本发明涉及一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，属于微藻细胞养殖技术领域。
背景技术
螺旋藻(spirulina)又名蓝藻，具有减轻癌症放疗、化疗的毒副反应、提高免疫功能，降低血脂等功效，它富含丰富的维生素、蛋白质、不饱和脂肪酸、微量元素，尤其它含有的蛋白质是螺旋藻的主要营养物质。目前螺旋藻已成为食品界备受关注的蛋白质源，认为螺旋藻是最具有潜力生产单细胞蛋白质的藻类。
近几十年来，国内外对螺旋藻藻细胞蛋白质分离、提取和应用研究，或将藻蛋白质酶解成多肽用于保健品和食品添加。一般文献报道，藻细胞蛋白质含量60～70％左右，然而在企业规模化生产大部分产品的蛋白质含量为50-60％，另外，本申请发明人发现在制备生产gg时蛋白质的含量会很低。蛋白质含量是藻产品重要指标之一，食品藻粉国家标准蛋白质含量≥55％。可见，提高藻蛋白质含量对提高藻产品的质量、开发新产品和藻蛋白资源的利用具有重要意义。
目前在单纯生产螺旋藻藻蛋白时，提高藻细胞蛋白质含量的研究比较多，比如李博生等人研究的促进螺旋藻细胞积累蛋白质的方法，陈填烽等人对分次加硒法培养高富硒量螺旋藻及其对藻体蛋白质含量影响的研究，而对于在生产甘油葡萄糖苷(gg)时，提高蛋白质的含量的研究较少，并且两者同时提高具有一定的难度。
因此，目前迫切需要寻找合适的养殖方法使在生产gg时恢复蛋白质的含量，以满足获得甘油葡萄糖苷藻细胞养殖的产业化应用以及满足国家标准蛋白质含量≥55％的要求。
技术实现要素：
针对以上现有技术，本发明人在研究螺旋藻生产gg的过程中，发现藻细胞中的蛋白质的含量下降非常明显，仅为40％左右，远低于蛋白质含量≥55％的国家标准，即常规工艺生产gg后获得的螺旋藻藻粉不能够用于商品销售，只能成为生产甘油葡萄糖苷的副产品。本发明是基于这一发现，才提出本发明的一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，为此，本发明人在不影响藻细胞生长和甘油葡萄糖苷合成的前提下，通过改进培养工艺，将藻粉的蛋白质的含量提高，使其满足国家标准≥55％的要求，使得该工艺条件下获得的藻粉及gg均可作为产品进行销售。
基于此，本发明具体采用以下技术方案：
在本发明的第一个方面，提供一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)藻细胞和蛋白质初始积累阶段：该阶段使用的培养基不额外加入盐胁迫所使用的胁迫物；
(2)藻细胞合成甘油葡萄糖苷阶段：第一阶段结束后，在培养基中加入相应浓度的盐胁迫所需的胁迫物，此阶段藻细胞开始合成gg；
(3)藻细胞蛋白质恢复阶段：第二阶段结束后，将藻细胞采收并分离gg，剩余的藻细胞投入与第一阶段相同的新鲜培养基中培养，随后收集藻细胞获得藻粉。
在本发明的第二个方面，提供一种甘油葡萄糖苷和藻蛋白质的制备方法，该方法包括一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法的步骤。
在本发明的第三个方面，还保护采用上述方法制备得到的甘油葡萄糖苷和/或蛋白质产品。
与现有技术相比，本发明的技术方案的有益效果是：
本发明提供了一种大规模培养藻细胞合成甘油葡萄糖苷过程中提高藻细胞蛋白质含量的工艺。采用该工艺不仅能够获取较高产量的甘油葡萄糖苷，而且最终收获的藻粉的蛋白质含量大于60％(w/w)，满足国家标准≥55％的要求。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
术语解释：
微藻：一般是指那些在显微镜下才能辨别形态微小的藻类。
正如背景技术所介绍的，现有技术中藻细胞的养殖工艺存在一定的不足，使得在生产gg的过程中损失大量的微藻蛋白质，无法满足国家标准蛋白质含量≥55％的要求，为了解决如上的技术问题，本发明提出了一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)藻细胞和蛋白质初始积累阶段：该阶段使用的培养基不额外加入盐胁迫所使用的胁迫物，培养藻细胞3～7天；
(2)藻细胞合成甘油葡萄糖苷阶段：第一阶段结束后，在培养基中加入相应浓度的盐胁迫所需的胁迫物，此阶段藻细胞开始合成gg，在该阶段培养时间为大于3天，优选的为5-7天；
(3)藻细胞蛋白质恢复阶段：第二阶段结束后，将藻细胞采收并分离gg，剩余的藻细胞投入与第一阶段相同的新鲜培养基中培养3-10天，随后收集藻细胞获得藻粉。
其中，步骤(1)是制造大量的藻细胞和积累蛋白质的过程，步骤(2)是诱导、积累gg的过程，步骤(3)是对蛋白质含量恢复的过程。
步骤(1)～(3)使用的反应器不限，可以是密闭式反应器，也可以是开放式跑道池。
在本发明中，所述藻细胞的种类为绿藻、硅藻、红球藻、杜氏藻、小球藻或螺旋藻等，种类不受限制。在本发明的最优选的具体实施方式中，所述藻细胞的种类为螺旋藻。
在本发明优选的实施方式中，所述胁迫物为能够改变细胞渗透压的物质，该物质可以是无机盐和/或有机盐的一种或多种组合。
进一步的，所述无机盐为氯化钠、硫酸钠、氯化钾或其他无机盐类中的一种或多种；所述有机盐为甲酸钠、乙酸铵或其他有机盐类中的一种或多种。
在本发明优选的实施方式中，各培养阶段所述培养基为淡水培养基，所述淡水培养基中含有氮、磷、铁、镁、钠、钾以及微藻成长所需要的微量元素，比如常用的bg-11培养基或者zarrouk培养基(详见表1和表2)等。该淡水培养基能够使得藻细胞大量的繁殖，为大量合成、积累gg和蛋白质作基础。本公开不限于上述列举的淡水培养基。
步骤(1)中的“额外”指的是不包含培养基之内的无机盐和/或有机盐。
在本发明的一个具体的实施方式中，步骤(1)和(3)中，采用的是zarrouk培养基，而在步骤(2)中，在zarrouk培养基中加入盐胁迫所需浓度的胁迫物。
表1zarrouk培养基配方
表2母液配方
本发明选取了适宜波长的光照和碳源，以供光合作用。在本发明优选的实施方式中，各个阶段的光照光波长范围均为400～700nm，经试验发现，微藻细胞通过特定范围波长的光照能够增加其gg和蛋白质的含量。
对于碳源，在本发明优选的实施方式中，选用含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为10％(v/v)以内，优选的，二氧化碳的浓度为1～5％(v/v)，或者选用无机碳酸盐，或者同时选用含有二氧化碳的混合空气与无机碳酸盐。
光源条件除了前述的光合成所需要的波长范围的光能以外，虽然连续光照也能够促进gg的积累，但是与连续光照相比，间歇光照更能促进gg的积累，温度差也更能促进gg的积累。在间歇光照的暗反应过程中，通入的二氧化碳混合气中降低氧气浓度更能促进gg的积累。
因此，在本发明优选的实施方式中，各个培养阶段的光照条件采用间歇光照，光暗比为(1～2):(1～2)，光照时间6-18小时，黑暗时间6-18小时，光强500-3000μe·m-2·s-2。
进一步的，在间歇光照的暗反应过程中，将氧气浓度降低至1～2％(v/v)，经过大量实验验证，在间歇光照的暗反应过程中，通入的二氧化碳混合气中降低氧气浓度更能促进gg的积累。
在本发明优选的实施方式中，各个阶段的培养温度为：15-40℃，优选温度范围为20-40℃，黑暗期间温度设置15-25℃，光照期间温度设置25-40℃。
在藻细胞合成甘油葡萄糖苷阶段中，作为细胞培养使用的培养基具有既要保证藻细胞的成长同时，又要让藻细胞内合成gg，除了步骤(1)中所述微藻成长所需的营养元素以外，还需要增加对细胞形成胁迫条件，诱导gg合成反应的物质，通常是选用能够改变细胞渗透压的物质，比如300～1500mm浓度的氯化钠，或者氯化钾等，也不限于前述物质，只要能够诱导gg合成反应都可以。在本发明优选的实施方式中，在步骤(2)的盐胁迫培养阶段中，所述胁迫物在培养基中的浓度为500～1000mmol/l。
在本发明优选的实施方式中，步骤(3)中，分离gg的方法为低渗萃取分离方法。低渗萃取分离方法采用的分离液为低渗溶液，当细胞膜两边的溶液出现一定的浓度差时，产生溶液渗透压，发生渗透作用，比细胞内渗透压低的溶液称低渗溶液，如蒸馏水等。
本发明人发现，不同的培养方法和培养条件对对藻细胞内蛋白质的含量影响较大，本发明通过特定的培养方法(包括昼夜组合方式、培养藻种后高盐度养殖，高光条件等)，在不影响藻细胞生长和甘油葡萄糖苷合成的前提下，获得了较高蛋白质含量的藻粉。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
本发明的具体实施例中采用下述方法进行检测藻细胞内gg含量，该方法包括提取方法和检测方法：
其中，提取方法包括以下步骤：
(1)取2ml藻液，10,000rpm/min离心30min，将沉淀与上清液分开。
(2)向细胞沉淀加入200μl水混匀，随后加入800μl无水乙醇再次混匀，65℃水浴4h。
(3)10,000rpm/min离心10min，弃沉淀，上清用n2吹干，加入合适的ddh2o稀释后测定。
gg检测方法包括以下步骤：
(1)将样品进行适当的稀释。
(2)稀释液使用0.22μm的滤器进行过滤获得离子色谱检测前样品。
(3)使用离子色谱ics-5000+(thermofisher)进行样品测定，检测器为配套的电化学检测器，柱子为内径4×250mm的dinextmcarbopactmpa10色谱柱。使用前柱子用25mmnaoh在1.0ml/min条件下平衡，待电化学检测器的基线稳定后开始样品测定。
本发明的具体实施例中采用常规的凯氏定氮法检测蛋白质的含量。
实施例1
一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)藻细胞和蛋白质初始积累阶段：
将该藻细胞接种于淡水培养基zarrouk(详见表1和表2)中，初始接种浓度为0.2g/l，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：25℃，光照程序为：持续光照，光照强度为500μe·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3vvm，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
此阶段的培养时间为5-7天。
(2)藻细胞合成甘油葡萄糖苷阶段：
藻细胞选用上述步骤(1)培养后成长起来的细胞，培养条件如步骤(1)所述，区别在于：培养基为步骤(1)中的淡水培养基中加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为800mmol/l。
此阶段的培养时间为7天。
(3)藻细胞蛋白质恢复阶段：
第二阶段结束后，将藻细胞采收并低渗萃取分离gg，剩余的藻细胞投入与第一阶段一致的新鲜培养基中培养5天，随后收集藻细胞获得螺旋藻粉，最终收获的藻粉的蛋白质含量大于60％，收取的gg产量占细胞干重的16％。
实施例2
一种生产甘油葡萄糖苷过程中恢复蛋白质含量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)藻细胞和蛋白质初始积累阶段：
将该藻细胞接种于淡水培养基zarrouk(详见表1和表2)中，初始接种浓度为0.2g/l，控制培养该藻细胞的淡水培养基的温度程序为：28℃，光照程序为：光暗比为1:1，光暗时长分别为12小时和12小时，光强650μe·m-2·s-2，光波长范围为400～700nm，通气量为：0.3vvm，所通入的气体为含有二氧化碳的混合空气，二氧化碳浓度为5％(v/v)。
此阶段的培养时间为5天。
(2)藻细胞合成甘油葡萄糖苷阶段：
藻细胞选用上述步骤(1)培养后成长起来的细胞，培养条件如步骤(1)所述，区别在于：培养基为步骤(1)中的淡水培养基中加入氯化钠，使其在淡水培养基中的浓度为900mmol/l。
此阶段的培养时间为7天。
(3)藻细胞蛋白质恢复阶段：
第二阶段结束后，将藻细胞采收并低渗萃取分离gg，剩余的藻细胞投入与第一阶段一致的新鲜培养基中培养5天，随后收集藻细胞获得螺旋藻粉，最终收获的藻粉的蛋白质含量大于60％，收取的gg产量占细胞干重的17％。
实施例3
将螺旋藻接种至淡水培养基zarrouk(详见表1和表2)中，培养至第3天时，先取500ml样品，随后加入氯化钠进行盐胁迫，使淡水培养基中的氯化钠浓度为900mm，样品经过采收、洗涤和冻干获取样品s1，当盐胁迫培养至第7天时，再次取样经过采收、洗涤和冻干获取样品s2，(取样冻干，s2)，剩余藻细胞经过采收、洗涤(甘油葡萄糖苷提取)后，将全部藻泥再次接种至淡水培养基zarrouk中培养3天，此时所获得的冻干的样品记为s3。根据表3，藻细胞在经历了3天的无盐胁迫培养(第一阶段)再进行盐胁迫(第二阶段)培养，蛋白质不但没有降低有了大幅提高，随后的第三阶段的恢复培养，蛋白质含量虽继续升高但并不显著。因此，在整个工艺中，第一阶段的无盐胁迫培养对于最终的蛋白质含量具有重要影响。
注：其它培养条件如实施例2所示。
表3不同培养阶段藻细胞蛋白质含量
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。