子液的制备同实施例一。
将他克莫司产生菌链霉菌经斜面活化和种子培养后，按0.5％接种量移种至20l种子罐种子培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.3～1.0(v/v)，搅拌速度200r/min，温度28℃下繁殖培养40小时，按5％移种量将生长良好的种子移入100l发酵罐发酵培养基中，罐压0.04±0.01mpa，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(v/v)，24小时后搅拌速度控制在200～220r/min，通气量1:1～1.5(v/v)，27℃～29℃下发酵140h，发酵结束后获得代谢产物他克莫司。
所述发酵培养基组成如下：糊精65g/l，葡萄糖15g/l，豆粕粉30g/l，蛋白胨8g/l，碳酸钙6g/l，表面活性剂peg200含量为30g/l。
实施例十
子瓶孢子液的制备同实施例一。
将他克莫司产生菌链霉菌经斜面活化和种子培养后，按0.5％接种量移种至20l种子罐种子培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.3～1.0(v/v)，搅拌速度200r/min，温度28℃下繁殖培养40小时，按5％移种量将生长良好的种子移入100l发酵罐发酵培养基中，罐压0.04±0.01mpa，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(v/v)，24小时后搅拌速度控制在200～220r/min，通气量1:1～1.5(v/v)，27℃～29℃下发酵140h，发酵结束后获得代谢产物他克莫司。
所述发酵培养基组成如下：糊精65g/l，葡萄糖15g/l，豆粕粉30g/l，蛋白胨8g/l，碳酸钙6g/l，表面活性剂peg200含量为35g/l。
实施例十一
子瓶孢子液的制备同实施例一。
将他克莫司产生菌链霉菌经斜面活化和种子培养后，按0.5％接种量移种至20l种子罐种子培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.3～1.0(v/v)，搅拌速度200±20r/min，温度28℃下繁殖培养40小时，按5％移种量将生长良好的种子移入100l发酵罐发酵培养基中，罐压0.04±0.01mpa，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(v/v)，24小时后搅拌速度控制在200～220r/min，通气量1:1～1.5(v/v)，27℃～29℃下发酵140h，发酵结束后获得代谢产物他克莫司。
所述发酵培养基组成如下：糊精65g/l，葡萄糖15g/l，豆粕粉30g/l，蛋白胨8g/l，碳酸钙6g/l，表面活性剂peg200含量为40g/l。
实施例十二
子瓶孢子液的制备同实施例一。
将他克莫司产生菌链霉菌经斜面活化和种子培养后，按0.5％接种量移种至20l种子罐种子培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.3～1.0(v/v)，搅拌速度220r/min，温度28℃下繁殖培养40小时，按5％移种量将生长良好的种子移入100l发酵罐发酵培养基中，罐压0.04±0.01mpa，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(v/v)，24小时后搅拌速度控制在200～250r/min，通气量1:1～1.5(v/v)，27℃～29℃下发酵140h，发酵结束后获得代谢产物他克莫司。
所述发酵培养基组成如下：糊精35g/l，葡萄糖5g/l，酵母粉40g/l，蛋白胨10g/l，碳酸钙6g/l，表面活性剂peg200含量为100g/l。
实施例十三
子瓶孢子液的制备同实施例一。
将他克莫司产生菌链霉菌经斜面活化和种子培养后，按0.5％接种量移种至20l种子罐种子培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.3～1.0(v/v)，搅拌速度220r/min，温度28℃下繁殖培养40小时，按5％移种量将生长良好的种子移入100l发酵罐发酵培养基中，罐压0.04±0.01mpa，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(v/v)，24小时后搅拌速度控制在200～250r/min，通气量1:1～1.5(v/v)，27℃～29℃下发酵140h，发酵结束后获得代谢产物他克莫司。
所述发酵培养基组成如下：糊精60g/l，葡萄糖15g/l，酵母粉35g/l，玉米浆干粉15g/l，碳酸钙10g/l，表面活性剂peg600含量为10g/l。
实施例十四
子瓶孢子液的制备同实施例一。
将他克莫司产生菌链霉菌经斜面活化和种子培养后，按0.5％接种量移种至100l种子罐种子培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.3～1.0(v/v)，搅拌速度200r/min，温度28℃下繁殖培养40小时，按5％移种量将生长良好的种子移入1000l发酵罐发酵培养基中，罐压0.04±0.01mpa，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(v/v)，24小时后搅拌速度控制在200～220r/min，通气量1:1～1.5(v/v)，27℃～29℃下发酵140h，发酵结束后获得代谢产物他克莫司。
所述发酵培养基组成如下：淀粉60g/l，葡萄糖25g/l，豆粕粉30g/l，蛋白胨8g/l，碳酸钙6g/l，表面活性剂tween80含量为40g/l。
实施例十五
子瓶孢子液的制备同实施例一。
将他克莫司产生菌链霉菌经斜面活化和种子培养后，按0.5％接种量移种至100l种子罐种子培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.3～1.0(v/v)，搅拌速度200r/min，温度27℃～29℃下繁殖培养40小时，按5％移种量将生长良好的种子移入1000l发酵罐发酵培养基中，罐压0.04±0.01mpa，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(v/v)，24小时后搅拌速度控制在200～220r/min，通气量1:1～1.5(v/v)，27℃～29℃下发酵140h，发酵结束后获得代谢产物他克莫司。
所述发酵培养基组成如下：淀粉60g/l，葡萄糖25g/l，豆粕粉30g/l，蛋白胨8g/l，碳酸钙6g/l，表面活性剂tween80含量为45g/l。
实施例十六
子瓶孢子液的制备同实施例一。
将他克莫司产生菌链霉菌经斜面活化和种子培养后，按0.5％接种量移种至100l种子罐种子培养基中，罐压0.04±0.01mpa，通气量1:0.3～1.0(v/v)，搅拌速度200±20r/min，温度28℃±1℃下繁殖培养40小时，按5％移种量将生长良好的种子移入1000l发酵罐发酵培养基中，罐压0.04±0.01mpa，移种后发酵生产采取变速发酵，发酵第一天搅拌速度为150r/min，通气量1:0.8(v/v)，24小时后搅拌速度控制在200～220r/min，通气量1:1～1.5(v/v)，27℃～29℃下发酵140h，发酵结束后获得代谢产物他克莫司。
所述发酵培养基组成如下：淀粉60g/l，葡萄糖25g/l，豆粕粉30g/l，蛋白胨8g/l，碳酸钙6g/l，表面活性剂tween80含量为50g/l。
表1不同发酵工艺在100l发酵罐中的他克莫司效价
表2不同发酵工艺在1000l发酵罐中的他克莫司效价
如表1、表2所示，以添加表面活性剂的发酵培养基发酵生产他克莫司，比未添加表面活性剂的发酵培养基中发酵生产他克莫司，其发酵效价不低于1300μg/ml，发酵水平提高50％以上，有效地提高了他克莫司产量，减低了生产成本。
上述各实施例中所述种子培养基组成如下：淀粉25g/l，葡萄糖5g/l，蛋白胨3g/l，酵母粉5g/l，麦芽浸膏7g/l，碳酸钙1g/l。
本发明通过他克莫司产生菌的发酵培养基中加入表面活性剂，改善细胞的通透性，减少营养物质及代谢产物的传递阻力，有利于产物的分泌和营养物的运输，减少产物的反馈抑制，为微生物提供有利的生长环境，促进发酵产物产量的提高，消除代谢产物他克莫司堆积对菌体生长的影响，使得发酵培养基更加适合菌体生长，提高他克莫司的产率。本发明操作简单方便，成本低，便于大规模生产，增强该产品的市场竞争力。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。