短双歧杆菌CCFM1025、其发酵食品及其应用的制作方法
本发明属于微生物技术领域，具体涉及短双歧杆菌ccfm1025、其发酵食品及其应用。
背景技术
抑郁症又称抑郁障碍，包括重度抑郁症、双相情感障碍、季节性情绪失调、产后抑郁等。作为一种异质性疾病，抑郁症的发病机制至今尚未明确阐明。不同抑郁症患者对治疗的反应具有不一致性，使其成为越来越严重的全球性疾病负担。目前世界上有超过3.5亿的抑郁症患者，预计到2030年，抑郁症将成为全球第一大疾病。
目前关于抑郁症的机制有两大解释，包括脑中单胺类神经递质失调和下丘脑-垂体-肾上腺轴(hpa)功能异常。其中单胺类神经递质失调是主要研究的方向，也被大量的病例证实，主要表现为大脑神经突触间隙的5-羟色胺(5-ht)、多巴胺、去甲肾上腺素等神经递质水平降低。此外，作为一种持续的慢性应激状态，抑郁症能够导致hpa轴持续激活，分泌过量糖皮质激素(gc)，导致海马体长期受到过量的gc攻击，损害海马神经元的结构和功能。海马损伤又进一步加重神经内分泌异常，加重抑郁症状。
基于已有的发病机制，目前用于临床的抗抑郁药物，主要集中在提高大脑突触间隙的单胺类神经递质水平(主要是5-ht)。其中选择性5-羟色胺重摄取抑制剂(ssri)和5-羟色胺和去甲肾上腺素重摄取抑制剂(snri)是目前的一线抗抑郁药物，占临床用药的70％以上。但目前的临床用药，存在以下两个问题：第一，药物起效有2-4周的延迟，原因是服用ssri增加突触间隙的5-ht浓度后，5-ht会反作用于突触前5-ht1a受体，产生负反馈抑制，导致突触前5-ht的合成和分泌减少。持续服药2-4周，使5-ht1a受体脱敏后，ssri才能真正起效。而这2-4周，在临床上会导致患者服药依从性降低，大大增加自杀风险。第二，大部分抗抑郁药物不具备预防作用，且长期服药会产生非特异性腹痛、便秘、腹泻、消化不良、胃胀气等副作用。因此，探索新的抗抑郁方法显得尤为重要，也显示出十分广阔的市场潜力。
“脑肠轴”是近年来提出的一个新概念，作为肠内细菌与大脑间的双向通信系统，主要通过神经途径、内分泌途径和免疫途径来调节大脑的功能以及行为。肠道内包含大量肠道微生物(约1014-1015个)，是人体最大的微生态系统。肠道菌群及其代谢产物与宿主之间的正常交流，对于维持宿主的健康是必要的。肠道微生态的紊乱与许多疾病相关，包括糖尿病、肥胖症、炎性肠病、神经退行性疾病和肿瘤等。通过益生菌调节肠道菌群也成为治疗神经类疾病的一种新途径。
因此，筛选出一种能够调节肠道菌群，并能有效缓解抑郁的益生菌显得十分必要。对于深入挖掘益生菌的功能，开发具有更高保健价值的益生菌具有十分重要的意义。同时为利用膳食策略缓解抑郁症开辟出新的途径和解决方案。
技术实现要素：
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。
因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供短双歧杆菌ccfm1025(bifidobacteriumbreve)，于2018年6月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为gdmccno.60386。
作为本发明另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种发酵食品。
为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案，其中：所述发酵食品为使用短双歧杆菌ccfm1025发酵生产制得，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。
作为本发明所述发酵食品的一种优选方法，其中：所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品，所述乳制品包括牛奶、酸奶油、干酪；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜制品。
作为本发明另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供短双歧杆菌ccfm1025在制备体内定植益生菌中的应用。
作为本发明另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供短双歧杆菌ccfm1025在制备抗抑郁、抗炎症性肠病、抗肥胖药物和保健品中的应用。
作为本发明所述短双歧杆菌ccfm1025在制备体内定植益生菌中的应用的一种优选方案，其中：所述短双歧杆菌ccfm1025能够改善抑郁小鼠的抑郁样行为、提高抑郁小鼠脑中的5-羟色胺(5-ht)、5-羟色氨酸(5-htp)和脑源神经营养因子(bdnf)的水平、降低抑郁小鼠血清中的皮质酮水平；所述短双歧杆菌ccfm1025能够提高抑郁小鼠血清中的5-羟色胺水平，改善胃肠道蠕动功能；所述短双歧杆菌ccfm1025能够改善改善抑郁小鼠的肠道菌群紊乱，降低肠道韦荣球菌科(veillonellaceae)的丰度，提高双歧杆菌属(bifidobacterium)和支原体科(allobaculum)的丰度，提高肠道菌群α-多样性，减少炎症性肠病和肥胖的发生；所述短双歧杆菌能够提高模拟肠嗜铬细胞(rin14b细胞)中色氨酸羟化酶1的mrna水平，并提高该细胞5-羟色氨酸的分泌量，能够特异性地通过刺激肠道嗜铬细胞产生5-羟色氨酸从而为脑中5-羟色胺的合成提供前体物质。
作为本发明另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供权利要求2或3所述的发酵食品在制备抗抑郁、抗炎症性肠病、抗肥胖功能性食品中的应用。
作为本发明所述发酵食品在制备抗抑郁功能性食品中的应用的一种优选方案，其中：所述短双歧杆菌ccfm1025能够改善抑郁小鼠的抑郁样行为、提高抑郁小鼠脑中的5-羟色胺、5-羟色氨酸和脑源神经营养因子的水平、降低抑郁小鼠血清中的皮质酮水平；所述短双歧杆菌ccfm1025能够提高抑郁小鼠血清中的5-羟色胺水平，改善胃肠道蠕动功能；所述短双歧杆菌ccfm1025能够改善改善抑郁小鼠的肠道菌群紊乱，降低肠道韦荣球菌科(veillonellaceae)的丰度，提高双歧杆菌属(bifidobacterium)和支原体科(allobaculum)的丰度，提高肠道菌群α-多样性，减少炎症性肠病和肥胖的发生；所述短双歧杆菌能够提高模拟肠嗜铬细胞(rin14b细胞)中色氨酸羟化酶1的mrna水平，并提高该细胞5-羟色氨酸的分泌量，能够特异性地通过刺激肠道嗜铬细胞产生5-羟色氨酸从而为脑中5-羟色胺的合成提供前体物质。
为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：
本发明的有益效果：在抑郁模型小鼠实验中，服用ccfm1025能够显著缓解小鼠的抑郁样行为，评估指标包括强迫游泳实验、糖水偏好实验和跳台实验；服用ccfm1025能够显著提高抑郁小鼠海马体中的5-羟色氨酸和5-羟色胺的水平，同时显著提高大脑前额叶皮质中bdnf的水平；服用ccfm1025能够显著降低抑郁小鼠血清中的皮质酮水平，缓解抑郁引起的hpa功能亢进；服用ccfm1025能够提高抑郁小鼠血清组织中的5-羟色胺水平，改善其肠道蠕动功能。服用ccfm1025能够改善抑郁引起的肠道菌群紊乱，增加肠道菌群的α-多样性，还能够降低肠道韦荣球菌科(veillonellaceae)的丰度、提高双歧杆菌属(bifidobacterium)和支原体科(allobaculum)的丰度，并使肠道菌群趋于正常化，减少炎症性肠病和肥胖的发生。体外实验结果表明，ccfm1025能够提高模拟肠嗜铬细胞(rin14b细胞)中色氨酸羟化酶1的mrna水平，并提高该细胞5-羟色氨酸的分泌量，能够特异性地通过刺激肠道嗜铬细胞产生5-羟色氨酸从而为脑中5-羟色胺的合成提供前体物质。
本发明所述的短双歧杆菌ccfm1025可用于制备具有抗抑郁功能的食品、保健品和药品，具有非常广泛的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本菌株干预抑郁小鼠六周后，小鼠的行为学变化示意图。(a)强迫游泳实验；(b)糖水偏好实验；(c)跳台实验；其中*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(vs模型组)。
图2为本菌株干预抑郁小鼠六周后，海马组织中5-羟色胺(5-ht，图a)和5-羟色氨酸(5-htp，图b)、前额叶皮质中脑源神经营养因子(bdnf，图c)的水平变化示意图；其中*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(vs模型组)。
图3为本菌株干预抑郁小鼠六周后，小鼠血清中皮质酮水平示意图；其中**p<0.01，***p<0.001(vs模型组)。
图4为本菌株干预抑郁小鼠六周后，小鼠血清中5-ht水平示意图；其中**p<0.01(vs模型组)。
图5为本菌株干预抑郁小鼠六周后，小鼠肠道菌群α-多样性变化示意图；其中*p<0.05(vs模型组)。
图6为本菌株干预抑郁小鼠六周后，小鼠肠道菌群β-多样性变化示意图。
图7为本菌株干预抑郁小鼠六周后，小鼠肠道中韦荣球菌科(veillonellaceae)、双歧杆菌属(bifidobacterium)和支原体科(allobaculum)的变化示意图；其中*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
图8为本菌株刺激rin14b细胞后，细胞内色氨酸羟化酶1的mrna水平和细胞上清中5-羟色氨酸含量的变化示意图；其中其中*p<0.05，**p<0.01。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
本发明的短双歧杆菌ccfm1025(bifidobacteriumbreve)，于2018年6月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为gdmccno.60386。
所述短双歧杆菌ccfm1025具有以下生物学特性：
(1)菌体特征：呈革兰氏染色阳性，不形成抱子，不运动的细菌。
(2)菌落特征：菌落小，乳白色，圆形，边缘整齐，微凸起，不透明，表面湿润光滑；
(3)生长特性：该菌株的最低生长温度为15℃，最高生长温度为45℃，在温度35-37℃下生长最佳，最适生长ph为6.5，培养18h后进入稳定期；
(4)在抑郁小鼠模型中能够显著改善小鼠的行为学表现；
(5)在抑郁小鼠模型中能够提高小鼠脑中的5-ht、5-htp和bdnf的水平；
(6)在抑郁小鼠模型中能降低小鼠血清皮质酮的水平；
(7)在抑郁小鼠模型中能提高抑郁小鼠血清组织中的5-ht水平，改善其肠道蠕动功能；
(8)能降低抑郁小鼠肠道中韦荣球菌科(veillonellaceae)的丰度、提高双歧杆菌属(bifidobacterium)和支原体科(allobaculum)的丰度，增加肠道菌群的α-多样性，改善抑郁引起的肠道菌群紊乱，减少炎症性肠病和肥胖的发生。
所述短双歧杆菌ccfm1025的提取方法为：
(一)双歧杆菌的分离筛选：
(l)取1g健康成年人的新鲜粪便。梯度稀释后涂布于mmrs固体培养基，置于厌氧环境下37℃培养72小时；
(2)观察记录菌落形态，挑取菌落划线纯化；
(3)在mmrs液体培养基中，37℃培养48小时，所得菌落进行革兰氏染色，记录菌落形态。
(4)弃除菌落中的革兰氏阴性菌菌株和革兰氏阳性球菌，挑选得到革兰氏阳性杆菌。
(5)过氧化氢酶分析后，弃除过氧化氢酶阳性菌株，保留过氧化氢酶阴性菌株。
(二)双歧杆菌的初步鉴定：果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶测定法
(1)将步骤(一)所筛选得到的乳酸菌在液体mmrs培养液中培养24h，然后取lml培养物8000rpm离心2min；
(2)用含0.05％(质量百分数)半胱氨酸盐酸盐的ph6.5的0.05mkh2po4溶液洗涤两次；
(3)重悬于200μl添加了0.25％(质量百分数)tritonx-100的上述磷酸盐缓冲液；
(4)添加50μl浓度为6mg/ml氟化钠和10mg/ml碘乙酸钠的混合液以及50μl浓度为80mg/ml的果糖-6-磷酸，37℃孵育1h；
(5)添加300μl浓度为0.139g/ml、ph6.5的盐酸羟胺，并于室温放置10min；
(6)分别添加200μl15％(质量百分数)的三氯乙酸和4mhci；
(7)添加200μl含有5％(质量百分数)三氯化铁的0.1mhci，体系迅速变为红色，即为f6ppk阳性，初步断定其为双歧杆菌。
(三)双歧杆菌的分子生物学鉴定：
(l)单菌基因组抽提：将步骤(二)所筛选得到的双歧杆菌培养过夜，取培养过夜的菌悬液lml于1.5ml离心管，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；用lml无菌水吹洗菌体后，10000rpm离心2min，弃上清得菌体；加入200μlsds裂解液，80℃水浴30min；加入酚-氯仿溶液200μl于菌体裂解液中，其中酚-氯仿溶液的组成成分及体积比为tris饱和酚:氯仿:异戊醇＝25:24:1，颠倒混匀后，12000rpm离心5-10min，取上清200μl；加入400μl冰乙醇或冰异丙醇于200ul上清中，﹣20℃静置1h，12000rpm离心5-10min，弃上清；加入500μl70％(体积百分数)冰乙醇重悬沉淀，12000rpm离心1-3min，弃上清；60℃烘箱烘干，或者自然晾干；50μlddh2o重溶沉淀以备pcr；
(2)16srdnapcr：
a.细菌16srdna50μlpcr反应体系：
10×taqbuffer，5μl；dntp，5μl；27f，0.5μl；1492r，0.5μl；taq酶，0.5μl；模板，0.5μl；ddh2o，38μl。
b.pcr条件：
95℃5min；95℃10s；55℃30s；72℃30s；step2-430×；72℃5min；12℃2min；
c.制备1％琼脂糖凝胶，之后将pcr产物与10000×loadingbuffer混合，上样量2μl，120v跑30min，然后进行凝胶成像；
d.将得到pcr产物送专业测序公司，将得到的测序结果与使用blast在genebank中进行搜索和相似性比对，鉴定为短双歧杆菌。
(3)全基因组测序
将提取的全基因组送专业测序公司，利用二代测序仪对菌的全基因组进行测序，将得到的序列结果使用blast在genebank中进行搜索和相似性比对，测序结果鉴定为属于短双歧杆菌的一种新发现的菌株。菌株-80℃保藏备用。
实施例1：短双歧杆菌ccfm1025能够显著改善抑郁小鼠的行为学指标
取6周龄雄性c57bl/6j小鼠32只，适应环境一周后，根据体重随机分为四组：对照组、模型组、氟西汀干预组、ccfm1025干预组，每组含8只小鼠。动物分组及处理方法见表1。
表1动物实验分组及处理方法
慢性不可预知应激抑郁小鼠模型：每天随机采用1-2种刺激，每天刺激的时间随机决定，避免昼夜节律。每种方法不超过三次，为期五周。刺激因素包括：(1)禁食24h；(2)禁水+空瓶刺激24h；(3)夹尾3min；(4)潮湿垫料24h；(5)制动1～2h；(6)45°倾斜笼盒24h；(7)持续光照24h；(8)无垫料24h；(9)强迫游泳15分钟；(10)孤养24h。
乳酸菌灌胃剂：取活化2代的双歧杆菌ccfm1025并于37℃下培养至24h，于4℃、8000r/min离心3min收集菌体，弃去上清并用5％灭菌脱脂乳液重悬菌体，使乳酸菌浓度达到5×109cfu/ml。灌胃体积为0.2ml/只/天。
第五周开始，停止每日的慢性不可预知应激以及药物和益生菌的干预，同时对所有小鼠进行行为学测试。包括强迫游泳实验、悬尾实验、糖水偏好实验、旷场实验和跳台实验。具体实施方法和结果如下：
(1)强迫游泳实验：
强迫游泳实验是一种行为绝望实验法，是用于评价药物抗抑郁作用的经典实验模型。实验桶内装入大约20cm高的清水，水温在24±1°左右，在正式实验前24小时，每只小鼠均进行15分钟的游泳训练测试。正式实验时，每只小鼠进行6分钟测试。使用摄像头对实验全程录像。记录不动(漂浮)时间，即四肢不动或仅后肢轻微运动。实验结果如图1a所示，抑郁组小鼠在水中的游泳时间显著降低，表现出行为绝望的特点。而服用ccfm1025能够显著改善这一现象，表明小鼠抑郁症状减轻。
(2)糖水偏好实验：
糖水偏好测试是检测抑郁症快感缺失的模型。在开始测试之前，笼内放置两个相同的饮水瓶，使小鼠适应性饮水至少3天。适应结束后，将其中一瓶水替换为含有1％蔗糖的水溶液。通过称量瓶子重量来检测水和蔗糖溶液的摄入量。每天更换两个瓶子的位置，以减少因水量不同引起的饮水偏好。蔗糖偏好计算公式为：蔗糖偏好＝v(蔗糖溶液)/[v(蔗糖溶液)+v(水)]×100％，总共测试3天，取平均值。实验结果如图1b所示，抑郁小鼠的糖水偏好程度显著下降，服用ccfm1025后，小鼠恢复至正常的糖水偏好程度，表明ccfm1025能缓解抑郁导致的快感缺失。
(3)跳台实验：
第一阶段为电击训练阶段。将小鼠放入跳台反应箱的平台上，反应箱底部电栅通电(38v)，当小鼠从平台上跳下时，即遭受一次电击刺激。训练时间为3min，若个别小鼠3分钟内没有跳下平台，则人为将其赶下，确保所有动物均遭受到电击伤害，造成伤害感受性记忆。训练完毕后放回原笼饲养。第二阶段(电击训练后24h)为记忆再现测试阶段。将小鼠放入反应箱平台上，测试时间为3分钟，本次测试不通电，记录小鼠从站上平台到第1次跳下的时间(在平台上停留的时间)即跳台潜伏期，如果小鼠一直未跳下平台则以180s计算。整个实验过程中尽量避免对动物行为的人为干扰。实验结果表明(图1c)，抑郁小鼠的跳台潜伏期显著升高，代表抑郁和焦虑程度增加，而服用ccfm1025能够缓解其焦虑程度。
实施例2：ccfm1025能显著提高抑郁小鼠脑内神经递质水平
实施例2中的小鼠于第六周末安乐处死，取小鼠脑组织，并于冰上分离海马和前额叶皮质。分别取一定质量的新鲜海马和前额叶皮质组织(重量不低于50mg)，加入9倍体积的无菌pbs缓冲液(相当于1g组织加9ml的匀浆液)，用组织匀浆器进行匀浆，组织液经过3000g、20min离心后取上清，用elisa试剂盒检测5-ht和bdnf含量。海马组织液上清加入等体积的5％高氯酸沉淀蛋白，10000g离心10min，吸取上清液经0.22μm水系滤膜过滤后，采用高效液相色谱-荧光检测法(hplc-fld)进行5-htp的含量测定。色谱柱采用岛津intertsilods-3(5μm，4.6mm×250mm)，流动相a为0.1mol/l的naac(其中含有0.1mmol/l的edta-2na)，ph5.1。流动相b为甲醇，流动相a：b＝85:15，流速1.0ml/min，荧光检测激发波长为290nm，发射波长为330nm，进样量为10μl。实验结果如图2所示，结果表明，服用ccfm1025能够显著逆转应激造成的海马中5-ht、5-htp和前额叶皮质中bdnf水平的降低。其中，ccfm1025对海马5-htp和5-ht的改善程度和氟西汀相当，对前额叶皮质中bdnf的改善效果显著优于氟西汀。
实施例3：短双歧杆菌ccfm1025能够降低小鼠血清中皮质酮水平
实施例2中的小鼠于第六周末安乐处死，收集小鼠血液，1000g离心15min获得血清。用elisa试剂盒检测血清中皮质酮的含量。实验结果表明(图3)，抑郁小鼠由于持续的慢性应激，出现下丘脑-垂体-肾上腺轴(hpa)功能亢进，血清中皮质酮水平显著升高，服用ccfm1025能显著降低抑郁小鼠血清中的皮质酮水平，缓解hpa亢进，显示出良好的抗抑郁功效。
实施例4：短双歧杆菌ccfm1025能够提高抑郁小鼠血清5-ht水平
取实施例4中的血清，用elisa试剂盒检测血清中的5-ht含量。外周组织中的5-ht对维持正常的肠道蠕动功能具有重要意义。外周组织的5-ht能够激动胃肠道平滑肌5-ht2受体，或作用于肠壁内神经节细胞5-ht4受体，引起胃肠道平滑肌收缩，使胃肠道张力增加，肠蠕动加快；外周组织5-ht的减少与便秘、胃肠道不适等疾病有直接的关联。实验结果表明(图4)，抑郁小鼠外周组织5-ht显著降低，肠道蠕动功能受损。服用氟西汀虽然有抗抑郁效果，但无法改善抑郁小鼠的肠道功能。而服用ccfm1025不仅能够缓解抑郁症状，还能显著提高血清中5-ht的含量，使之恢复至正常水平，恢复抑郁小鼠的正常肠道蠕动功能。
实施例5：短双歧杆菌ccfm1025对抑郁小鼠肠道菌群的调节作用及其多功能调节作用
取实施例2中小鼠第六周末的新鲜粪便，采用mp的粪便试剂盒提取小鼠粪便样品中总dna。具体操作步骤如下主要参照试剂盒说明书进行。以小鼠粪便基因组为模板，以上游引物520f(5′-aytgggydtaaagng-3′)、下游引物802r(5′-tacnvgggtatctaatcc-3′)为引物扩增16srdna的v3-v4区片段，目的片段长度为247bp左右。pcr反应结束，将观察到目的条带的所有pcr样品再次进行电泳，配制2.0％琼脂糖凝胶，于120v条件下电泳40min，跑胶结束后，在紫外灯下快速进行目的条带的切割。按照qiaquickgelextractionkit胶回收试剂盒说明书进行目的条带胶回收。根据qubitdna3.0试剂盒检测样品dna浓度，随后根据turseqdnaltsamplepreparationkit及其说明构建文库，最后根据miseqregentkit及其说明经过illuminamiseq测序仪上机测定。测序完成后，剔除掉序列长度＜200bp、引物序列、不能拼接的单序列，按照重叠碱基>10bp且无错配的标准拼接序列。将相似度大于97％序列定义为一个分类单元(operationaltaxonomicunit，otu)，通过ribosomaldatabaseproject(rdp)
此外，韦荣球菌科(veillonellaceae)丰度在抑郁小鼠中显著提高，而服用ccfm1025能够显著逆转这一现象；韦荣球菌科包括6个属和25个种，为革兰氏阴性、厌氧或微需氧球菌和球杆菌。其中部分菌为条件致病菌，常见于人和动物的微生物感染疾病中，在重度骨关节炎和心内膜炎中也有发现。服用ccfm1025还能增加双歧杆菌属(bifidobacterium)和支原体科(allobaculum)的丰度。其中，双歧杆菌属具有生物屏障、营养作用、抗肿瘤、增强免疫、改善胃肠道功能、抗衰老等多种重要的生理功能，是一种生理性有益菌。支原体科能够产生短链脂肪酸，尤其是丁酸，不仅能够为肠上皮细胞氧化供能，而且还有维持水电解质平衡、调节肠道菌群平衡、调节肠道屏障功能等重要作用。此外，短链脂肪酸能通过g蛋白偶联受体(gprotein-coupledreceptors，gpcrs)激活途径和组蛋白脱乙酰基酶(histonedeacetylases,hdacs)抑制途径两条信号通路发挥抗炎作用，对炎症性肠病(inflammatoryboweldisease，ibd)和肥胖均具有显著的改善作用。以上结果表明ccfm1025在抗抑郁功能的基础上，还同时具备调节肠道菌群、调节免疫及肠道屏障、减少炎症性肠病和肥胖发生的多重功能。
实施例6：双歧杆菌ccfm1025对rin14b细胞5-htp合成的影响
细胞上清中5-htp的测定：rin14b细胞以4×105/ml的密度种在24孔板，孵育72h。弃去培养基，用含有0.1％牛血清白蛋白(bsa)和2μm氟西汀的hbss(1ml)清洗细胞，加入1ml含有ccfm1025的hbss悬液(对照组为不含菌体的hbss)，37℃孵育20min，收集上清，6000g离心5min去除沉淀，取上清液冷冻于-80℃待测。hplc-fld检测细胞上清中的5-htp(参考实施例3)。
tph1的mrna测定：上述步骤中的贴壁细胞用hbss洗涤三次，加入1mltrizol，置于冰上孵育5-10min，吹打使细胞脱落，将裂解液转移至无酶ep管。采用常规方法提取细胞总rna，根据反转录试剂盒的说明进行cdna的合成(primescriptrtreagentkitgdnaeraser，takara)。合成的cdna样品经过超微量分光光度计(nanodrop2000c)检测其浓度和纯度(a260/a280)，-80℃保存待用。用荧光染料sybrgreensupermix(qiagen,germany)混合样本，pcr体系为5μlmix、1μlcdna、1μl正向和反向引物，用dd水补至总体积为10μl。在实时荧光定量基因扩增仪器cfx96tmreal-timesystem(bio-rad，usa)上进行检测，每个样本设立3个平行孔，并以管家基因β-actin为内参，所得结果用2-δδcq的方法进行分析；所用的引物序列见表2。
表2qpcr引物序列
结果表明，ccfm1025刺激rin14b细胞后，细胞内tph1的mrna水平显著提高。相应地，细胞分泌5-htp的量也显著提高。肠嗜铬细胞分泌的5-htp能够进入血液循环，并通过血脑屏障，为脑中5-ht的合成提供前体物质。因此ccfm1025能够特异性地通过刺激肠嗜铬细胞分泌5-htp从而促进大脑中5-ht的合成，实现抗抑郁功能。
实施例:7：利用本发明短双歧杆菌ccfm1025制造含该菌的发酵食品
选用新鲜蔬菜洗净后榨汁，接着进行高温瞬间灭菌，在温度140℃下高温热杀菌2秒后，立即降温至37℃，再接入本发明制备的短双歧杆菌ccfm1025菌剂发酵剂，使其浓度达到106cfu/ml以上，在温度4℃下冷藏保存，于是得到含有本发明短双歧杆菌ccfm1025活菌的果蔬饮料。
利用本发明能够使用短双歧杆菌ccfm1025发酵生产制备其他发酵食品，所述发酵食品包括固态食品、液态食品、半固态食品。所述发酵食品包括乳制品、豆制品、果蔬制品，所述乳制品包括牛奶、酸奶油、干酪；所述果蔬制品包括黄瓜、胡萝卜、甜菜、芹菜、圆白菜制品。
所述发酵食品能够改善抑郁小鼠的抑郁样行为、提高抑郁小鼠脑中的5-羟色胺、5-羟色氨酸和脑源神经营养因子的水平、降低抑郁小鼠血清中的皮质酮水平；所述发酵食品能够提高抑郁小鼠血清中的5-羟色胺水平，改善胃肠道蠕动功能；所述发酵食品能够改善改善抑郁小鼠的肠道菌群紊乱，降低肠道韦荣球菌科(veillonellaceae)的丰度，提高双歧杆菌属(bifidobacterium)和支原体科(allobaculum)的丰度，提高肠道菌群α-多样性，减少炎症性肠病和肥胖的发生；能够提高模拟肠嗜铬细胞(rin14b细胞)中色氨酸羟化酶1的mrna水平，并提高该细胞5-羟色氨酸的分泌量，能够特异性地通过刺激肠道嗜铬细胞产生5-羟色氨酸从而为脑中5-羟色胺的合成提供前体物质。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
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