ddPCR技术监测肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂继发耐药的方法

ddPCR技术监测肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂继发耐药的方法
【专利摘要】本发明提供了一ddPCR技术监测肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂继发耐药的方法，及其在监控酪氨酸激酶抑制剂治疗肺癌过程中的应用。本发明首先对肺癌患者外周血浆进行DNA抽提，再利用ddPCR技术检测其中EGFR的耐药突变位点T790M的突变情况，并以此判定该患者是否产生耐药。
【专利说明】
ddPCR技术监测肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂继发耐药的 方法
技术领域
[0001] 本发明设及医学和生物技术领域，具体地设及可用于指导肿瘤治疗的分子检测技 术，尤其是高灵敏度地检测外周血浆/血清中EGFR基因 T790M位点突变的方法及其在监控 肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂产生继发性耐药等方面的应用。
【背景技术】
[0002] 随着生物医药科技的发展，分子祀向药物已经广泛应用于肿瘤的治疗中，与常规 化疗相比，祀向治疗具有效果好、副作用小等优点。临床应用结果表明，部分患者对祀向药 物会产生耐药性。美国癌症协会研究表明，90% W上的肿瘤患者在治疗过程中不同程度上 受耐药影响。肿瘤细胞的耐药性分为为原发性耐药和继发性耐药。前者在治疗开始时癌细 胞对药物即不敏感，后者是指原来对药物敏感的癌细胞群，在反复治疗经与药物屡次接触 的过程中出现了耐药性。
[0003] 表皮生长因子受体巧GFR)是祀向治疗的主要作用祀点。EGFR的祀向药物包括 EGFR抗单克隆抗体药爱必妥、帕尼单抗，W及EGFR酪氨酸激酶抑制剂易瑞沙和特罗凯。运 些药物能通过抑制肿瘤发生发展中必须的表皮生长因子受体酪氨酸激酶阻断肿瘤细胞的 信号传导，从而达到抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移、血管生成并促进肿瘤细胞的调亡。虽 然EGFR突变的肿瘤患者增加了对酪氨酸激酶抑制剂灯KI)的敏感性，但其耐药仍然是一个 主要的临床问题，进一步的研究发现肿瘤组织中EGFR基因 T790M位点发生突变（体细胞突 变）的病人对此类祀向药物完全耐药。因此，检测病人EGFR基因 T790M位点是否突变成为 实时监测能否持续使用EGFR祀向药物的必要前提条件。
[0004] 继发性耐药检测一般在服用分子祀向药物之后进行，有研究发现，继发性耐药突 变存在累积效应，在服用药物之前，也有患者体内已经存在微小的耐药突变；因此，也可在 治疗之前进行继发性突变位点检测，超早期发现其耐药情况。然而传统的检测方法需要W 肿瘤组织的基因组DNA为模板，运为患者在治疗过程中的多次检测和实时监控带来了困 难。 阳0化]血浆游离DNA (C巧NA)含有循环肿瘤DNA (CtDNA)，对血浆中游离DNA进行定量和定 性的检测可反映出肿瘤的特征性变化，近年来的研究表明，血浆游离DNA可作为一个监控 肿瘤负荷的可靠指标。rfDNA检测仅需少量外周血样本，操作简便，无创，可重复检测。
[0006] 研究还表明，血液中的游离DNA是一种无细胞状态的胞外DNA，其主要成分是小片 段的双链DNA，存在形式主要包括与DNA-蛋白质复合物形式或纯粹的游离形式。
[0007] 然而，由于血浆游离DNA在血液中含量极少，且有大量血源DNA干扰，即使采用高 效的DNA富集手段进行分离纯化并配合高灵敏度的检测手段（如测序、数字PCR)，仍难W准 确而可靠地检测出与肿瘤相关的游离DNA的具体种类和序列。例如，有文献报道，虽然大肠 癌患者中循环游离DNA的平均含量（4771ng/ml)与健康人的平均含量化85ng/ml)存在显 著差异，但是对于67例患者中癌胚抗原（CEA)的检测只有47%检测结果对诊断有意义。
[0008] 因此，虽然基于血液游离DNA的检测技术存为研发的焦点，但是本领域尚缺乏令 人满意的、真正能够满足临床上的高灵敏度、高准确性和高可靠性的突变DNA检测技术。
[0009] 综上所述，本领域迫切需要一种能够基于非肿瘤组织，高灵敏度、高准确性和高可 靠性地检测患者中肿瘤相关突变（如EGFR基因 T790M突变）的方法。

【发明内容】

[0010] 本发明的目的是提供一种能够用非肿瘤组织（如血液或血浆/血清样品）检测患 者EGFR基因 T790M突变的方法。 1] 本发明的第一方面，提供了一种对EGFR基因耐药突变位点进行检测的方法，所述 方法包括步骤：
[0012] (1)提供一检测样本，所述的检测样本是血浆样本、血清样本或血液样品；
[0013] (2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物，其 中对于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于 3化g/微升的提取液；
[0014] (3) W步骤（2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而 获得含所述的耐药突变位点的扩增产物；和
[001引 （4)对所述扩增产物进行分析，从而得出EGFR基因耐药突变位点的突变形式和/ 或比例。
[0016] 在另一优选例中，所述的耐药突变位点选自下组：EGFR T790M。
[0017] 在另一优选例中，所述的血浆样本是用外周血进行分离得到。
[0018] 在另一优选例中，所述的检测样本是血浆样本或血清样本。
[0019] 在另一优选例中，所述的血浆样本是用外周血样本经预处理获得。
[0020] 在另一优选例中，所述的预处理包括：
[002U (a)将采集的外周血置于于非肝素的抗凝管（如邸TA抗凝、和/或ACD抗凝的抗 凝管））中；
[0022] 化）经一级离屯、处理，去除沉淀，分离获得液相（血浆）；
[0023] (C)对上一步骤的获得的液相进行二级离屯、，去除沉淀，分离获得液相作为用于提 取DNA的检测样本。
[0024] 在另一优选例中，所述的一级离屯、包括选自下组的一个或多个条件： 阳0巧] 化-i) 2000-5000rmp ;
[0026] 化-ii)离屯、约1-15分钟；
[0027] (b-i i U 溫度 0-8 °C，较佳地 4 ± 2 °C。
[0028] 在另一优选例中，所述的一级离屯、包括选自下组的一个或多个条件：
[0029] (c-i) 10000-15000rmp ；
[0030] (c-ii)离屯、约 5-30 分钟；
[0031] (c-iii)溫度 0-8°C，较佳地 4±2°C。
[0032] 在另一优选例中，在步骤（3)中，所述ddPCR扩增所使用的DNA模板量为50~ IOOngo
[0033] 在另一优选例中，所述的血清样本是用外周血样本经预处理获得。
[0034] 在另一优选例中，所述的预处理包括：
[0035] (i)将外周血样本置于促凝管中；
[0036] 扣）在室溫下，对所述的样本进行自然沉降（优选为l-3h);
[0037] (iii)对所述沉降后的样本进行离屯、（优选为2000-4000rmp下离屯、l-15min),分 离上清液，得到血清。
[0038] 在另一优选例中，所述的预处理包括：
[0039] (i)将外周血样本置于促凝管中；
[0040] (ii)在低溫（〇-8°C )下，对所述的样本进行自然沉降（优选为6-2地），分离上清 液，得到血清。
[0041] 在另一优选例中，所述的方法是非诊断且非治疗性的。 阳0创在另一优选例中，在ddPCR中，反应体系中含有PCR扩增引物对，W及用于检测突 变位点的探针。 阳0创在另一优选例中，ddPCR中所用的PCR扩增引物对为包含EGFR T790M突变位点的 特异引物对。
[0044] 在另一优选例中，所述的引物对的序列如SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4所示。
[0045] 在另一优选例中，所述的引物对的序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
[0046] 在另一优选例中，所述的用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生 型特异探针。
[0047] 在另一优选例中，所述的突变型探针为FAM探针，所述的野生型探针为肥X探针；
[0048] 或所述的突变型探针为肥X探针，所述的野生型探针为FAM探针。
[0049] 在另一优选例中，所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5所示； 所述的野生型探针的序列如SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:6所示。
[0050] 在另一优选例中，所述的PCR反应的反应体系包括：待测基因组50~l(K)ng， 2XddPCR SuperMix for Probes 度io-Rad L油oratories) IOy 1，EGFR T790M 的特异引物 对巧y M)及探针（5 y M)各I y I。
[0051] 在另一优选例中，所述的样本来自于肺癌患者。
[0052] 在另一优选例中，在所述步骤（2)中，所述的抽提处理包括步骤：
[0053] (2a)将血浆/血清样本，用蛋白酶K进行消化处理，从而获得蛋白质被裂解的消化 液；
[0054] 在另一优选例中，蛋白酶K的加入量为200 y g/100微升检测样本。
[0055] 在另一优选例中，（2a)中还包括：在消化结束后，对蛋白酶K进行灭活。
[0056] (2b)向所述消化液中加入RNA carrier,处理一段时间，从而获得经处理的混合 液；
[0057] 在另一优选例中，所述RNA carrier的加入量为0. lng/100微升检测样本。
[0058] 在另一优选例中，步骤（2b)的放置时间为5-10分钟。
[0059] (2c)对上一步骤经处理的混合液，用固相载体对DNA进行特异性吸附，从而获得 吸附有DNA的固相载体；
[0060] (2d)对上一步骤的吸附有DNA的固相载体，进行洗脱，从而获得含洗脱DNA的洗脱 液，即为含抽提DNA的DNA抽提物。
[0061] 在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，DNA含量为20-100ng/微升；和 /或所述含洗脱DNA的洗脱液的体积为20-100微升。
[0062] 在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，抽提的DNA的大小为100-25化P， 更佳地为150-200bp。 阳06引在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，100-200bp的DNA占 DNA总量的 80-100 %，较佳地 90-100 %。 W64] 在另一优选例中，所述的固相载体为娃膜。 阳0化]在另一优选例中，所述的洗脱包括:AVE洗脱。
[0066] 在另一优选例中，在步骤（2d)中，还包括：测定所述洗脱液中，所述抽提的DNA的 片段大小。
[0067] 本发明的第二方面，提供了一种EGFR基因耐药突变位点检测试剂盒，所述试剂盒 包括：
[0068] (a)第一容器，W及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物 对；
[0069] (b)RNA carrier ；
[0070] (C)使用说明书（如插页），其中，所述说明书记载了本发明第一方面所述的方法， 阳07U 其中，所述的突变位点包括EGFR T790M。 阳07引在另一优选例中，所述的引物对的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。 阳07引在另一优选例中，所述的引物对的序列如SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示。 [0074] 在另一优选例中，所述试剂盒还包括：
[00巧](d)位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针。
[0076] 在另一优选例中，所述的用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生 型特异探针。
[0077] 在另一优选例中，所述的突变型探针的序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 5所示； 所述的野生型探针的序列如SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:6所示。 阳078] 本发明的第S方面，提供了一种EGFR基因耐药突变位点T790M检测试剂盒，其特 征在于，所述试剂盒包括：
[0079] (a)第一容器，W及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对， 并且引物对的序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4中所示，或引物对的序列如SEQ ID NO: 7 和沈Q ID NO:8中所示；
[0080] (b)RNA carrier ；
[0081] (C)使用说明书（如插页），其中，所述说明书记载了本发明第一方面所述的方 法；
[0082] (d)位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针，所述的 用于检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生型特异探针；并且所述的突变型探 针的序列如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:5所示；所述的野生型探针的序列如SEQ ID NO:2 或沈Q ID NO:6所示。
[0083] 在另一优选例中，所述的突变型探针为FAM探针，所述的野生型探针为肥X探针；
[0084] 或所述的突变型探针为肥X探针，所述的野生型探针为FAM探针。
[0085] 本发明的第四方面，提供了一种如本发明第二方面或本发明第S方面所述的试剂 盒或其中所述特异性引物对或探针的用途，用于制备：(a)用于检测或判断肿瘤患者对酪 氨酸激酶抑制剂的耐药性的试剂盒；化）用于判断肿瘤患者是否适合使用或继续使用酪氨 酸激酶抑制剂进行治疗的试剂盒。
[0086] 在另一优选例中，所述的肿瘤患者包括肺癌患者。
[0087] 在另一优选例中，所述的肿瘤患者为人。
[0088] 在另一优选例中，所述是检测包括在给予酪氨酸激酶抑制剂之前、之中、或之后进 行检测。
[0089] 本发明的第五方面，提供了一种肿瘤患者酪氨酸激酶抑制剂耐药性的检测方法， 包括步骤：用如本发明第一方面所述的方法进行EGFR基因耐药突变位点T790M检测；和
[0090] 若检测结果为阳性，则判定患者对酪氨酸激酶抑制剂耐药；若检测结果为阴性，贝U 判定患者对酪氨酸激酶抑制剂敏感。
[0091] 在另一优选例中，所述的肿瘤为肺癌。
[0092] 在另一优选例中，所述的肿瘤患者酪氨酸激酶抑制剂耐药性为酪氨酸激酶抑制 剂继发性耐药。
[0093] 本发明的第六方面，提供了一种肿瘤患者治疗方法，所述方法包括步骤：
[0094] (a)用如本发明第一方面所述的方法，对所述对象进行EGFR基因耐药突变位点 T790M检测，并对检测结果为阴性的对象，采用酪氨酸激酶抑制剂进行治疗；
[0095] 化）在一个或多个治疗周期之中或之后，用如本发明第一方面所述的方法，对所述 对象再次进行EGFR基因耐药突变位点T790M检测，并对检测结果为阴性的对象，继续采用 酪氨酸激酶抑制剂进行治疗；对于对检测结果为阳性的对象，停止采用酪氨酸激酶抑制剂 进行治疗。
[0096] 在另一优选例中，在步骤化）中还包括：记录首次检测到EGFR T790M突变阳性的 时间。
[0097] 在另一优选例中，所述的治疗周期为3-6周。
[0098] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可W互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附图说明】
[0099] 图1是ddPCR仪微滴数目结果显示。图中深灰色代表无扩增的游离DNA微滴数， 蓝色代表突变型细胞游离DNA微滴数，绿色代表野生型细胞游离DNA微滴数。纵坐标代表 巧光信号强度，横坐标代表微滴数目。
[0100] 图2是ddPCR仪微滴巧光信号分布区结果显示。图中蓝色代表微滴中只含有突变 型的游离DNA信号区，绿色代表微滴中只含有野生型的游离DNA信号区，澄色代表微滴中既 含有突变型又含有野生型的游离DNA信号区，深灰色代表无扩增的游离DNA信号区。纵坐 标代表FAM通道巧光信号强度，横坐标代表肥X通道巧光信号强度。 阳1〇U 图3显示了 EGFR0790M)突变阳性的检测结果，其中图3(A)为突变型检测结果 图，图3度）为野生型检测结果图。 阳10引图4显示了 EGFR0790M)突变阴性的检测结果图，其中图4(A)未检测出突变型， 图4度）为野生型检测结果图。 阳10引图5为实施例中的血浆游离DNA跑胶图。
【具体实施方式】
[0104] 本发明人经过长期而深入的研究，通过对于大量方法和试剂的筛选，意外地发现， 通过改进的血浆/血清样本制备和添加特定的富集剂（如RNA carrier),并结合微滴式数 字PCR技术和高特异性的引物序列和探针序列，居然可W用外周血浆/血清样本高效地提 取到的肿瘤相关性的DNA分子，从而高灵敏度、高准确性和高可靠性地检测患者中EGFR基 因 T790M突变，从而可辅助判断患者是否对酪氨酸激酶抑制剂产生耐药。基于上述发现，发 明人完成了本发明。 阳105] 术语
[0106] 如本文所用，术语"肿瘤相关突变"指与肿瘤的发生、进展、治疗、和/或预后相关 的基因突变，尤其是与肿瘤治疗的耐药性相关的DNA突变。 阳107] 如本文所用，术语"本发明突变"、"本发明的耐药性突变"或"EGFR基因 T790M突 变"可互换使用，指EGFR蛋白的T790M突变（在蛋白质水平，EGFR蛋白第790号氨基酸由 苏氨酸（T)突变为蛋氨酸（M)) W及导致该氨基酸突变的相应的核巧酸突变（基因水平）。 研究表明，通过检测EGFR T790M运一突变位点的突变情况，对于肿瘤患者是否采用或继续 采用酪氨酸激酶抑制剂治疗，有指导作用。
[0108] 如本文所用，术语"非肿瘤组织"指与肿瘤组织不同的组织。在本发明中，对于实 体瘤而言，血液和血浆/血清可视为"非肿瘤组织"。
[0109] 如本文所用，术语"RNA Carrier"为一种市售的、用于协助分离RNA的试剂。其成 分为PloyG偶联到DNAmate -种高分子化合物。研究表明，RNACarrier能特异吸附低浓度 RNA，并且有助于减少提取过程中RNA被RNase降解。然而，研究表明，RNA Carrier对于常 规双链DNA的提取无促进作用。
[0110] 如本文所用，术语"酪氨酸激酶抑制剂"指施用于对象后，能够引起对象酪氨酸激 酶活性降低，或表达量减少的药物或药物组合物。本发明的"酪氨酸激酶抑制剂"包括本领 域所有已知或待开发的酪氨酸激酶抑制剂，例如（但并不限于）：易瑞沙、特罗凯、埃罗替尼 等。 阳11U 本发明的目的是提供一种利用ddPCR技术检测血清/血浆中EGFR基因 T790M位 点突变从而监测肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂继发耐药的方法。 阳11引本发明的另一个目的是实时监控服药祀向药物后EGFR基因 T790M位点的突变率， 确保在超早期发现患者是否产生继发性耐药突变。 阳113] 本发明的最终目的是通过ddPCR技术，定期检测患者血清/血浆中EGFR基因 T790M位点的突变情况，W此来判定患者是否已产生继发性耐药，有效的指导患者进行下一 步的治疗。
[0114] 外周血样本中提取DNA模板 阳115] 由于外周血样本中可用于有效检测肿瘤相关性的DNA的量非常少，因此需通过一 定的富集手段对外周血游离DNA进行富集，W得到能够用于检测量的DNA。
[0116] 本发明中，优选的DNA的抽提方法如下：
[0117] (2a)将血浆/血清样本，用蛋白酶K进行消化处理，从而获得蛋白质被裂解的消化 液； 阳11引 姊）向所述消化液中加入RNA carrier,处理一段时间，从而获得经处理的混合 液；
[0119] 在另一优选例中，所述RNA carrier的加入量为0. lng/100微升检测样本。
[0120] 在另一优选例中，步骤（2b)的放置时间为5-10分钟。 阳12U (2c)对上一步骤经处理的混合液，用固相载体对DNA进行特异性吸附，从而获得 吸附有DNA的固相载体； 阳122] (2d)对上一步骤的吸附有DNA的固相载体，进行洗脱，从而获得含洗脱DNA的洗脱 液，即为含抽提DNA的DNA抽提物。
[0123] 完成上述抽提后，所得到的的含洗脱DNA的洗脱液中，DNA含量通常为20-100ng/ 微升，所述含洗脱DNA的洗脱液的体积通常为20-100微升。
[0124] 在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，抽提的DNA的平均大小通常为 《313bp(即基本由游离DNA组成），较佳地为100-250bp，更佳地为150-200bp。 阳1巧]在另一优选例中，所述的含洗脱DNA的洗脱液中，100-200bp的DNA占 DNA总量的 80-100 %，较佳地 90-100 %。 阳126] 在另一优选例中，所述的固相载体为娃膜。
[0127] 在另一优选例中，所述的洗脱包括:AVE洗脱，优选为干燥后直接用AVE洗脱。
[0128] 在另一优选例中，在步骤（2d)中，还包括：测定所述洗脱液中，所述抽提的DNA的 片段大小。 阳129] EGFR基因耐药突变位点T790M的检测
[0130] 数字PCR (digital PCR，dPCR)技术被称为"第S代PCR"技术，是一项检测和定量 核酸分子的新技术，在不依靠任何校准物或外标的情况下，可直接进行单个目标分子的计 数，W实现绝对定量。微滴式数字PCR系统（化oplet digital PCR，ddPCR)将含有核酸分 子的反应体系分成上万个纳升级的微滴，其中每个微滴不含或者含有一个至数个带有目标 基因突变的DNA片段。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行巧光检测，因此具有极高的灵敏 度，能用于检测血液中含量极低的肿瘤游离DNA。与传统PCR、定量PCR相比，其结果的精确 度、准确性和灵敏度更佳。该技术能够确认拷贝数极低的待检祀分子的绝对数目，特别适合 拷贝数变异、热点突变和基因相对表达等方面的检测。 阳131] 在本发明中，优选的DNA模板是用外周血分离的血浆提取的，较佳地，在提取DNA 模板前，将待检测的外周血样本首先进行离屯、处理，300化pm，3min，4°C，之后将离屯、获得的 血浆用移液枪移至2ml的离屯、管中，再次离屯、，13300rpm，10min，4°C，弃沉淀，上清即为所 需抽提DNA的血浆。 阳132] 在本发明中，另一种优选的DNA模板是用外周血分离的血清提取的，较佳地，所述 血清的提取方法包括：提取血清的外周血样本需要用促凝管进行抽血并保存，分离血清的 方法有2种：（1).室溫进行自然沉降（约2h)后，300化pm离屯、lOmin，取上清，即为血清； (2). 4°C进行自然沉降（1化），直接取上清，即为血清样本。
[0133] 优选的本发明实施例中，DNA模板的提取方法如下： 阳134] a)抽提血浆/血清中的游离DNA ;
[013引 扣）对样本进行裂解、富集、过柱洗脱和AVE洗脱，得到待扩增的DNA模板； 阳136] 任选地，所述方法还包括步骤测试所述DNA模板的片段大小。 阳137] 本申请的PCR方法中，所使用的引物对为包含EGFR T790M突变位点 的特异引物。在本发明的一个优选实施例中，所述的特异引物具有如SEQ ID N0:3(GCATCTGCCTCACCTCCAC)和沈Q ID N0:4(AGCAGGTACTGGGAGCCAATA)所示的序列，或具 有如沈Q ID N0:7 (CTCACCTCCACCGTGCA)和沈Q ID N0:8 灯ACTGGGAGCCAATATTGTCTTTGT)所 示的序列。所用探针包括一条用于检测突变型的突变型特异探针，和一条用于检测野生型 的野生型特异探针。优选地，突变型探针类型为FAM探针（例如但并不限于SEQ ID NO: 1， CCGTGCAGCTCATCATGCAGCTC 或沈Q ID N0:5, CTCATCATGCAGCTCATGCCCTTCG)，所述的野生型 探针类型为肥X探针（例如但并不限于沈Q ID NO: 2, CCGTGCAGCTCATCACGCAGCTC，或沈QID N0:6, CTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCG 所示的序列）。
[0138] 在本发明的一个优选例中，所述的微滴式数字PCR的反应液首先通过QXlOO微滴 发生器生成纳升级别的油包水的液滴，然后再进行PCR反应，最后将PCR板转移到QXlOO微 滴分析仪对所有样品孔进行巧光检测。
[0139] 在本发明的一种优选实施例中，所述的PCR反应所使用的反应体系每20 组成如下：待测肿瘤组织 DNA 50 ~lOOng，2 X ddPCR SuperMix for Probes (Bio-Rad L油oratories) 10 Ji 1，EGFR T790M的特异引物及探针各I Ji I，无菌蒸馈水补足至20 Ji 1。
[0140] 在本发明的一种优选实施例中，所述的PCR反应的反应条件为：95°C变性IOmin ; 随后94°C变性30sec，60°C退火60sec，进行40个循环；最后98°C延伸10min，4°C保存。 阳141] 本发明的一个优选实施例中，检测ddPCR仪微滴巧光信号分布区结果如图1所示， 图中，蓝色代表微滴中只含有突变型的游离DNA信号区，绿色代表微滴中只含有野生型的 游离DNA信号区，澄色代表微滴中既含有突变型又含有野生型的游离DNA信号区，深灰色代 表无扩增的游离DNA信号区。纵坐标代表FAM通道巧光信号强度，横坐标代表肥X通道巧光 信号强度。其中，图IA显示了 EGFR T790M突变阳性的检测结果，图IB显示了 EGFR T790M 突变阴性的检测结果。 阳142] 本发明的一个优选实施例中的ddPCR仪微滴数目检测结果如图2所显示。图中， 深灰色代表无扩增的游离DNA微滴数，蓝色代表突变型细胞游离DNA微滴数，绿色代表野生 型细胞游离DNA微滴数。纵坐标代表巧光信号强度，横坐标代表微滴数目。 阳143] 酪氨酸激酶抑制剂耐药性判断
[0144] 检测病人EGFR基因 T790M位点是否突变成为实时监测能否持续使用EGFR祀向药 物的必要前提条件。
[0145] T790M突变导致耐药的可能原因有：1)790位点由一个庞大体积的蛋氨酸（M)替代 苏氨酸灯)，出现了位阻效应，减弱了与EGFR的ATP 口袋中药物的结合力。2)T790M突变增 加了 EGFR-L858R突变体与ATP的亲和力，而且是至少一个数量级W上的差别，使得和ATP 的亲和力恢复到野生型EGFR水平。相对野生型EGFR，原先的EGFR-L858R单突变使得ATP 亲和力减弱，导致容易被TKI结合和抑制，而双突变造成的ATP亲和力的恢复使得加大的治 疗窗重新关闭，因而产生对TKI的获得性耐药。 阳146] 由于EGFR T790M突变阳性与患者（优选为肺癌患者）酪氨酸激酶抑制剂耐药性 相关巧GFR蛋白第790号氨基酸由苏氨酸（T)突变为蛋氨酸（M))，因此，本发明的检测方法 可W用于辅助判断患者是否对酪氨酸激酶抑制剂产生耐药。 阳147] 数字PCR (digital PCR，dPCR)检测技术灵敏度（可达0.001% )，远高于目前基于 ARMS的检测技术或基于高分辨率溶解曲线HRM的检测技术，非常适合在体液中检测含量极 低的肿瘤游离DNA。
[0148] 微滴式数字PCR系统（化oplet digital PCR，ddPCR)将含有核酸分子的反应体 系分成上万个纳升级的微滴，其中每个微滴不含或者含有一个至数个带有目标基因突变的 DNA片段。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行巧光检测，最后通过泊松分布概率密度函数 计算，无需做到每个微滴内不含祀分子或仅含1个祀分子也能实现准确定量。由于数字PCR 降低了对反应扩增效率的要求，采取终点法判读的方法，因此特别适合检测稀有突变、拷贝 数变异和基因相对表达等方面的检测。本申请利用ddPCR技术检测接受酪氨酸激酶抑制剂 治疗的肺癌患者外周血浆/血清中EGFR T790M的突变情况，根据检测结果判定患者是否对 酪氨酸激酶抑制剂耐药，并推测患者对酪氨酸激酶抑制剂产生继发耐药的时间，为调整肺 癌患者治疗方案提供指导。
[0149] 在本发明的优选实施例中，取患者外周血样本并提取基因组DNA，W待测外周血浆 /血清基因组DNA为模板，利用上述方法对EGFR基因的耐药突变位点T790M进行检测，然后 根据检测到EGFR基因的T790M位点突变阳性的时间确定患者对酪氨酸激酶抑制剂产生耐 药的时间。
[0150] 由于本发明方法可W采用较易采样的外周血样本进行检测，因此，所述的检测可 W多次进行，从而在患者的治疗过程中实时监控。 阳151] 本发明方法既可W在用药前对患者的耐药性进行判断，也可W在用药过程中或之 后判断患者是否已经产生耐药性，从而为后续治疗提供指导。在本发明的优选实施例中，所 述的肺癌患者可W是尚未使用酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的肺癌患者，也可W是已经开始 使用酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的患者。 阳152] 在本发明的一个优选例中，在每个治疗周期前后，取肺癌患者外周血样本，分离血 浆/血清并提取基因组DNA，W待测外周血浆/血清基因组DNA为模板，利用ddPCR技术对 EGFR基因的耐药突变位点T790M进行检测，然后根据检测到EGFR基因的T790M位点突变的 阳性或阴性，确定患者对酪氨酸激酶抑制剂是否产生耐药。 阳153] 具体地，所述的判断检测方法如下： 阳154] 提取肺癌患者外周血浆/血清基因组DNA ;
[01巧]W待测外周血浆/血清基因组DNA为模板，用EGFR T790M的特异探针进行ddPCR 扩增；
[0156] 根据ddPCR对目的基因位点突变情况的检测结果，分析患者对酪氨酸激酶抑制剂 的耐药情况； 阳157] 根据患者出现EGFR T790M突变阳性或阴性，确定患者对酪氨酸激酶抑制剂是否产 生耐药。
[0158] 在本发明的一个优选实施例中，利用ddPCR技术通过检测外周血浆/血清中基因 突变W监控肺癌患者对酪氨酸激酶抑制剂耐药的方法包括如下步骤：
[0159] (1)提取肺癌患者外周血浆/血清基因组DNA。 阳16〇] 似配制反应体系：
[0161] a.探针及引物设计：本发明采用常规的化qman探针法进行设计，对EGFR基因 T790M位点分别设计了野生型和突变型的探针，FAM巧光通道标记突变型，肥X巧光通道标 记野生型，野生型和突变型的目的片段共用同一对PCR扩增引物。 阳16引 b. 20 y 1 PCR反应体系如下：待测患者血浆/血清游离DNA 50~l(K)ng，2 XddPCR SuperMix for Probes 度io-Rad L油oratories) IOy 1，EGFR 基因 T790M 位点野生型和突变 型的探针引物（已混合配制好）各Iy 1，无菌蒸馈水补足至20 iil。 阳16引 做制备微滴：
[0164] 在DG8?微滴发生卡上相对应的孔中加入20ul上述PCR反应液，70ul微滴发生专 用油，盖上微滴发生卡密封垫，放入QXlOO微滴发生器内进行反应，QXlOO微滴发生器最多 能同时处理8个样品。将处理好的微滴缓慢转移到96孔板上，完成全部的样本转移后，将 96孔板放在热封仪上，盖上热封膜进行封膜。 阳1化](4) PCR扩增：
[0166] 将已制备好的微滴按照已优化好的PCR扩增程序进行目的片段扩增，PCR反应条 件为：95°C变性IOmin ;随后94°C变性30sec，60°C退火60sec，进行40个循环；最后98°C延 伸 10min，4°C 保存。
[0167] 妨微滴检测：
[0168] PCR反应结束后，将PCR板转移到QXlOO微滴分析仪度io-Rad L油oratories USA) 上，编辑好样本信息，对所有样品孔进行巧光检测。 阳169] (6)结果分析：
[0170] 实验中检测EGFR基因 T790M位点，分别有1对共用的PCR扩增引物和2对分别标 记野生型和突变型的巧光探针。在野生型片段有扩增（在肥X巧光信号区域有微滴分布） 的前提下存在突变型片段的扩增（在FAM巧光信号区域有微滴分布），则判断该基因有突 变；反之则无。 阳171 ] 检测结果EGFR T790M突变阴性，则患者对酪氨酸激酶抑制剂敏感；EGFR T790M突 变阳性，则患者对酪氨酸激酶抑制剂耐药。 阳172] 本发明相对于现有技术，有W下优点： 阳17引 （1)本发明的检测方法具有较高的灵敏度化001% )(即可W从10万个正常DNA 分子中检测到一个突变分子的存在），仅需使用l(K)ng的DNA模板即可完成检测。
[0174] (2)本发明的检测方法仅需使用检测对象的外周血浆/血清游离DNA即可完成检 ，无需采集肿瘤组织进行检测，操作简便，无创，可重复进行。 阳175] (3)使用本发明方法，可W准确地检测出由于肿瘤组织异质性导致的EGFR突变假 阴性，仅需使用外周血样本即可完成检测。 阳176] (4)本发明方法可W用于在患者用药治疗的过程中，定期从患者的血浆/血清中 抽提DNA W检测血浆/血清中游离DNA突变，从而在超早期发现患者是否产生继发性耐药 突变，可作为后续治疗的辅助判断手段。
[0177] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（New York = Cold Spring Harbor L油oratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否 则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0178] 通用方法血浆/血清样本中游离DNA的提取 阳1巧]血浆分离方法如下：
[0180] 将待检测的外周血样本首先进行离屯、处理，300化9111，3111111，4°(：，之后将离屯、获得 的血浆用移液枪移至2ml的离屯、管中，再次离屯、，13300rpm，10min，4°C，弃沉淀，上清即为 所需抽提DNA的血浆。 阳181] 血清分离方法如下：
[0182] 提取血清的外周血样本用促凝管进行抽血并保存，分离血清的方法有2种：（1). 室溫进行自然沉降（约2h)后，300化pm离屯、lOmin，取上清，即为血清；（2). 4°C进行自然沉 降（1化），直接取上清，即为血清。
[0183] 在血浆或血清样本中提取DNA的过程如下：
[0184] a、裂解 阳化5] 加入Proteinase K，使其终浓度为2mg/lml血浆，在60°C的条件下裂解去除蛋白 质从而将游离DNA释放出来。与此同时，加入A化(carrier RNA)试剂，使丽ase和RNase 失活，并使得游离核酸完全从结合的蛋白上释放出来。 阳186] b、过柱纯化 阳187] 在裂解好的血浆中加入的ACB溶液（QIAGEN公司），使其终浓度为1. 血 浆，冰浴5min后，用硅胶柱进行过柱纯化。 阳1蝴 C、洗脱
[0189] 过柱之后，加入相应的洗脱液对柱子进行洗涂，最后加入无水乙醇沉淀DNA分子。 阳190] d、溶解 阳1W] 在干燥之后的吸附柱中加入30ul Buffer AVE进行溶解，室溫放置一段时间后， 进行离屯、处理，得到纯化的基因组DNA。
[0192] e、对提取得到的血浆游离DNA进行质检，首先用Nano化OP检测其浓度，正常情况 下2ml血浆可抽提出30~50ng/ul的血浆游离DNA。之后通过Agilen忧ioanalysis 2100 检测其片段大小，W确定其为血浆游离DNA (<300bp)。图5为Agilent bioanalysis 2100 质检图，横坐标为Marker大小（其中35bp和> 1000 Obp峰为外加标记物），纵坐标为峰值 强度，抽提得到的血浆游离DNA的片段大小主要集中在169bp左右，符合要求。
[0193] 实施例1，2中所使用的引物对和探针如下：
[0194] Probe-FAM:CCGTGCAGCTCATCATGCAGCTC 阳 1 巧]Probe-HEX:CCGTGCAGCTCATCACGCAGCTC
[0196] F:GCATCTGCCTCACCTCCAC
[0197] R:AGCAGGTACTGGGAGCCAATA
[0198] 实施例1通过ddPCR技术检测血清/血浆中EGFR基因突变从而监测肺癌患者对 酪氨酸激酶抑制剂继发耐药 阳199] (1)抽取患者外周血4血，分离得到血浆/血清，利用"QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit"对血浆/血清中游离DNA进行抽提。通过对样本的溶解、富集、过柱洗 脱W及最后AVE洗脱获得高浓度及高纯度的DNA，最后通过琼脂糖凝胶电泳确定其片段大 小（<313bp)，W保证抽提质量。 阳200] (2)反应体系配制 阳201] a.探针及引物设计：本发明采用常规的化qman探针法进行设计，对EGFR基因目 的片段分别设计了野生型和突变型的探针，FAM巧光通道标记突变型，肥X巧光通道标记野 生型，野生型和突变型的目的片段共用同一对PCR扩增引物。 阳20引 b. 20 y 1 PCR反应体系如下：待测患者血浆游离DNA 50~lOOng， 2XddPCRSuperMix for Probes(BiC)-Rad L 油 oratories) 10 Ji 1，EGFR 基因 T790M 位点野生 型和突变型的探针引物（已混合配制好）各Iy 1，无菌蒸馈水补足至20 yl。 悦03] (3)制备微滴
[0204] 在DG8?微滴发生卡上相对应的孔中加入20ul上述PCR反应液，70ul微滴发生专 用油，盖上微滴发生卡密封垫，放入QXlOO微滴发生器内进行反应，QXlOO微滴发生器最多 能同时处理8个样品。将处理好的微滴缓慢转移到96孔板上，完成全部的样本转移后，将 96孔板放在热封仪上，盖上热封膜进行封膜。 阳205] (4) PCR 扩增
[0206] 将已制备好的微滴按照已优化好的PCR扩增程序进行目的片段扩增，PCR反应条 件为：95°C变性IOmin ;随后94°C变性30sec，60°C退火60sec，进行40个循环；最后98°C延 伸 10min，4°C 保存。
[0207] 妨微滴检测 阳20引 PCR反应结束后，将PCR板转移到QXlOO微滴分析仪度io-Rad L油oratories USA) 上，编辑好样本信息，对所有样品孔进行巧光检测。 悦09] (6)结果分析
[0210] 测试结果见图3和表1 :
[0211] 表 1 阳 212]
阳21引根据W上数据分析发现，该样本的EGFR基因 T790M发生了突变，突变率为1. 29%， 由于该位点突变易产生对酪氨酸激酶抑制剂的继发性耐药，因此提示患者可能产生酪氨酸 激酶抑制剂继发性耐药，应及时更换治疗方案。
[0214] 实施例2通过ddPCR技术检测血清/血浆中EGFR基因突变从而监测肺癌患者对 酪氨酸激酶抑制剂继发耐药
[021引 （1)抽取患者外周血4血，分离得到血浆/血清，利用"QIAamp Cir州Iating Nucleic Acid Kit"对血浆/血清中游离DNA进行抽提。通过对样本的溶解、富集、过柱洗 脱W及最后AVE洗脱获得高浓度及高纯度的DM,最后通过琼脂糖凝胶电泳确定其片段大 小（<313bp)，W保证抽提质量。 阳216] (2)反应体系配制 阳217] a.探针及引物设计：本发明采用常规的化qman探针法进行设计，对EGFR基因目 的片段分别设计了野生型和突变型的探针，FAM巧光通道标记突变型，肥X巧光通道标记野 生型，野生型和突变型的目的片段共用同一对PCR扩增引物。 阳2化]b. 20 y 1 PCR反应体系如下：待测患者血浆游离DNA 50~lOOng，2 X ddPCR SuperMix for Probes 度io-Rad L油oratories) IOy 1，EGFR 基因 T790M 位点野生型和突变 型的探针引物（已混合配制好）各Iy 1，无菌蒸馈水补足至20 iil。
[0219] 做制备微滴
[0220] 在DG8?微滴发生卡上相对应的孔中加入20ul上述PCR反应液，70ul微滴发生专 用油，盖上微滴发生卡密封垫，放入QXlOO微滴发生器内进行反应，QXlOO微滴发生器最多 能同时处理8个样品。将处理好的微滴缓慢转移到96孔板上，完成全部的样本转移后，将 96孔板放在热封仪上，盖上热封膜进行封膜。 阳22U (4) PCR扩增 阳222] 将已制备好的微滴按照已优化好的PCR扩增程序进行目的片段扩增，PCR反应条 件为：95°C变性IOmin ;随后94°C变性30sec，60°C退火60sec，进行40个循环；最后98°C延 伸 10min，4°C 保存。 悦2引 妨微滴检测 阳224] PCR反应结束后，将PCR板转移到QXlOO微滴分析仪度io-Rad L油oratories USA) 上，编辑好样本信息，对所有样品孔进行巧光检测。 悦巧](6)结果分析：
[0226] 测试结果见图4和表2: 阳227]
阳22引根据W上数据分析发现，该样本的EGFR基因 T790M突变率为0,提示患者目前尚未 产生对酪氨酸激酶抑制剂的继发性耐药，但应定期（每3-6周）进行实时监控，一旦发现 产生对酪氨酸激酶抑制剂的继发性耐药，及时指导患者进一步的用药治疗。
[0229] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 W对本发明作各种改动或修改，运些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种对EGFR基因耐药突变位点进行检测的方法，其特征在于，包括步骤： (1) 提供一检测样本，所述的检测样本是血浆样本、血清样本或血液样品； (2) 对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得含抽提DNA的DNA抽提物，其中对 于每2毫升的检测样本而言，所述DNA抽提物是体积为20-100微升且DNA浓度大于30ng/ 微升的提取液； (3) 以步骤（2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)，从而获得含 所述的耐药突变位点的扩增产物；和 (4) 对所述扩增产物进行分析，从而得出EGFR基因耐药突变位点的突变形式和/或比 例。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在ddPCR中，反应体系中含有PCR扩增引物 对，以及用于检测突变位点的探针。3. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的样本来自于肺癌患者。4. 如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，在所述步骤（2)中，所述的抽提处理包 括步骤： (2a)将血浆/血清样本，用蛋白酶K进行消化处理，从而获得蛋白质被裂解的消化液； (2b)向所述消化液中加入RNA carrier，处理一段时间，从而获得经处理的混合液； (2c)对上一步骤经处理的混合液，用固相载体对DNA进行特异性吸附，从而获得吸附 有DNA的固相载体； (2d)对上一步骤的吸附有DNA的固相载体，进行洗脱，从而获得含洗脱DNA的洗脱液， 即为含抽提DNA的DNA抽提物。5. -种EGFR基因耐药突变位点检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： (a) 第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对； (b) RNA carrier ； (c) 使用说明书（如插页），其中，所述说明书记载了权利要求1所述的方法， 其中，所述的突变位点包括EGFR T790M。6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括： (d) 位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针。7. -种EGFR基因耐药突变位点T790M检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括： (a) 第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含突变位点的特异引物对，并且 引物对的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4中所示，或引物对的序列如SEQ ID NO:7和 SEQ ID NO:8 中所示； (b) RNA carrier ； (c) 使用说明书（如插页），其中，所述说明书记载了权利要求1所述的方法； (d) 位于所述第一容器内或另一不同容器内的用于检测突变位点的探针，所述的用于 检测突变位点的探针包括：突变型特异探针和野生型特异探针；并且所述的突变型探针的 序列如SEQIDNO :l或SEQIDNO:5所示；所述的野生型探针的序列如SEQIDNO:2或SEQ ID NO:6 所示。8. -种如权利要求5或7所述的试剂盒或其中所述特异性引物对或探针的用途，其特 征在于，用于制备：(a)用于检测或判断肿瘤患者对酪氨酸激酶抑制剂的耐药性的试剂盒； (b)用于判断肿瘤患者是否适合使用或继续使用酪氨酸激酶抑制剂进行治疗的试剂盒。9. 一种肿瘤患者酪氨酸激酶抑制剂耐药性的检测方法，其特征在于，包括步骤：用如 权利要求1-4任一所述的方法进行EGFR基因耐药突变位点T790M检测；和 若检测结果为阳性，则判定患者对酪氨酸激酶抑制剂耐药；若检测结果为阴性，则判定 患者对酪氨酸激酶抑制剂敏感。10. -种肿瘤患者治疗方法，其特征在于，包括步骤： (a) 用如权利要求1所述的方法，对所述对象进行EGFR基因耐药突变位点T790M检测， 并对检测结果为阴性的对象，采用酪氨酸激酶抑制剂进行治疗； (b) 在一个或多个治疗周期之中或之后，用如权利要求1所述的方法，对所述对象再次 进行EGFR基因耐药突变位点T790M检测，并对检测结果为阴性的对象，继续采用酪氨酸激 酶抑制剂进行治疗；对于对检测结果为阳性的对象，停止采用酪氨酸激酶抑制剂进行治疗。
【文档编号】C12N15/11GK105838777SQ201510017009
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2015年1月13日
【发明人】丁飞飞, 许骋, 吴云鸣, 易静, 张桢珍, 楼敬伟, 朱陵君, 王剑鹏, 方圆, 蒋晓东, 李军川
【申请人】上海张江转化医学研发中心有限公司, 上海宝藤生物医药科技股份有限公司, 上海宝藤医学检验所有限公司