一种筛选干细胞因子受体激酶抑制剂高通量筛选方法

一种筛选干细胞因子受体激酶抑制剂高通量筛选方法
【专利摘要】本发明发现了一种筛选干细胞因子受体激酶抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤：(1)干细胞因子受体激酶抑制剂筛选模型的建立与优化：进行激酶浓度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验；(2)阳性药验证模型可靠性：选用合适浓度的激酶，ATP Km，底物Km，激酶和底物每孔分别加入2μl，再按浓度梯度每孔加入4μl阳性药，加入2ul ATP开始反应，按优化时间室温孵育；每孔加入10μl终止液终止反应，室温孵育1小时后检测，分析数据得阳性药IC50；(3)高通量筛选模型验证：按照上述步骤操作，使用BiomekNXP自动化加样仪器和Multidrop自动分液器进行加样，计算Z因子。本发明的优点主要有：1)简便快捷；2)灵敏度高；3)结果稳定可靠，重现性好，可用于高通量筛选。
【专利说明】一种筛选干细胞因子受体激酶抑制剂高通量筛选方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于药理学领域，利用均相时间分辨荧光检测技术，构建了干细胞因子受 体酪氨酸激酶（Kit)抑制剂的高通量筛选模型，用于待测样品对Kit激酶抑制活性的高通 量检测。

【背景技术】
[0002] Kit是一种原癌基因，是HZ4猫科肉瘤病毒的胞浆逆转录病毒同源物，位于4号染 色体4qll_12,编码一种相对分子质量为145kD的跨膜糖蛋白，该蛋白属受体酪氨酸激酶家 族成员。Kit受体分为膜外区、跨膜区和胞质区三部分。Kit/SCF系统是蛋白激酶/磷酸酶 信号转导过程中的一个重要环节。正常情况下Kit受体的活化需要SCF参与，当Kit受体与 SCF的特异性结合后，触发Kit受体的同源二聚体化和细胞膜内酪氨酸残基的磷酸化，从而 将细胞外的信号转导至细胞内。Kit基因突变导致了Kit不依赖配体的自发性受体二聚体 化，引起Kit受体的持续激活，刺激细胞过度增殖和抗凋亡信号失控。己发现在许多恶性肿 瘤中均有Kit的高表达，包括胃肠道间质瘤、前列腺癌、生殖细胞瘤、乳腺癌及小细胞肺癌 等。抑制Kit介导的信号转导途径以达到治疗肿瘤的目的已成为近年来肿瘤治疗的热点。
[0003] 时间分辨突光技术（time-resolvedfluorescence,TRF)是基于镧系元素如铕 (Eu)、钐（Sm)、镝（Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之 间距离小于l〇nm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均 相时间分辨突光（homogeneoustime-resolvedfluorescence，HTRF)技术是法国Cisbio 公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短（一般为几毫 秒），为了避免短暂的荧光干扰，Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能 量供体，受体经过别藻蓝蛋白（allophycocyanin)或突光素修饰，供体在能量转移时就可 以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消 失时间成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧 光引起的背景干扰。
[0004] 目前，已有多种Kit激酶抑制剂的筛选方法，多利用ELISA法来筛选Kit激酶抑制 齐[J，但是此方法费时费力，难以做到高通量筛选。因此，建立方便快捷准确的检测方法，特别 是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。


【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于建立一种基于均相时间分辨荧光的Kit激酶抑制剂高通量筛 选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
[0006] 本发明的技术方案：采用均相时间分辨荧光方法建立体外Kit激酶抑制剂高通量 筛选模型，初筛，复筛发现一类具有抑制Kit激酶活性的候选化合物。具体步骤如下：
[0007] 本发明利用均相时间分辨荧光的方法建立了一种Kit激酶抑制剂高通量筛选模 型。
[0008] 步骤一 ：Kit激酶抑制剂筛选模型的建立与优化。
[0009] 步骤二：阳性药验证模型可靠性。
[0010] 步骤三：高通量筛选模型验证。

【专利附图】

【附图说明】：
[0011] 图1 :Kit激酶浓度梯度优化实验结果。（n= 3，；土S)
[0012] 图2 :Kit激酶温孵时间优化实验结果。（n= 3, ；土S)
[0013] 图3 :Kit激酶底物浓度优化实验结果。（n= 3, )
[0014] 图4 :Kit激酶ATP浓度优化实验结果。（n= 3,S土)
[0015] 图5 :阳性药十字孢碱对Kit激酶的抑制曲线图。（n= 3，；土S〇
[0016] 图6 :Kit激酶抑制剂高通量筛选模型信号检测窗口。
[0017] 图7:高通量筛选Z'值分布。

【具体实施方式】
[0018] 以下结合【专利附图】

【附图说明】本发明的【具体实施方式】：
[0019] 1.Kit激酶抑制剂筛选方法建立
[0020] (1)实验材料
[0021]Kit激酶检测试剂盒（Cisbio,法国）、Kit激酶（Invitrogen，美国）、ATP(生兴， 中国）、十字孢碱（碧云天，中国）、384低体积白板（Coming,美国）、枪头（Axygen，美国）。
[0022] (2)实验步骤
[0023] 1)进行Kit激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验，见图1-4。
[0024] 2)待测化合物精确称量，加入DMS0溶剂成母液，然后使用检测缓冲液配制待测化 合物溶液至所需浓度，初筛浓度约为1Xl(T3m〇l/L。
[0025] 3)在反应容器中每孔加入Kit激酶溶液2iil，底物溶液2iil，缓冲液或待筛化合 物4iil，ATP2ill。室温反应1小时。
[0026] 4)每孔加入Estradiol_XL6655U1，Anti-Estradiol_cryptate5U1，室温孵育 1 小时。
[0027] 5)利用美国贝克曼库尔特（BeckmanCoulter)公司检测平台HTRF模块分别检测 665nm和610nm处的突光强度。
[0028] 6)绘制阳性药十字孢碱量效曲线并测定其IC5Q值，见图5。
[0029] 7)采集检测信号并绘图，通过信号窗和Z'值确定高通量筛选模型的可靠性，见图 6,7。
[0030] 2?数据处理
[0031] (1)根据公式计算各孔665nm和610nm处突光强度的比值（Ratio665/610);
[0032] (2)根据公式计算各孔的相对抑制率
[0033]

【权利要求】
1. 一种干细胞因子受体激酶抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤： (1) 激酶抑制剂筛选模型的建立与优化； (2) 阳性药验证模型可靠性； (3) 高通量筛选模型验证。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激酶为干细胞因子受体激酶。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中进行干细胞因子受体激酶浓度梯 度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，由步骤（1)可得到最佳反应所需的干细胞因 子受体激酶浓度为〇. lng/ yl，最佳温孵时间为60min，最佳底物浓度为0. 38 y M，最佳ATP 浓度为21. 31iiM。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)选用步骤（1)所到的合适浓度的 激酶，ATP Km，底物Km ;将激酶和底物按1 :2体积混合，每孔加入4 iil，再按浓度梯度每孔 加入4 阳性药，最后每孔加入2 ATP开始反应，按优化时间室温孵育；配制SA-XL665 和TK-Ab，将SA-XL665和TK Ab按体积比1 :1混合，每孔加入lOiil终止反应，室温孵育1 小时后检测，分析数据得阳性药半数抑制率IC5(I为1. 599nM。
6. 权利要求1-5中所述任一方法在筛选干细胞因子受体激酶抑制剂的应用。
【文档编号】G01N21/64GK104458675SQ201310421225
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】严明, 张陆勇, 胡洁, 高鹏 申请人:中国药科大学