一种筛选丝裂原活化蛋白激酶抑制剂高通量筛选方法

一种筛选丝裂原活化蛋白激酶抑制剂高通量筛选方法
【专利摘要】本发明发现了一种筛选丝裂原活化蛋白激酶抑制剂高通量筛选方法，包括以下步骤：(1)丝裂原活化蛋白激酶抑制剂筛选模型的建立与优化：进行激酶浓度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验；(2)阳性药验证模型可靠性：选用合适浓度的激酶，ATP Km，底物Km，激酶和底物每孔分别加入2μl，再按浓度梯度每孔加入4μl阳性药，加入2ul ATP开始反应，按优化时间室温孵育；每孔加入10μl终止液终止反应，室温孵育1小时后检测，分析数据得阳性药IC50；(3)高通量筛选模型验证：按照上述步骤操作，使用Biomek NXP自动化加样仪器和Multidrop自动分液器进行加样，计算Z因子。本发明的优点主要有：1)简便快捷；2)灵敏度高；3)结果稳定可靠，重现性好，可用于高通量筛选。
【专利说明】一种筛选丝裂原活化蛋白激酶抑制剂高通量筛选方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于药理学领域，利用均相时间分辨荧光检测技术，构建了丝裂原活化蛋 白激酶（MAPK)抑制剂的高通量筛选模型，用于待测样品对MAPK激酶抑制活性的高通量检 测。

【背景技术】
[0002] 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)信号通路是近 年来发现广泛存在于各种动物细胞中的一条信号转导途径，对于细胞周期的运行和基因表 达具有重要的调控作用。MAPK信号通路由一组以级联方式依次活化的丝/苏氨酸蛋白激酶 组成，以此将细胞外信号逐级放大并传导到细胞内乃至细胞核，把膜受体结合的胞外刺激 物与细胞质和细胞核中的效应分子连接起来。MAPK也被称为胞外调节激酶（extracellular regulatingkinase,ERK)，是MAPK信号通路的核心分子，它与其上游激活分子和下游效应 分子组成一个准确高效的信号转导体系。MAPK激活需要Thr和Tyr两个位点的磷酸化，MAPK 激酶（MAPKkinase，MAPKK)是其上游激活分子，它的双特异性磷酸化的催化特性保证了 MAPK正常激活，完成特定的生理活动。MAPKK也是通过磷酸化被活化，MAPKKK(MAPKkinase kinase)参与它的激活过程，Raf和Mos是MAPKKK的重要成员，它们的表达受到细胞周期以 及胞外刺激的调控。MAPK的下游分子包括多种蛋白激酶，磷脂酶，以及转录因子。MAPK通 过磷酸化这些效应分子使它们活化继而激活更为下游的效应分子，从而将胞外信号传递到 细胞中完成一定的生理活动。因此，研究MAPK激酶抑制剂具有重大意义。
[0003] 时间分辨突光技术（time-resolvedfluorescence,TRF)是基于镧系元素如铕 (Eu)、钐（Sm)、镝（Dy)等具有较长荧光寿命的特点发展而来的。当铕螯合物供体与受体之 间距离小于l〇nm，且供体发射光谱与受体激发光谱有重叠时，则发生荧光共振能量转移，均 相时间分辨突光（homogeneoustime-resolvedfluorescence，HTRF)技术是法国Cisbio 公司利用这一原理进行深入开发的产品。大多数荧光物质的荧光寿命非常短（一般为几毫 秒），为了避免短暂的荧光干扰，Cisbio公司利用较长荧光寿命的镧系螯合物作为荧光能 量供体，受体经过别藻蓝蛋白（allophycocyanin)或突光素修饰，供体在能量转移时就可 以使受体也具有较长的荧光寿命。因此，能量转移时受体发射光消失时间与供体发射光消 失时间成正比，而与供受体间的距离成反比，这种方法延长了荧光检测时间，降低了短暂荧 光引起的背景干扰。
[0004] 目前，已有多种MAPK激酶抑制剂的筛选方法，多利用ELISA法来筛选MAPK激酶抑 制剂，但是此方法费时费力，难以做到高通量筛选。因此，建立方便快捷准确的检测方法，特 别是体外的功能性检测在药物筛选中越来越受到重视。


【发明内容】

[0005] 本发明的目的在于建立一种基于均相时间分辨荧光的MAPK激酶抑制剂高通量筛 选模型，具有信噪比高，使用安全，样品消耗量小的特点。
[0006] 本发明的技术方案：采用均相时间分辨荧光方法建立体外MAPK激酶抑制剂高通 量筛选模型，初筛，复筛发现一类具有抑制MAPK激酶活性的候选化合物。具体步骤如下：
[0007] 本发明利用均相时间分辨荧光的方法建立了一种MAPK激酶抑制剂高通量筛选模 型。
[0008] 步骤一 ：MAPK激酶抑制剂筛选模型的建立与优化。
[0009] 步骤二：阳性药验证模型可靠性。
[0010] 步骤三：高通量筛选模型验证。

【专利附图】

【附图说明】：
[0011] 图1 :MAPK激酶浓度梯度优化实验结果。（n=_3, ;土^
[0012] 图2 :MAPK激酶温孵时间优化实验结果。（n=3, ;
[0013] 图3 :MAPK激酶底物浓度优化实验结果。（n=_5,;土S)
[0014] 图4 :MAPK激酶ATP浓度优化实验结果。（n=3,;土S)
[0015] 图5:阳性药十字孢碱对MAPK激酶的抑制曲线图。（n=3, x
[0016] 图6 :MAPK激酶抑制剂高通量筛选模型信号检测窗口。
[0017] 图7:高通量筛选Z'值分布。

【具体实施方式】
[0018] 以下结合【专利附图】

【附图说明】本发明的【具体实施方式】：
[0019] 1.MAPK激酶抑制剂筛选方法建立
[0020] (1)实验材料
[0021]MAPK激酶检测试剂盒（Cisbio,法国）、MAPK激酶（Invitrogen，美国）、ATP(生兴， 中国）、十字孢碱（碧云天，中国）、384低体积白板（Corning,美国）、枪头（Axygen，美国）。
[0022] (2)实验步骤
[0023] 1)进行MAPK激酶浓度梯度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验，见图1-4。
[0024] 2)待测化合物精确称量，加入DMS0溶剂成母液，然后使用检测缓冲液配制待测化 合物溶液至所需浓度，初筛浓度约为lXl(T3m〇l/L。
[0025] 3)在反应容器中每孔加入MAPK激酶溶液2iU，底物溶液2iU，缓冲液或待筛化合 物4iil，ATP2ill。室温反应1小时。
[0026] 4)每孔加入Estradiol_XL6655U1，Anti-Estradiol_cryptate5U1，室温孵育 1 小时。
[0027] 5)利用美国贝克曼库尔特（BeckmanCoulter)公司检测平台HTRF模块分别检测 665nm和610nm处的突光强度。
[0028] 6)绘制阳性药十字孢碱量效曲线并测定其IC5Q值，见图5。
[0029] 7)采集检测信号并绘图，通过信号窗和Z'值确定高通量筛选模型的可靠性，见图 6,7。
[0030] 2?数据处理
[0031] (1)根据公式计算各孔665nm和610nm处突光强度的比值（Ratio665 / 610);
[0032] (2)根据公式计算各孔的相对抑制率
[0033]

【权利要求】
1. 一种丝裂原活化蛋白激酶抑制剂高通量筛选模型，其特征在于，包括步骤： (1) 激酶抑制剂筛选模型的建立与优化； (2) 阳性药验证模型可靠性； (3) 高通量筛选模型验证。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的激酶为丝裂原活化蛋白激酶。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1)中进行丝裂原活化蛋白激酶浓度梯 度、温孵时间、底物浓度、ATP浓度实验。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，由步骤（1)可得到最佳反应所需的丝裂原 活化蛋白激酶浓度为0. lng / iil，最佳温孵时间为60min，最佳底物浓度为17. 62nM，最佳 ATP 浓度为 0? 1359 iiM。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)选用步骤（1)所到的合适浓度的 激酶，ATP Km，底物Km ;将激酶和底物按1 :2体积混合，每孔加入4 iil，再按浓度梯度每孔 加入4 阳性药，最后每孔加入2 ATP开始反应，按优化时间室温孵育；配制SA-XL665 和TK-Ab，将SA-XL665和TK Ab按体积比1 :1混合，每孔加入lOiil终止反应，室温孵育1 小时后检测，分析数据得阳性药半数抑制率IC5(I为33760nM。
6. 权利要求1-5中所述任一方法在筛选丝裂原活化蛋白激酶抑制剂的应用。
【文档编号】G01N21/64GK104458672SQ201310421160
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】严明, 张陆勇, 胡洁, 高鹏 申请人:中国药科大学