本发明涉及一种可联产丹参素和丙氨酸的工程菌及其应用，属于生物工程
技术领域：
。
背景技术：
提取自丹参的丹参素，学名r-(+)-3-(3，4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸、d-(+)-β-(3，4-二羟基苯基)乳酸，英文名为：danshensu、d-dss、r-dss、(r)-(+)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)-lacticacid、(r)-(+)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-hydroxypropanoicacid，是一种右旋酚酸类化合物。目前不存在天然的左旋丹参素。丹参素是丹参水提液中的重要有效成份，国内于1980年从丹参水提液中得到并鉴定了结构(丹参水溶性有效成分的研究，ⅱ.d(+)β(3，4-二羟基苯基)乳酸的结构，上海第一医学院学报，1980，05(7)，384-385)，各种研究表明丹参素具有重要的药理药效作用，在心脑血管疾病的治疗等方面具有独特治疗作用。当前丹参素主要从丹参中提取得到(专利cn200810038853.9)。丹参素在丹参中的含量较低，并且丹参素种植成本高且产量有限，因此当前丹参素不仅价格高而且远远无法满足市场的需求。专利cn201310559498.0提出了一种构建大肠杆菌基因工程菌利用葡萄糖发酵产丹参素的方法，由于合成代谢途径涉及利用羟基化酶，该酶很容易使代谢过程产物氧化而影响丹参素的产率，同时由于大肠杆菌发酵是高耗氧过程，也会氧化丹参素，因此当前该方法产率较低，成本将会高于植物提取过程。专利cn201210190171.6提出了水解丹酚酸b生产丹参素的方法，丹酚酸b需从丹参提取，并且化学水解过程有大量副反应，同样不适用于规模化生产。手性合成丹参素(专利cn201210420488.4)的催化剂极为昂贵，当前也仅停留在实验室水平。早在1988年roth等人提出了先以化学法处理左旋多巴得到对应的3，4-二羟基苯丙酮酸，再酶法合成s-(+)-3-(3，4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸(s-dss，l-dss)的方法(enzymaticsynthesisof(s)-(-)-3-(3，4-dihydroxyphenyl)lacticacid，arch.pharm.(weinheim)321，179-180(1988))。z.findrik，等人采用蛇毒氨基酸氧化酶将左旋多巴转化成3，4-二羟基苯丙酮酸，然后再用d-乳酸脱氢酶还原生成d-(3，4-二羟基苯基)乳酸(modellingandoptimizationofthe(r)-(+)-3,4-dihydroxyphenyllacticacidproductioncatalyzedwithd-lactatedehydrogenasefromlactobacillusleishmanniiusinggeneticalgorithm，chem.biochem.eng.q.19(4)351–358(2005))。这两种方法制备3，4-二羟基苯丙酮酸中间体的成本较高，且操作复杂。技术实现要素：基于目前各种方法的缺陷，本发明提了了一种基于转氨酶的光学纯的丹参素生产方法，并构建了多酶共表达的工程菌，实现了丹参素的高效生产。本发明所要解决的技术问题是提供一种能低成本生产丹参素的重组菌。同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。本发明的第一个目的是提供能低成本生产光学纯丹参素的重组菌；所述重组菌同时表达3种酶，分别为l-α-氨基酸转氨酶、α-羟基羧酸脱氢酶和l-乳酸脱氢酶，并在宿主大肠杆菌的基础上敲除了酚类化合物分解相关的基因。在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为d型α-羟基羧酸脱氢酶，来自lactobacillusplantarumatcc14917、enterococcusfaecalisatcc35038或者lactobacillusfermentumatcc14931。在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为l型α-羟基羧酸脱氢酶，来自bacilluscoagulansdsm1、weissellaconfusastraindsm20196或者lactobacillusfermentumatcc14931。在一种实施方式中，所述α-羟基羧酸脱氢酶为d-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.为wp_003643296.1、wp_002335374.1、或eei22188.1的序列；α-羟基羧酸脱氢酶为l-α-羟基羧酸脱氢酶，其氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_013858488.1、wp_003607654.1或wp_035430779.1的序列。在一种实施方式中，d-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno.为nz_gl379761region:complement(533562..534560)、nz_kb944641region:161892..162830、acgi01000078region:20793..21791的序列；l-α-羟基羧酸脱氢酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno.为nz_atum01000014region:39316..40254、nz_jqay01000006region:69708..70640、nz_gg669901region:45517..46470的序列。在一种实施方式中，所述l-乳酸脱氢酶来自lactococcuslactisatcc19257。在一种实施方式中，所述l-乳酸脱氢酶的氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_003131075.1序列。在一种实施方式中，所述l-乳酸脱氢酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno为：nz_jxjz01000017region:18532..19509的序列。在一种实施方式中，所述l-α-氨基酸转氨酶来自escherichiacolibl21、lactobacillusplantarumatcc14917、lactobacillusparacaseiatcc334。在一种实施方式中，l-α-氨基酸转氨酶的氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_000462687.1、wp_000486988.1、wp_003643296.1、yp_806114.1的序列。在一种实施方式中，l-α-氨基酸转氨酶的核苷酸序列是ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(989603..990793)、nc_012892region:4174517..4175710、nz_gl379768region:complement(121900..123087)、nc_008526region:complement(840419..841594)的序列。在一种实施方式中，所述重组菌，是将编码l-α-氨基酸转氨酶、α-羟基羧酸脱氢酶和l-乳酸脱氢酶的基因，都连接到质粒上，构建得到三基因共表达重组质粒，然后将重组质粒转化相应菌株，得到重组工程菌。在一种实施方式中，所述重组菌是以escherichiacolibl21(de3)为宿主构建得到的。在一种实施方式中，所述酚类化合物分解相关的基因为hpad、mhpb中的任意一种或者两种组合。在一种实施方式中，所述酚类物质分解基因的核苷酸序列是ncbi上,ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(4505585..4506436)和nc_012892region:339806..340750。在一种实施方式中，所述重组菌还强化表达了乳酸转运基因、nad合成基因、磷酸吡哆醛合成基因一种或者多种。在一种实施方式中，所述强化表达是通过将escherichiacolibl21(de3)基因组上所要强化表达的基因前增加组成型启动子。在一种实施方式中，所述强化表达的基因为lldp(乳酸转运基因)、nada(nad合成基因)、pdxj(磷酸吡多醛合成基因)中的任意一种或多种。在一种实施方式中，所述lldp在ncbi上accessionno为：nc_012892region:3646638..3648293；nada为nc_012892region:740487..741530；pdxj为nc_012892region:complement(2567591..2568322)。本发明的第二个目的是提供一种生产丹参素的方法，所述方法是利用本发明的重组菌。在一种实施方式中，所述生产丹参素，是进行全细胞转化生产。在一种实施方式中，所述全细胞转化生产的体系中，包括细胞湿重1-200g/l，左旋多巴1-200g/l，l-乳酸1-200g/l，ph6.0-9.0；于15-40℃反应，时间1-48小时。本发明的有益效果：本发明构建了一种新型的三酶共表达基因工程菌。本发明选择的(d/l)-α-羟基羧酸脱氢酶均具有底物专一性差，光学专一性强的特点，可生产光学纯的d-丹参素和l-丹参素，同时联产l-丙氨酸该生产过程简单且原料易得，具有良好的工业化应用前景。具体实施方案本发明的工程菌的功能核心在于可以同时表达3种酶，分别为l-α-氨基酸转氨酶、α-羟基羧酸脱氢酶和l-乳酸脱氢酶。其原理为：在工程菌全细胞内，l-乳酸脱氢酶以菌体内的nad为辅酶将l-乳酸脱氢生成丙酮酸和nadh；左旋多巴被l-α-氨基酸转氨酶脱氨生成3,4-二羟基苯丙酮酸，丙酮酸则转氨生成丙氨酸；α-羟基羧酸脱氢酶利用乳酸脱氢过程生成的nadh将3,4-二羟基苯丙酮酸还原成丹参素、同时实现了辅酶nad的再生。进一步地，同时敲除或强化表达大肠杆菌基因组上的相将关基因促进底物的转运及减少产物的分解。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：1.本发明所涉及的菌株及质粒购自美国菌种保藏中心atcc的lactobacillusplantarumatcc14917、enterococcusfaecalisatcc35038、lactobacillusfermentumatcc14931、lactobacillusparacaseiatcc334、escherichiacolibl21(de3)、lactococcuslactisatcc19257。购自德国微生物菌种保藏中心dsmz的bacilluscoagulansdsm1、weissellaconfusastraindsm20196。购自novagen公司的petduet-1、pacycdue-1、pcoladuet-1、prsfduet-1质粒和escherichiacolibl21(de3)。2.大肠杆菌中相关基因的敲除及组成型强化表达(1)大肠杆菌酚类化合物分解相关的基因的敲除本发明中的酚类物质都极易被大肠杆菌中的酶分解，根据文献(biodegradationofaromaticcompoundsbyescherichiacoli，microbiolmolbiolrev.2001,65(4):523–569.)，将相关基因敲除，避免产物和底物的分解。选择的基因是hpad和mhpb,ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(4505585..4506436)和nc_012892region:339806..340750。(2)大肠杆菌乳酸转运基因的组成型强化表达在全细胞转化过程中，需把底物转运至细胞内才能进行，增强l-乳酸转运蛋白有助于快速并长时间维持胞内底物的高浓度，有利于反应的进行。选择l-乳酸转运相关的基因是lldp，ncbi上accessionno为：nc_012892region:3646638..3648293。多巴与芳香族氨基酸类似，细胞培养过程中需要吸收氨基酸等，因此菌体本身会表达大量的氨基酸转运蛋白，无须再强化表达。(3)大肠杆菌辅酶合成相关重要基因的组成型强化表达在α-羟基羧酸脱氢酶还原过程中需要以nadh为辅酶，强化表达大肠杆菌nad合成途径的关键酶，可以提高菌体内的nad水平，从而有利于丹参素的生成。选择的基因有nada。ncbi上accessionno为：nc_012892region:740487..741530。磷酸吡多醛(胺)是l-α-氨基酸转氨酶的辅酶，过表达该辅酶途径中的核心基因pdxj,有利于左旋多巴的合成。ncbi上accessionno为：nc_012892region:complement(2567591..2568322)。3.酶的选择(1)l-α-氨基酸转氨酶的选择l-α-氨基酸转氨酶广泛存在于细菌、真菌、哺乳动物细胞中。通常活力最高的是以α-酮戊二酸或草酰乙酸为受氨体的转氨酶，而对应生成的谷氨酸或天冬氨酸价值均较低，综合考查20种天然l-氨基酸发现，丙氨酸的价格较高，并且其前体丙酮酸可以由廉价的乳酸生成。因此本申请选择以将乳酸脱氢生成丙酮酸，丙酮酸进一步作为氨的受体，从而实现丙氨酸与丹参素的联产。从lactobacillusplantarumatcc14917、lactobacillusparacaseiatcc334中分别克隆得到l-α-氨基酸转氨酶基因lpt、lct，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.为wp_003643296.1、yp_806114.1的序列。从escherichiacolibl1(de3)中克隆得到两个l-α-氨基酸转氨酶基因ect1、ect2，其氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_000462687.1、wp_000486988.1。(2)α-羟基羧酸脱氢酶的选择根据最适底物的情况，α-羟基羧酸脱氢酶包含有乳酸脱氢酶、α-羟酸异己酸脱氢酶、扁桃酸脱氢酶、乙醛酸还原酶等，这些酶能广泛作用于多种底物生成α-羟基羧酸，通常根据其最适作用的底物来命名。本发明从中选择光学性强且对3，4-二羟基苯丙酮酸具有较强活性的酶，用于d或l丹参素的生产。从lactobacillusplantarumatcc14917、enterococcusfaecalisatcc35038、lactobacillusfermentumatcc14931中分别克隆得到d型α-羟基羧酸脱氢酶基因lpldhd、efmdhd、lfldhd，其氨基酸序列是ncbi上accessionno.为wp_003643296.1、wp_002335374.1、eei22188.1的序列。从bacilluscoagulansdsm1、weissellaconfusastraindsm20196、lactobacillusfermentumatcc14931中分别克隆得到l型α-羟基羧酸脱氢酶基因bcldhl、wcldhl、lfldhl，其氨基酸序列是ncbi上accessionno为wp_013858488.1、wp_003607654.1、wp_035430779.1的序列。(3)l-乳酸脱氢酶的选择l-乳酸是最为廉价的有机酸，脱氢后成的丙酮酸再转氨生成的丙氨酸具有较高的附加值。l-乳酸脱氢酶广泛存在多种微生物中，以l-乳酸为底物将l-乳酸上生成的氢传递给辅酶nad或nadp，从而生成nadh或nadph。nadh或者nadph可以作为前述的α-羟基羟酸脱氢酶的供氢体。通常来讲以nad(nadp)为辅酶的乳酸脱氢酶更趋向于以丙酮酸为底物合成乳酸，但当乳酸过量等情况下乳酸脱氢酶会脱掉乳酸的氢生成丙酮酸。本发明从lactococcuslactisatcc19257中得到l-乳酸脱氢酶基因llldh(氨基酸序列是wp_003131075.1)。4.三酶共表达体系的构建及细胞的培养目前大肠杆菌多基因共表达有多种方法(大肠杆菌多基因共表达策略，中国生物工程杂志，2012，32(4):117-122)，本发明采用刘向磊(合成生物学技术改造大肠杆菌生产莽草酸及白藜芦醇，2016，上海医药工业研究院，博士论文)所述方法构建，每个基因前均包含t7启动子和rbs结合点，每个基因后有一个t7终止子。理论上来讲因为每个基因前都有t7和rbs，因此基因的表达强度受排列次序的影响不大。每个质粒上包含三个基因(l-α-氨基酸转氨酶、(d/l)-α-羟基羧酸脱氢酶、l-乳酸脱氢酶对应的基因)，将构建好的质粒热转导入大肠杆菌感受态细胞中，并涂布于抗生素固体平板上，筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。细胞的培养：根据经典的重组大肠杆菌培养及诱导表达方案，将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到lb发酵培养基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l)中，当细胞od600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mm的iptg，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。5.全细胞转化生产纯丹参素细胞转化生产的体系为：细胞湿重为1-200g/l，左旋多巴浓度为1-200g/l，l-乳酸浓度为1-200g/l，ph6.0-9.0，于15-40℃反应，时间1-48小时。转化结束后液相色谱测定丹参素产量及构型。左旋多巴溶解度较低，高浓度情况下是含有不溶物的混悬液。6.样品的检测分析丹参素和l-丙氨酸的定量分析：转化液采用perkinelmerseries200高效液相色谱仪检测分析，配示差折光检测器。色谱条件为：流动相是甲醇-0.1％甲酸水(40:60)、采用汉邦megresc18色谱柱(4.6×250mm，5μm)，流速1ml/min、柱温30℃、进样量20μl。手性分析：perkinelmerseries200高效液相色谱仪检测分析，配示紫外检测器，chiralcelod-h手性柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷:异丙醇:三氟乙酸＝80:20:0.1，流速为0.5ml/min，柱温25℃，进样量20μl，检测波长280nm。丹参素溶解度较低，转化过程如有结晶析出，则稀释后测定。丹参素的光学纯度通过对映体过量值(％e.e)来评价。当生产r-丹参素时，对映体过量值％e.e＝[(sr-ss)/(sr+ss)×100％]当生产s-丹参素时，对映体过量值％e.e＝[(ss-sr)/(sr+ss)×100％]式中ss为转化液中s-丹参素的峰面积，sr为转化液中r-丹参素的液相色谱峰面积。为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行详细的说明。应当说明的是，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1根据文献largescalevalidationofanefficientcrispr/cas-basedmultigeneeditingprotocolinescherichiacoli.microbialcellfactories,2017,16(1):68所述的方法将escherichiacolibl21(de3)上的hpad和mhpb进行单或双敲除。其中，本发明所用基因敲除的质粒为pcasred与pcrispr-gdna(hpadsgrna)与同源臂(hpaddonor)一起导入escherichiacolibl21(de3)上，cas9/sgrna诱发宿主在hpad基因位点发生双链断裂，重组酶red将hpaddonor整合到hpad基因上，实现基因的敲除，并测序验证。hpadsgrna、hpaddonor、mhpbsgrna、mhpbdonor分别如序列表seqidno:16、seqidno:17、seqidno:25、seqidno:26所示。mhpb以同样的方式敲除。配置ph为7的溶液，左旋多巴或d-丹参素4g/l，湿菌体量200g/l，35℃放置10小时后测定浓度，表1中显示了反应体系中，左旋多巴和d-丹参素的剩余量。表1不同菌株对底物和产物分解后的剩余浓度左旋多巴g/ld-丹参素g/lescherichiacolibl21(de3)1.71.8escherichiacolibl21(δhpadδmhpb,de3)3.63.4escherichiacolibl21(δhpad,de3)2.52.9escherichiacolibl21(δmhpb,de3)2.11.8很显然escherichiacolibl21(δhpadδmhpb,de3)效果最好，将之命名为escherichiacolihm。实施例2l-α-氨基酸转氨酶的筛选，分别从大肠杆菌和乳杆菌中克隆多种l-α-氨基酸转氨酶基因，并在escherichiacolibl21(de3)中得到表达。诱导表达方法：将重组大肠杆菌按体积比为2％的量转接到lb发酵培养基(蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、nacl10g/l)中，当细胞od600达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4mm的iptg，在20℃诱导表达培养8h。诱导表达结束后，20℃、8000rpm、20分钟离心收集细胞。破胞测定粗酶液活性，以丙酮酸为氨受体时比较各种酶的活性，根据文献(转氨酶催化不对称合成芳香族l-氨基酸.生物工程学报，2012，28(11):1346-1358.)所述的方法测定l-α-氨基酸转氨酶的活性，结果如表1所示。因此选择来源于大肠杆菌的l-α-氨基酸转氨酶ect1用于左旋多巴的转氨脱氨是最佳的。表2不同l-α-氨基酸转氨酶的活性比较重组菌活性u/mlescherichiacolibl21/petduet-1-ect12.2escherichiacolibl21/petduet-1-ect20.01escherichiacolibl21/petduet-1-lpt1.3escherichiacolibl21/petduet-1-lct0.5实施例3α-羟基羧酸脱氢酶酶学性质的比较。通常这种酶类也可能具有还原丙酮酸生成乳酸的能力，因此不能还原或极微弱还原丙酮酸的酶是比较好的。以丙酮酸为底物，比较了不同酶的还原能力，根据文献(粘质沙雷氏菌h3010发酵型d-乳酸脱氢酶基因的克隆表达、纯化及酶学性质研究.工业微生物,2012,42(04):30-37.)所述的方法测定以nad为辅酶还原丙酮酸的活性，实验结果如表3所示。表3各种α-羟基羧酸脱氢酶还原丙酮酸活性比较重组菌活性u/mlescherichiacolihm/petduet-1-lpldhd6.6escherichiacolihm/petduet-1-efmdhd0escherichiacolihm/petduet-1-lfldhd0.7escherichiacolihm/petduet-1-bcldhl5.2escherichiacolihm/petduet-1-wcldhl0.2escherichiacolihm/petduet-1-lfldhl6.3实施例4重组大肠杆菌构建：首先将编码l-乳酸脱氢酶、l-α-氨基酸转氨酶、α-羟基羧酸脱氢酶的基因，连接到质粒上。得到三基因共表达重组质粒，将质粒转化大肠杆菌escherichiacolihm，利用抗生素平板筛选得到阳性转化子，即得到重组大肠杆菌。将重组大肠杆菌诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体积中，细胞湿重为40g/l，左旋多巴浓度为40g/l，丙酮酸浓度为30g/l，ph8.0，于35℃反应，时间12小时。转化结束后液相色谱测定丹参素产量及构型。表4各种重组菌的比较实施例5采用文献largescalevalidationofanefficientcrispr/cas-basedmultigeneeditingprotocolinescherichiacoli.microbialcellfactories,2017,16(1):68所述的方法，将escherichiacolihm基因组上对应基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpda)前的中等表达强度组成型启动子(pg)，序列如seqidno:15所示。强化基因lldp表达时，以escherichiacolihm基因组为模板，以引物lldp-ff/lldp-fr、lldp-gpda-f/lldp-gpda-r、lldp-rf/lldp-rr,扩增出上游、启动子、下游序列，并以lldp-ff和lldp-rr为引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含lldpsgrna)一起转入escherichiacolihm后，cas9/sgrna诱发宿主在lldp基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到lldp基因之前，并测序验证。下表为引物名称与序列表序号的对应索引。表5引物名称与序列表序号对照名称序列表中编号lldpsgrnaseqidno:1lldp-ffseqidno:3lldp-frseqidno:4lldp-gpda-fseqidno:5lldp-gpda-rseqidno:6lldp-rfseqidno:7lldp-rrseqidno:8根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表5所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重5g/l，l-乳酸50g/l，左旋多巴20g/l，ph8.0，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间12小时。表6转化结果比较将效果最好的escherichiacolihm(pg-lldp)命名为escherichiacolihml。实施例6根据实例4的方法将escherichiacolihml中nada、pdxj基因前增加大肠杆菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(gpda)前的中等表达强度组成型启动子(pg)，序列如seqidno:15所示。然后再将质粒导入。强化基因nada表达时，以escherichiacolihml基因组为模板，以引物nada-ff/nada-fr、nada-gpda-f/nada-gpda-r、nada-rf/nada-rr,扩增出上游、启动子、下游序列，并以nada-ff和nada-rr为引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含nadasgrna)一起转入escherichiacolihml后，cas9/sgrna诱发宿主在nada基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到nada基因之前，并测序验证。强化基因pdxj表达时，以escherichiacolihml基因组为模板，以引物pdxj-ff/pdxj-fr、pdxj-gpda-f/pdxj-gpda-r、pdxj-rf/pdxj-rr,扩增出上游、启动子、下游序列，并以pdxj-ff和pdxj-rr为引物融合为含有gpda启动子的表达框。然后与质粒pcasred、pcrispr-gdna(含pdxjsgrna)一起转入escherichiacolihml后，cas9/sgrna诱发宿主在pdxj基因位点发生双链断裂，重组酶red将gpda启动子整合到pdxj基因之前，并测序验证。下表为引物名称与序列表序号的对应索引。表7引物名称与序列表序号对照基因改造完成后，将共表达质粒导入。根据实施例2所述的方法诱导表达，收集各类细胞进行转化分析，结果如表7所示。转化体系中全细胞转化体系为：细胞湿重为20g/l，l-乳酸100g/l，左旋多巴120g/l，ph9.0，温度为30℃，摇床转速250转/分钟；转化时间24小时。表8转化结果比较将最好的escherichiacolihml(pg-nada,pg-pdxj)命名为escherichiacolinl。实施例7根据实施例2所述诱导表达方法，将escherichiacolinl/pcoladuet-1-lfldhd-ect1-llldh诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重1g/l，l-乳酸1g/l，左旋多巴1g/l，ph6.0，温度为15℃，摇床转速250转/分钟；转化时间1小时。测定结果，r-丹参素浓度为77mg/l，e.e％>99.9。实施例8根据实施例2所述诱导表达方法，将表8中菌株诱导表达完成后收集菌体，于100ml反应体系中，细胞湿重200g/l，l-乳酸200g/l，左旋多巴200g/l，ph8.5，温度为40℃，摇床转速250转/分钟；转化时间48小时。将沉淀全部稀释溶解后测定结果。表9转化结果比较以上所述的酶及其共表达基因工程菌的改造和构建、菌体的培养基组成及培养方法和全细胞生物转化仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明，理论上来讲其它的细菌、丝状真菌、放线菌、动物细胞均可进行基因组的改造，并用于多基因共表达的全细胞催化。凡在本发明的原则和精神之内所作的任何修改、等同替换。序列表<110>江南大学<120>一种可联产丹参素和丙氨酸的工程菌及其应用<130>2018.3.15<160>26<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gattgccaccgtccacgagg20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2ttaacggcgtcggcttcggg20<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列<400>3aaatacaatctctgtaggttcttct25<210>4<211>50<212>dna<213>人工序列<400>4tcggccactcatcaacatgattcatgagtctgttgctcatctccttgtca50<210>5<211>50<212>dna<213>人工序列<400>5tgacaaggagatgagcaacagactcatgaatcatgttgatgagtggccga50<210>6<211>50<212>dna<213>人工序列<400>6cgtagttttgttgccagagattcatggttttctcctgtcaggaacgttcg50<210>7<211>50<212>dna<213>人工序列<400>7cgaacgttcctgacaggagaaaaccatgaatctctggcaacaaaactacg50<210>8<211>25<212>dna<213>人工序列<400>8taacacctgacccgcagtgtaaccg25<210>9<211>25<212>dna<213>人工序列<400>9tcgaatcctgcacgacccaccacta25<210>10<211>50<212>dna<213>人工序列<400>10tcggccactcatcaacatgattcatcgacattagcgtaatattcgctgtt50<210>11<211>50<212>dna<213>人工序列<400>11aacagcgaatattacgctaatgtcgatgaatcatgttgatgagtggccga50<210>12<211>50<212>dna<213>人工序列<400>12tgtctggatcaaacattacgctcatggttttctcctgtcaggaacgttcg50<210>13<211>50<212>dna<213>人工序列<400>13cgaacgttcctgacaggagaaaaccatgagcgtaatgtttgatccagaca50<210>14<211>25<212>dna<213>人工序列<400>14catccacggacaatgcgcgcagctg25<210>15<211>1100<212>dna<213>escherichiacolibl21(de3)<400>15atgaatcatgttgatgagtggccgatcgctacgtgggaagaaaccacgaaactccattgc60gcaatacgctgcgataaccagtaaaaagaccagccagtgaatgctgatttgtaaccttga120atatttattttccataacatttcctgctttaacataattttccgttaacataacgggctt180ttctcaaaatttcattaaatattgttcacccgttttcaggtaatgactccaacttattga240tagtgttttatgttcagataatgcccgatgactttgtcatgcagctccaccgattttgag300aacgacagcgacttccgtcccagccgtgccaggtgctgcctcagattcaggttatgccgc360tcaattcgctgcgtatatcgcttgctgattacgtgcagctttcccttcaggcgggattca420tacagcggccagccatccgtcatccatatcaccacgtcaaagggtgacagcaggctcata480agacgccccagcgtcgccatagtgcgttcaccgaatacgtgcgcaacaaccgtcttccgg540agcctgtcatacgcgtaaaacagccagcgctggcgcgatttagccccgacatagccccac600tgttcgtccatttccgcgcagacgatgacgtcactgcccggctgtatgcgcgaggttacc660gactgcggcctgagttttttaagtgacgtaaaatcgtgttgaggccaacgcccataatgc720gggcagttgcccggcatccaacgccattcatggccatatcaatgattttctggtgcgtac780cgggttgagaagcggtgtaagtgaactgcagttgccatgttttacggcagtgagagcaga840gatagcgctgatgtccggcggtgcttttgccgttacgcaccaccccgtcagtagctgaac900aggagggacagctgatagaaacagaagccactggagcacctcaaaaacaccatcatacac960taaatcagtaagttggcagcatcaccccgttttcagtacgttacgtttcactgtgagaat1020ggagattgcccatcccgccatcctggtctaagcctggaaaggatcaattttcatccgaac1080gttcctgacaggagaaaacc1100<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<400>16tatgcccgtcgatcgcgccc20<210>17<211>120<212>dna<213>人工序列<400>17ccaagatcacgcacgtaccgtcgatgtatctctctgaactgccagggaaaaaccacggtt60agatcagcaagcgttgccgggaaatgggcgtcgataccattatcgttttcgacacccact120<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列<400>18cgtcgcggtcagtaatgtga20<210>19<211>25<212>dna<213>人工序列<400>19gcagaagaagatggtcattggcaac25<210>20<211>50<212>dna<213>人工序列<400>20tcggccactcatcaacatgattcattcgcttaggcataaattgccggaac50<210>21<211>50<212>dna<213>人工序列<400>21gttccggcaatttatgcctaagcgaatgaatcatgttgatgagtggccga50<210>22<211>50<212>dna<213>人工序列<400>22tgacgcctaacagtaattcagccatggttttctcctgtcaggaacgttcg50<210>23<211>50<212>dna<213>人工序列<400>23cgaacgttcctgacaggagaaaaccatggctgaattactgttaggcgtca50<210>24<211>25<212>dna<213>人工序列<400>24tcacagcaaaacgcttcgccagaaa25<210>25<211>120<212>dna<213>人工序列<400>25tagcctgatatgcacgcttatcttcactgtctttcccactcgccgctggtgggatatgtc60aatggcgtgattgccagcgcccgcgagcgtattgcggctttctcccctgaactggtggtg120<210>26<211>20<212>dna<213>人工序列<400>26tcatcgagtacctcttgcgc20当前第1页12