一株短小芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法

本发明属于微生物工程
技术领域：
，尤其涉及一株短小芽孢杆菌菌株及其应用。
背景技术：
油桐是我国本土的木本油料树种，具有生长快、产量高、适应性广、种子含油率高且营养丰富等优点。桐籽榨油后的桐饼，含有氮4％～6％、p2o51.8％～2.7％、k2o1.2％～1.3％，还有大量其它微量元素，是一种优良的蛋白资源。但由于油桐饼粕含有皂角甙和佛波醇及其相关化学物质等毒素，因而油桐饼粕长久以来多作为饼肥还田使用，不能作为动物食物来源。在农业生产中，高养分且简便的化肥使用过多，带来了各种农业和环境问题：土壤养分流失，环境污染，作物抗病虫害能力减弱，资源浪费等等。将加工后的桐粕发酵制备成生物菌肥，不仅有助于解决生物肥的多样性，而且能够在一定程度上规避对于化学肥料的依赖，还可减少农药的使用。但是油桐饼粕作为肥料直接施用或者堆积发酵后施用，不仅肥效慢，而且桐粕中的营养物质不能充分利用造成资源浪费。短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)是一类革兰氏阳性好氧性杆状细菌，可以产生芽孢。短小芽孢杆菌能够很强的分泌蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶、木聚糖酶等，有利于降解油桐饼粕中大分子物质，还可以产生抗菌素及抗菌蛋白等拮抗物质，且抑菌范围广。例如：尹萌萌等选育的分的高产碱性蛋白酶菌株短小芽孢杆菌(响应面法优化短小芽孢杆菌scu11发酵产碱性蛋白酶及关键基因转录调控分析，应用与环境生物学报，2016年03期)发酵产碱性蛋白酶活为8768u/ml，冀勇良等试验一株短小芽孢杆菌(短小芽孢杆菌产角蛋白酶液体发酵条件的优化，食品与发酵科技，2014年02期)发酵产角蛋白酶活为57.14u/ml，张蕾通过筛选得到短小芽孢杆菌(短小芽孢杆菌ty079产抗菌物质的发酵培养基研究，河南省科学院学报，2010年02期)对黄瓜枯萎病、棉花枯萎病具有显著的抑制作用。马荣等筛选获得的短小芽孢杆菌菌株xjau-117(新疆核桃树腐烂病拮抗细菌的筛选及初步鉴定，新疆农业科学，2015年05期)，具有广谱拮抗效果，对核桃树腐烂病病原菌的拮抗效果达85％。因此，短小芽孢杆菌是一种有潜力的生物有机肥发酵及生物防治菌种，寻找一种适合用于油桐饼粕的短小芽孢杆菌，是本领域技术人员一直以来努力研究的方向。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是，克服以上
背景技术：
中提到的不足和缺陷，提供一株短小芽孢杆菌菌株及其应用。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为提供一株短小芽孢杆菌菌株，该短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc)，其命名为短小芽孢杆菌cfc-5(bacilluspumiluscfc-5)，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为gdmccno：60397，保藏时间为2018年6月25日，保藏单位的地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。上述的短小芽孢杆菌cfc-5(bacilluspumiluscfc-5)是从油桐饼粕中分离纯化获得，在na平板上，倒置30℃培养一段时间后，菌落形态呈白色，扁平状，透明性差，显微镜观察细胞呈杆状，革兰氏染色为阳性。上述的短小芽孢杆菌cfc-5(bacilluspumiluscfc-5)的dna基因序列，见seqidno.1所示。上述的短小芽孢杆菌cfc-5(bacilluspumiluscfc-5)，其16srdna序列在genbank比对的结果显示为短小芽孢杆菌cfc-5(bacilluspumiluscfc-5)与bacilluspumilus(ay876289.1)相似性达到100％，因此将其鉴定为短小芽孢杆菌。综合形态学观察、生理生化鉴定及its序列分析结果，可以确定该短小芽孢杆菌cfc-5为短小芽孢杆菌种(bacilluspumilus)，其被命名为短小芽孢杆菌cfc-5。上述的短小芽孢杆菌cfc-5(bacilluspumiluscfc-5)，经试验检测，短小芽孢杆菌cfc-5(bacilluspumiluscfc-5)能够耐受油桐饼粕中的有毒物质并降解其蛋白质，对农作物病害具有广谱抑制作用并且具有促生作用。基于一个总的技术构思，本发明还相应提供一种上述的短小芽孢杆菌菌株在降解油桐饼粕中蛋白质的应用，其应用方法包括如下步骤：挑取短小芽孢杆菌cfc-5至种子培养基中进行繁殖培养(制成发酵菌剂)，然后接种至油桐饼粕中进行发酵培养，发酵过程中实现对油桐饼粕中蛋白质的降解。上述的应用，优选的，所述种子培养基包括牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和去离子水，所述牛肉膏、蛋白胨、氯化钠和水的质量比为(3-5):(5-6):(5-6):1000。优选的，所述繁殖培养的过程中控制ph为6.8-7.2，繁殖培养的温度为25℃-45℃，时间为12-24h；所述繁殖培养过程中控制转速为150-200r/min。优选的，所述短小芽孢杆菌cfc-5的接种量为3-40％，所述油桐饼粕的初始含水量为50％-100％，发酵培养的温度为25℃-50℃，发酵过程控制ph为6.0-8.5，发酵时间为2-8天。优选的，在发酵培养期间，每隔12-48h进行一次翻料处理，确保菌株能够均匀发酵。基于一个总的技术构思，本发明还相应提供一种上述的短小芽孢杆菌菌株在抑制农作物病害中的应用。上述的应用，优选的，所述农作物病害的植物病原真菌为辣椒疫霉菌(phytophthoracapsicileonian)、亚麻立枯病菌(rhizoctoniasolanikuhn)、亚麻炭疽病菌(colletotrichumlinicolumpethybretlaff)、亚麻枯萎病菌(fusariumoxysporumschl.f.sp.lini(bolley)snyder&hansen)、黄瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.cucumebriumowen)或油菜菌核病菌(sclerotiniascleratiorum(lib.)debary)。与现有技术相比，本发明的有益效果为：1、本发明提供的短小芽孢杆菌菌株为短小芽孢杆菌cfc-5，该菌株具有降解油桐饼粕中蛋白质的能力，对农作物土传病害具有广谱抑制作用，并且具有促生作用，为降解油桐饼粕提供了菌源。2、本发明的短小芽孢杆菌cfc-5，可以作为发酵菌剂发酵降解油桐饼粕中的蛋白质，在100小时内降解油桐饼粕蛋白生产氨基酸量为127-143mg/g。3、本发明的短小芽孢杆菌cfc-5，对植物病原真菌的生长均有抑制作用，在植物病害的防控上具有很大的潜在应用价值。一株短小芽孢杆菌菌株，其命名为短小芽孢杆菌cfc-5(bacilluspumiluscfc-5)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc)，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为gdmccno：60397，保藏时间为2018年6月25日，保藏单位的地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是实施例中短小芽孢杆菌cfc-5的菌落形态图。图2是实施例中短小芽孢杆菌cfc-5的革兰氏染色显微成像(×1000)图。图3是实施例中短小芽孢杆菌cfc-5的16srdna序列构建的系统发育树图。具体实施方式为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。实施例：本发明提供的一株短小芽孢杆菌菌株，其命名为短小芽孢杆菌cfc-5(bacilluspumiluscfc-5)，保藏于广东省微生物菌种保藏中心(简称gdmcc)，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为gdmccno：60397，保藏时间为2018年6月25日，保藏单位的地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。1、菌株的筛选1)油桐饼粕来源：从油桐加工企业采样。2)油桐饼粕浸出汁培养基：油桐饼粕200g，60～90℃下浸泡3～4h，用8层纱布过滤除去残渣获得桐粕汁，定容至1000ml，250ml三角瓶分装，每瓶装量50ml，ph自然。3)油桐饼粕发酵底料：油桐饼粕和水等比例(质量比)混匀，500ml锥形瓶装量40g，1×105pa湿热灭菌25min(两次)。4)菌种初筛：将油桐饼粕和水按3∶1比例混匀，自然堆积发酵20d。取1g堆积发酵的油桐粕接种到油桐粕浸出汁培养基中，做3个重复，30℃、180r/min摇床培养48h后，分别吸取1ml菌悬液接种到油桐粕浸出汁培养基屮，30℃、180r/min摇床培养3d。3d后分别取1ml菌悬液，用无菌水作一系列的倍比稀释。分别将100μl稀释浓度为10-13～10-16的稀释液涂布到na培养基上，30℃培养箱中倒置培养，每隔24h观察平板上菌体生长情况。挑取颜色形态不同的菌落进行划线分离，反复进行纯化，得到单菌落并进行编号，4℃斜面保存。5)菌株复筛：将分离纯化的单菌株分别接种到50mlna液体培养基中，30℃、180r/min摇床培养。每隔12h时取样1ml，用无菌水进行10-1～10-8倍比稀释，选取10-7～10-8浓度进行na平板涂布，每个浓度3次重复，30℃恒温培养24h，对平板上的菌落进行计数。待细菌密度达到108cfu/ml时即可用于接种发酵。按40％接种量(v/m)接种菌液到油桐饼粕发酵底料中，35℃恒温培养箱培养4d，每隔24h进行翻样，每个菌株2组重复。发酵结束后，取出发酵物70℃烘干，甲醛法测定发酵前后样品中氨基态氮含量，对比筛选出发酵效果比较好的菌株。2、菌株的鉴定1)形态学观察：经形态观察，如图1所示，菌落形态呈白色，扁平状，透明性差。如图2所示，显微镜观察呈现细胞呈杆状，革兰氏染色为阳性。2)生理生化鉴定：接触酶实验：直接滴加3％的过氧化氢于菌株的液体培养物(24h)中，立即观察，有大量气泡产生者为阳性，不产生气泡者为阴性。菌株立即产生大量气泡，实验结果为阳性。淀粉水解实验：菌种点接至淀粉培养基上，30℃培养48h，滴加少量碘液于平板，轻轻旋转，使碘液均匀分布于平板，观察。菌落周围出现无色透明圈表明有水解淀粉的能力，反之，没有。菌株菌落周围无透明圈产生，不可水解淀粉，为阴性。甲基红mr实验：挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于30℃，3～5天，取培养液1ml，加甲基红指示剂1～2滴，阳性呈红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。菌液变红色，为阳性。vp实验：挑取新纯培养物少许，接种于通用培养基，于30℃培养2d、培养液2.5ml先加入a-萘酚纯酒精溶液0.6ml，再加40％氢氧化钾水溶液0.2ml，摇动2～5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或30℃恒温箱，如2h内仍不显现红色，可判定为阴性。菌液立即变红，为阳性。明胶液化实验：取新纯培养物，穿刺接种于明胶高层约2/3深度，另有两支未接种的空白对照。20℃下培养3～5d。每天观察结果，若细菌生长且明胶部分或全部变为可流动的液体，则为试验阳性。否则为阴性。明胶被液化，为阴性。硝酸盐还原实验：将培养物接种于硝酸盐肉汤培养基，28℃摇床培养3d，取5ml培养液，按试剂盒(海博生物技术有限公司硝酸盐还原试剂盒)说明加入显色剂，变黄为阳性，不变色为阴性。菌液变色，为阳性。产硫化氢实验：将待检菌穿刺接种于醋酸铅培养基，于35℃培养24～48h观察结果。培养基变黑为阳性，不变为阴性。培养基未变色，为阴性。纤维素分解实验：将待测菌株划线接种于添加0.8％纤维素粉的琼脂基础培养基上，以不接种的培养基作为空白对照，30℃培养1～2周，菌株能在培养基上生长，实验结果为阳性；反之为阴性。菌株不生长，为阴性。解磷试验：将菌株接种到添加2％琼脂的nbrip培养基上，30℃培养3d，菌落周围有无色透明圈出现者为阳性，证明该菌株具有解磷能力。菌株菌落周围有无色透明圈出现，为阳性。产吲哚乙酸(iaa)试验：将待测菌株接种到添加0.5mmol/ll-色氨酸的tsb培养基中30℃摇床培养48h，取培养液2ml，10000r/min离心10min，取上清，每1ml上清液添加2mlsalkowski试剂，室温暗处静置30min，以空白培养基作为对照，如有粉色产生则说明有iaa产生。有粉色产生，具有产iaa能力，为阳性。产氨试验：将菌株接种到蛋白胨培养基中，30℃摇床培养3d，取培养液少许于试管中，滴加5滴纳氏试剂，以空白培养基作为对照，出现黄褐色沉淀为阳性，证明菌株具有产氨的能力。有黄褐色沉淀产生，具有产氨能力，为阳性。综上，生理生化鉴定结果如表1。表1：本菌株的生理生化鉴定结果表性特征反应特征接触酶测定+淀粉水解测定-甲基红mr测定+vp实验+明胶液化测定-硝酸盐还原测定+产硫化氢测定-纤维素分解-解磷试验+产iaa试验+产氨试验+其中，“+”表示为本菌株有反应或可以利用，“-”示为本菌株没有反应或不可以利用。表1试验结果，说明菌株cfc-5可以产生吲哚乙酸，具有解磷能力，产氨能力，这些促生特性试验结果说明菌株cfc-5具有促进植物生长的潜力。3)菌株的16srdna序列测定：利用细菌dna提取试剂盒提取候选菌株dna，采用细菌扩增通用引物16sf和16sr扩增细菌的16srrna；pcr反应体系(50μl)为10×pcrbuffer5μl，dna模板1μl，dntp(2.5mmol/l)4μl，mgcl2(25mmol/l)3μl，引物(1mmol/l)各1μl，taqdna聚合酶0.5μl，加ddh2o至50μl；反应条件为94℃5min，94℃30s，53℃30s，72℃1min，共35个循环，4℃保存。扩增产物由上海生工生物工程有限公司进行测序，测序结果如序列表seqidno.1所示，16srdna序列构建的系统发育树图如图3所示。3.短小芽孢杆菌cfc-5对农作物病害抑制作用的应用如表2所示，菌株cfc-5对辣椒疫霉菌(phytophthoracapsicileonian)、亚麻立枯病菌(rhizoctoniasolanikuhn)、亚麻炭疽病菌(colletotrichumlinicolumpethybretlaff)、亚麻枯萎病菌(fusariumoxysporumschl.f.sp.lini(bolley)snyder&hansen)、黄瓜枯萎病菌(fusariumoxysporumf.sp.cucumebriumowen)、油菜菌核病菌(sclerotiniascleratiorum(lib.)debary)等6个植物病原真菌的生长均有抑制作用，对油茶炭疽病菌抑制能力最强，抑菌圈直径为23.29mm；对亚麻炭疽病菌抑制能力较弱，但抑菌圈直径也达到了17.7mm。说明菌株cfc-5是一株高效广谱的拮抗菌，在植物病害的防控上具有很大的潜在应用价值。表2：菌株cfc-5对6个植物病原真菌的抑菌能力病原真菌抑菌圈直径(mm)a辣椒疫霉病菌19.28±1.20bc亚麻立枯病菌22.00±0.48ab亚麻炭疽病菌17.70±0.43e油茶炭疽病菌23.29±0.47a黄瓜枯萎病菌20.00±0.23cd油菜菌核病菌19.71±0.84d表中数据为平均值±标准误，不同小写字母表示处理间差异显著(p<0.05)。4、短小芽孢杆菌cfc-5作为发酵剂及降解油桐饼粕中蛋白的应用1)培养基的选用种子培养基：牛肉膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，去离子水1000ml，调节ph至6.8-7.2,分装50ml至250ml锥形瓶中，121℃灭菌20min。发酵培养基：油桐饼粕(40目)100g，水25ml，装于1000ml锥形瓶中，ph6.8-7.2，121℃灭菌20min。2)实施方法挑取一环斜面培养基上的短小芽孢杆菌cfc-5，至种子培养基中，培养温度35℃，培养时间为20h，转速为180r/min；之后以15％的接种量接种至发酵培养基中，培养时间为6d，培养温度为45℃，期间每隔12h翻动一次发酵瓶。发酵结束后测量发酵瓶内的粗蛋白含量以及氨基氮含量。3)检测方法生物量测定方法采用平板稀释涂布法来计数。氨基态氮的测定采用甲醛法：精确称取油桐饼粕5g于250ml烧杯中，加入40ml蒸馏水。电炉加热煮沸2-3min。冷却至室温，上清液转移定容至50ml容量瓶，吸取10ml上清液，使用ph计调至8.20后加入甲醛溶液10ml，用0.5mol/l氢氧化钠标准溶液滴定至9.20为终点，记下消耗氢氧化钠体积并计算氨基态氮含量。同时做试剂空白试验，计算方法如下：式中：y—氨基态氮含量(以氮计)/g；v0—样品加入甲醛后用去氢氧化钠标准溶液数/ml；v—试剂空白加入甲醛后好用氢氧化钠标准溶液数/ml；vl—吸取稀释液数/ml；n—naoh标准溶液的浓度/(mol/l)；0.014—消耗1mlnaoh标准溶液相当氮的毫克当量/g。4)检测结果指标发酵前发酵后氨基态氮16.52mg/g420.81mg/g短小芽孢杆菌生物量02.1×1019cfu/g从检测结果可以明显的看出，氨基态氮以及短小芽孢杆菌生物量在发酵后有了明显的提高，发酵6天后氨基态氮的量由发酵前的16.5mg/g提高到421mg/g，氨基氮含量较之前增长了25.47倍，短小芽孢杆菌生物量也达到了2.1×1019cfu/g说明该菌种在油桐饼粕中生长发酵情况良好，降解油桐饼粕中蛋白质(用蛋白分解为氨基态氮的量来表示)的效果好，且能够耐受油桐饼粕中的有毒物质。以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。序列表<110>中南林业科技大学<120>一株短小芽孢杆菌菌株及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1450<212>dna<213>短小芽孢杆菌cfc-5(bacilluspumiluscfc-5)<400>1gggcaggcggctgctatacatgcagtcgagcggacagaagggagcttgctcccggatgtt60agcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccggg120aaaccggagctaataccggatagttccttgaaccgcatggttcaaggatgaaagacggtt180tcggctgtcacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctca240ccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacac300ggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgac360ggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaag420aacaagtgcaagagtaactgcttgcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaa480ctacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcg540taaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggag600ggtcattggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcg660gtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaac720tgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgc780cgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgca840ttaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacggggg900cccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggt960cttgacatcctctgacaaccctagagatagggctttcccttcggggacagagtgacaggt1020ggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgc1080aacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaa1140accggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacac1200gtgctacaatggacagaacaaagggctgcgagaccgcaaggtttagccaatcccacaaat1260ctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaa1320tcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcaca1380ccacgagagtttgcaacacccgaagtcggtgaggtaacctttatggagccagccgccgaa1440gtggcaagtt1450当前第1页12