阿孙链霉菌、其代谢产物、其制备方法及其杀蚊子的应用与流程

本发明涉及一种新颖菌株，特别是指经分离而得的阿孙链霉菌bt00008(streptomycesabikoensisbt00008)。本发明另涉及一种制备方法，特别是指制备阿孙链霉菌代谢产物与代谢萃取物的方法。本发明另涉及一种代谢产物，特别是指由前述方法所获得的代谢产物。本发明另涉及一种应用，特别是指前述代谢产物用于杀蚊子的应用。
背景技术：
：随着全球暖化、气候变迁的加剧，病媒蚊造成的公共卫生问题对于全球人口生命安全与经济发展一直是严苛且迫切的议题，随之而来的登革热感染通常造成人类的高死亡率，严重打击经济与生活水准，因此病媒蚊的活动对于人类的政治经济和社会秩序息息相关。在病媒防治上，化学药剂一直是传统防治病媒蚊的利器，但化学药剂长期喷洒对于人体健康、环境都造成伤害，同时也容易导致环境害虫的抗药性产生，对于防治策略的拟定，造成很严重的困扰，因此投入友善环境的新型杀蚊药剂开发，对于未来用药及病媒蚊的控制，将是一项高度挑战性的工作。目前常见防治环境中蚊虫的方式为降低蚊子幼虫的族群数，常见的杀蚊药为除虫菊精类型与昆虫生长调节剂等化学合成药剂或苏力菌，施用于水中。前者化学药剂大量且长期地施用于环境中，极有可能造成害虫产生抗药性、对非标的生物的危害以及对环境的污染；后者苏力菌在常见以色列品系(bacillusthuringiensisisraelensis,bti)的效果良好，实验结果发现，其杀虫结晶蛋白(insecticidalcrystalprotein,icp)对蚊子幼虫毒性高，专一性强，其药效不会影响水沟内其余生物生态，但却可有效扑灭幼虫。但是，bti的毒蛋白在阳光下容易失效，使用时最好选择阴天、傍晚或添加保护剂喷洒。另外，国外曾有研究文献指出长期以苏力菌毒蛋白喂养热带家蚊(culexquinquefasciatus)，可能会诱发其抗性的产生。有鉴于此，为克服病媒蚊的危害，同时又能将环境污染、对人体的损害降到最低，并能提供专一及环境友善性等特性，现有技术实有待改善的必要。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点，本发明的目的为提供一种制备阿孙链霉菌bt00008(streptomycesabikoensisbt00008)代谢产物及代谢萃取物的方法、代谢产物、代谢萃取物及其应用，并建立含有所述代谢产物的生物制剂，具有杀蚊的应用，用于蚊虫的防治，具有良好的契机应用于环境用生物制剂发展的潜力。为达到上述目的，本发明提供了一种阿孙链霉菌bt00008菌株，所述菌株寄存于中国典型培养物保藏中心(cctcc)(地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072)，保藏编号为cctccno:m2018126，保藏日期：2018年03月8日，分类命名：阿孙链霉菌bt00008(streptomycesabikoensisbt00008)。较佳的，本菌株是用于杀蚊子的应用。本发明另提供一种制备阿孙链霉菌代谢萃取物的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：将阿孙链霉菌以培养基发酵，获得代谢产物；将代谢产物以乙酸乙酯萃取，获得代谢萃取物。较佳的，所述将阿孙链霉菌以培养基发酵步骤中，培养基组成物包含，但不限于酪蛋白、酵母提取物、麦芽精、右旋葡萄糖、燕麦、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸铵、碳酸钙、可溶性淀粉、七水硫酸镁、七水硫酸亚铁、四水氯化锰、l-天冬酰胺、甘油、牛肉提取物、蛋白胨、柠檬酸铁铵、硫代硫酸钠、l-酪氨酸、胰水解蛋白、大豆胨、番茄提取物、柠檬酸氢二铵、硫酸锰、乙酸钠、脱脂牛奶蛋白(skimmilkprotein,smp)或其组合；更佳的，所述将阿孙链霉菌以培养基发酵步骤中，培养基组成物选自于由酪蛋白、酵母提取物、麦芽精、右旋葡萄糖、燕麦、磷酸氢二钾、氯化钠、硫酸铵、碳酸钙、可溶性淀粉、七水硫酸镁、七水硫酸亚铁、四水氯化锰、l-天冬酰胺、甘油、牛肉提取物、蛋白胨、柠檬酸铁铵、硫代硫酸钠、l-酪氨酸、胰水解蛋白、大豆胨、番茄提取物、柠檬酸氢二铵、硫酸锰、乙酸钠、脱脂牛奶蛋白(skimmilkprotein,smp)或其组合。较佳的，所述将阿孙链霉菌以培养基发酵步骤中，培养基包含isp2[internationalstreptomycesproject(isp)mediumno.2]、isp5[internationalstreptomycesproject(isp)mediumno.5]或lb(lysogenybroth)；较佳的，所述将阿孙链霉菌以培养基发酵步骤中，培养基包含1％至5％酪蛋白、1％至5％酵母提取物或其组合。更佳的所述将阿孙链霉菌以培养基发酵步骤中，培养基包含1.5％酪蛋白、2％酪蛋白0.5％酵母提取物或其组合。较佳的，所述将阿孙链霉菌以培养基发酵步骤中，培养基发酵的时间为3至7天；更佳的，所述将阿孙链霉菌以培养基发酵步骤中，培养基发酵的时间为5天。较佳的，所述将该代谢产物以乙酸乙酯萃取步骤中，该代谢产物与乙酸乙酯的比例为3：1。本发明另提供一种阿孙链霉菌的代谢产物，由上述方法获得。本发明另提供一种上述代谢产物用于杀蚊子的应用。较佳的，上述蚊子包含蚊科(culicidae)。更佳的，上述蚊子包含，但不限于埃及斑蚊(aedesaegypti)、白线斑蚊(aedesalbopictus)、阿氏斑蚊(aedesalcasidi)、安氏斑蚊(aedesannandalei)、带纹斑蚊(aedesdesmotes)、加氏斑蚊(aedesgardneriiimitator)、马氏斑蚊(aedesmalikuli)、巴氏斑蚊(aedespatriciae)或伪白线斑蚊(aedespseudalbopicta)。本发明另提供一种阿孙链霉菌的代谢萃取物，由上述方法所获得。本发明另提供一种上述代谢萃取物用于杀蚊子的应用。本发明另提供一种生物制剂，包含上述的代谢产物以及药学上可接受的载剂。较佳的，上述生物制剂为粉剂或液剂。本发明的优点在于本发明提供一新颖的阿孙链霉菌与制备阿孙链霉菌的代谢产物与代谢萃取物的方法，将前述霉菌生物发酵以获得代谢产物；该代谢产物萃取以获得代谢萃取物，两者皆具杀蚊子的能力，并可用于杀蚊子的应用。将所述代谢产物制备成商业可利用的生物制剂，提升杀蚊子的能力，以达成利用微生物的代谢产物杀蚊子的功效。附图说明图1为不同培养基经阿孙链霉菌发酵后的杀蚊能力柱状图；图2a-图2c为isp2、isp5及lb不同培养基于不同时间的杀蚊能力柱状图；图2a为isp2培养基，图2b为isp5培养基，图2c为lb培养基；图3为lb培养基水层萃取物与代谢产物水层萃取物的杀蚊能力柱状图；图4为lb培养基乙酸乙酯萃取物与代谢产物乙酸乙酯萃取物的杀蚊能力柱状图；图5a-图5b为不同萃取物uv图谱；图5a为lb培养基水层萃取物的uv图谱，图5b为代谢产物水层萃取物的uv图谱；图6a-图6b为不同萃取物uv图谱；图6a为lb培养基乙酸乙酯萃取物的uv图谱，图6b为代谢产物乙酸乙酯萃取物的uv图谱。用于专利程序的微生物保存：保藏日期：2018年03月8日；保藏单位：中国典型培养物保藏中心(cctcc)；保藏单位地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072；保藏编号：cctccno:m2018126；分类命名：阿孙链霉菌bt00008(streptomycesabikoensisbt00008)。具体实施方式以下配合附图及本发明的较佳实施例，进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段。制备例1新颖阿孙链霉菌bt00008(streptomycesabikoensisbt00008)菌株鉴定方法本案新颖菌株为阿孙链霉菌bt00008(streptomycesabikoensisbt00008)，是分离自土壤样本，再经细胞壁成分比对为chemotypeic型，属于streptomyces属，再依据16srdna序列比对结果判定为streptomycesabikoensis，寄存于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072)，保藏号为cctccno:m2018126，保藏日期为2018年03月8日，以下为菌株的鉴定方法。1.细胞壁成分鉴定以常规的细胞壁鉴定方法鉴定本发明的阿孙链霉菌，鉴定方法为本领域的习知技术，于此不再详述。结果显示此菌株细胞壁含l-二氨基庚二酸(l-diaminopimelicacid,l-dap)，全细胞含糖为葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)及核糖(ribose)，不含特殊糖类，根据lechevalier等人的分类，属于chemotypeic型，由此判断其为streptomyces属。2.培养特性分析以习知霉菌常用的isp培养平板(ispmediumagar)培养以分析此菌株的特性。在isp2至isp5培养平板环境下生长，其生长情形、营养菌丝(substratemycelia)颜色、气生菌丝(aerialmycelia)颜色、产孢情形如表1所示，菌株在isp4培养平板生长及产孢良好，在isp2及isp3培养平板生长及产孢中等，在isp5培养平板生长中等但不产孢。营养菌丝及气生菌丝颜色如表1。此菌株在ispl、isp6及isp7均不产生黑色素。表1、霉菌培养特性分析3.细菌菌株16s核糖体rna(rrna)鉴定法萃取获得该阿孙链霉菌bt00008之总dna，设计一对16srdna引物对：正向引物16sf1:5`-agtttgatcctggctcaggacgaac-3`(f：seqidno.1)及反向引物16sr1:5`-aaggaggtgatccagccgcaccttc-3`(r：seqidno.2)，进行聚合酶连锁反应(polychainreaction,pcr)，16srdna引物对所获得的产物长度为1514碱基对(basepair,bp)。增殖后的dna产物进行核苷酸定序(dnasequencing)，并以ncbiblast的程式进行线上基因库(genbank)的查询与比对，以进行菌属鉴定。分离萃取的总dna菌株经以16srdna引物对进行16srdna基因进行增幅后，综合细胞壁成分鉴定与培养特性分析，并参考伯杰氏系统细菌学手册(bergey’smanualofsystematicbacteriology)与eztaxon-e资料库比对后，可认定此菌株的型态、生理及生化特性最接近阿孙链霉菌streptomycesabikoensis(1514bp，seqidno.3，相似度达100％)。(agtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacgatgaagcccttcggggtggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgccctgcactctgggacaagccctggaaacggggtctaataccggataygaccksysrmygcatskykgskggtggaaagctccggcggtgcaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtggggtgatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggcttgtcgcgtcggatgtgaaagcccggggcttaaccccgggtctgcattcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgttgggaactaggtgtgggcgacattccacgtcgtccgtgccgcagctaacgcattaagttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcagcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgacatacaccggaaacggccagagatggtcgcccccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcctgtgttgccagcatgcccttcggggtgatggggactcacaggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtcttgggctgcacacgtgctacaatggccggtacaatgagctgcgatgccgtgaggtggagcgaatctcaaaaagccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagttggagttgctagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcccaacccttgtggagggagccgtcgaaggtgggactggcgattgggacgaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaaggtgcggctggatcacctcctt)制备例2制备阿孙链霉菌生长培养基为进行种菌放大培养与最佳培养基测试，所需的培养基与培养平板配方如表2所示，其配制方式为所属领域的技术人员经通常的知识可以独立完成，因此不再赘述。表2、培养基与培养平板isp1酪蛋白[tryptone(pancreaticdigestofcasein)]5.0g酵母提取物(yeastextract)3.0g一次水(distilledwater)1.0lph7.0±0.2isp2酵母提取物4.0g麦芽精10.0g右旋葡萄糖4.0g一次水1.0lph7.0±0.2isp3燕麦[oatmeal(quakerwhiteoats)]20.0g微量盐溶液11.0ml一次水1.0lph7.0±0.2isp4磷酸氢二钾(k2hpo4)1.0g七水硫酸镁1.0g氯化钠(nacl)1.0g硫酸铵[(nh4)2so4]2.0g碳酸钙(caco3)2.0g微量盐溶液11.0ml可溶性淀粉(starch)10.0g一次水1.0lph7.0±0.2isp5l-天冬酰胺(l-asparagine)1g磷酸氢二钾1g微量盐溶液11ml一次水1lph7.0±0.2isp5gl-天冬酰胺1g甘油(glycerol)10g磷酸氢二钾1g微量盐溶液11ml一次水1lph7.0±0.2isp6牛肉提取物[beefextract(pepticdigestofanimaltissue)]15.0g蛋白胨(proteosepeptone)5.0g酵母提取物1.0g柠檬酸铁铵(ferricammoniumcitrate)0.5g磷酸氢二钾1.0g硫代硫酸钠(sodiumthiosulfate)0.08g一次水1lph6.7±0.2isp7l-天冬酰胺1.0gl-酪氨酸(l-tyrosine)0.5g磷酸氢二钾0.5g七水硫酸镁0.5g氯化钠0.5g微量盐溶液21ml甘油15.0g一次水1lph7.3±0.2tsb(trypticsoymediumbroth)胰水解蛋白(tryptone)17.0g大豆胨(soytone)3.0g葡萄糖2.5g氯化钠5.0g磷酸氢二钾2.5g一次水1.0lph7.3±0.2tsa(trypticsoymediumagar)pdb(potatodextrosebroth)番茄提取物(potatoextract)4.0g右旋葡萄糖20.0g一次水1.0lph7.3±0.2pda(potatodextroseagar)番茄提取物4.0g右旋葡萄糖20.0g琼胶20.0g一次水1.0lph7.3±0.2mrs柠檬酸氢二铵(diammoniumhydrogencitrate)2.0g磷酸氢二钾2.0g葡萄糖20.0g硫酸镁0.1g硫酸锰(manganoussulfate)0.05g肉提取物(meatextract)5.0g乙酸钠(sodiumacetate)5.0g普遍蛋白胨(universalpeptone)10.0g酵母提取物5.0g一次水1.0lph6.5±0.2nb(nutrientbroth)牛肉提取物3.0g蛋白胨5.0g一次水1.0lph6.8±0.2na(nutrientagar)ny(nutrientyeastmedium)nb(nutrientbroth)8.0g酵母提取物5.0g七水硫酸镁1.0g一次水1.0lph7.4±0.2lb[miller(luria-bertani)]胰水解蛋白10.0g酵母提取物5.0g氯化钠10.0g一次水1.0lph7.0±0.2smp20ye05脱脂牛奶蛋白(skimmilkprotein,smp)20.0g酵母提取物5.0g一次水1.0lph7.0±0.2微量盐溶液1：七水硫酸亚铁(feso4·7h2o)0.1g四水氯化锰(mncl2·4h2o)0.1g七水硫酸镁(mgso4·7h2o)0.1g一次水100ml微量盐溶液2：一水硫酸亚铁1.36g二水氯化铜0.027g六水氯化钴0.04g氯化锌0.02g硼酸2.85g氯化亚锰1.8g酒石酸钾钠1.77g一次水100ml实施例1不同培养基的杀虫效力试验阿孙链霉菌菌株活化后，取其分生孢子悬浮液，经定量以1％的接种源浓度制备于100ml的不同培养基中，于30℃，200rpm进行培养，分别培养120小时后试验培养基的杀虫效果。试验的蚊子为埃及斑蚊品系，分别采卵、饲育幼虫、采蛹与饲育成虫，以提供试验的虫体。实验时，取5ml的待测液体加入含有30只三龄幼虫(孵化后三天)的45ml曝气逆渗透水中，控制组则加入该待测液体的培养基5ml于上述的45ml曝气逆渗透水中，以保鲜膜封口后于特定时间观察个试验组的死亡虫数。结果如图1所示，图1为10倍稀释的经阿孙链霉菌发酵5天的培养基，于24小时、48小时与72小时观察其杀孑孓的能力，从13种培养基中挑选杀虫活性较佳的3种培养基，分别为lb、isp2与isp5，将此三种培养基以相同条件进行不同时间(3天、5天、7天)培养比较不同稀释浓度(5倍或10倍)下杀蚊的效果，结果如图2a-图2b，图2a所示，阿孙链霉菌于isp2培养至第5天其杀蚊效果约为95％，培养时间延长至7天后，其杀蚊效果为70％。而如图2b所示，isp5在5倍稀释下三种培养时间(3天、5天、7天)后的杀蚊效果皆约为90％左右，稀释至10倍后杀蚊效力约80％。最后，以如图2c所示，lb培养基进行发酵以5倍稀释进行测试，杀蚊效力皆位于90％左右，尽管稀释至10倍，比较3天、5天、7天的发酵时间，皆维持90％以上的杀蚊效果，显示以此培养基的配方可能可以提供相对稳定链霉菌杀蚊的作用机制。接着，将制备例1的阿孙链霉菌加入lb培养基进行发酵，发酵方法如上所述，获得一lb发酵液，将该lb发酵液进行埃及斑蚊成虫与幼虫的致死效果试验，经试验得知lb发酵液对于孑孓的lc50浓度应为原液稀释2,879.2倍。实施例2阿孙链霉菌的代谢产物萃取与杀蚊功效取制备例1所获得的阿孙链霉菌菌株bt00008，以lb培养基(表2)于5l发酵槽中进行发酵，设定搅拌速度200rpm、进气速率1vvm、槽压0.5kg/cm2、温度30℃，发酵时间120小时，获得一代谢产物。阿孙链霉菌的代谢萃取物取阿孙链霉菌的该代谢产物以真空浓缩机进行浓缩，每次浓缩时取300ml发酵液浓缩至10ml。将浓缩液加入一百倍体积甲醇萃取过滤杂质,再以减压浓缩干燥,获得一代谢产物甲醇萃取物,甲醇萃取物以十倍体积溶于水中,以等水体积的乙酸乙酯萃取，收集水层减压浓缩干燥，获得一代谢产物水层萃取物；收集乙酸乙酯层减压浓缩干燥，获得一代谢产物乙酸乙酯萃取物，以进行杀蚊主成分分析。亦将空白的lb培养基以乙酸乙酯萃取，收集水层获得一lb培养基水层萃取物、收集乙酸乙酯层获得一lb培养基乙酸乙酯萃取物。如图3与图4所示，图3为比较lb培养基水层萃取物与代谢产物水层萃取物的杀蚊功效，从结果可得知在代谢产物水层萃取物浓度为100ppm时，施予蚊虫72小时有25％的杀蚊功效，相同浓度的lb培养基水层萃取物接近20％；图4为比较lb培养基乙酸乙酯萃取物与代谢产物乙酸乙酯萃取物的杀蚊功效，从结果可得知在代谢产物乙酸乙酯萃取物浓度为100ppm时，有50％的杀蚊功效，相同浓度的lb培养基乙酸乙酯萃取物接近20％，综以上述，有机层与水层皆存在杀虫物质。将有机层与水层以hplc分离并以uv图谱分析。如图5a-图5b与图6a-图6b所示，于图5a-图5b的lb培养基水层萃取物与代谢产物水层萃取物两者图谱之间相似，但于图6a-图6b的代谢产物乙酸乙酯萃取物相对于lb培养基乙酸乙酯萃取物的图谱有所差异。实施例3最适化培养基的调整在生物活性的测试过程中发现，lb培养基具有影响阿孙链霉菌代谢产物活性的能力。因此，希望除去lb培养基本身的干扰，而找出最适化杀蚊与最佳化培养基的平衡点。lb培养基中的组成成分为胰水解蛋白、酵母提取物与氯化钠，试验设计以lb培养基为基底，额外添加等量各组成成分，或加入氮源(硫酸铵、磷酸氢二铵以及硝酸铵)以测试其经实施例2的方法将阿孙链霉菌bt00008发酵后的本实施例发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫的死亡率。试验结果如表3所示，lb培养基在去除氯化钠时，埃及斑蚊三龄幼虫的死亡率与原培养基相似，其他试验组三龄幼虫死亡率均下降，根据试验结果推测，lb培养基成分中的氯化钠浓度会影响对三龄幼虫的杀虫效果，后续培养基将根据此结果设计并调整培养基成分，以降低培养基本身毒杀效果的干扰。表3、修改lb培养基的本实施例发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫死亡率的影响：如表4所示，在lb培养基中添加0.5％碳源，测试本实施例发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫的死亡率。试验结果显示，若添加0.5％葡萄糖或0.5％甘油于lb培养基中，所得本实施例发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫的死亡率结果相似。添加0.5％麦芽精或0.5％蔗糖，所得本实施例发酵液则有次佳的埃及斑蚊三龄幼虫死亡率。此外，若加入0.5％表4的其他碳源如糊精、乳糖、及淀粉，则本实施例发酵液与lb培养基发酵液相较之下，失去生物活性并呈现显著差异。综合以上结果，推测添加的十种碳源配方对于阿孙链霉菌bt00008菌种发酵后所获得的代谢产物较无显著提升杀蚊效果。表4添加单一碳源培养基的本实施例发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫死亡率的影响：如表5所示，在lb培养基中添加0.5％氮源，测试本实施例发酵液对对埃及斑蚊三龄幼虫的死亡率。试验结果显示，若添加0.5％蛋白胨、脱脂牛奶蛋白(skimmilkprotein,smp)或酵母粉于lb培养基中，所得本实施例发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫的死亡率的结果相似；若加入0.5％天冬酰胺、酪蛋白或是黄豆蛋白(soybeanprotein,sp)，则其发酵液与lb培养基发酵液相较之下，失去对埃及斑蚊三龄幼虫的杀虫效果且呈现显著差异。表5、添加单一氮源培养基的本实施例发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫死亡率的影响：比较表4及表5，添加0.5％碳源或氮源，如提供氮源的蛋白胨、脱脂牛奶蛋白或酵母粉、以及提供碳源的葡萄糖与甘油添加于lb培养基中，其发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫死亡率具有效果，对于发酵培养基成分的选择，再次设计不同组合的培养基配方，以期能提高发酵对埃及斑蚊三龄幼虫的杀虫能力，培养基修改配方与观察数据整理如表6。如表6所示，11种修改配方在第48小时杀蚊能力明显不同，lb培养基添加不同比例甘油，其发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫的死亡率随甘油浓度于培养基中比例提升而上升；酪蛋白+酵母提取物或脱脂牛奶蛋白(smp)+酵母提取物对蚊虫死亡率亦有提升效果。第72小时观察结果更具显著差异性。上述观察结果发现至少有七种培养基具有更好的杀虫效果。表6、lb添加配方的本实施例发酵液对埃及斑蚊三龄幼虫死亡率的影响：以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。序列表<110>百泰生物科技股份有限公司<120>阿孙链霉菌、其代谢产物、其制备方法及其杀蚊子的应用<130>gai18tw3798<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>25<212>dna<213>artificialsequence<220><223>16srdnafowardprimer<400>1agtttgatcctggctcaggacgaac25<210>2<211>25<212>dna<213>artificialsequence<220><223>16srdnareverseprimer<400>2aaggaggtgatccagccgcaccttc25<210>3<211>1514<212>dna<213>streptomycesabikoensis<220><221>misc_feature<222>(164)..(186)<223>yiscort;kisgort;siscorg;risaorgandmisaorc<400>3agtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacga60tgaagcccttcggggtggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctgccct120gcactctgggacaagccctggaaacggggtctaataccggataygaccksysrmygcats180kykgskggtggaaagctccggcggtgcaggatgagcccgcggcctatcagcttgttggtg240gggtgatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacact300gggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgg360gcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctct420ttcagcagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaactacgtg480ccagcagccgcggtaatacgtagggcgcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagag540ctcgtaggcggcttgtcgcgtcggatgtgaaagcccggggcttaaccccgggtctgcatt600cgatacgggcaggctagagttcggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggtgaaat660gcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgggccgatactgacgct720gaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaac780gttgggaactaggtgtgggcgacattccacgtcgtccgtgccgcagctaacgcattaagt840tccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgca900caagcagcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggcttgac960atacaccggaaacggccagagatggtcgcccccttgtggtcggtgtacaggtggtgcatg1020gctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttg1080tcctgtgttgccagcatgcccttcggggtgatggggactcacaggagactgccggggtca1140actcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtcttgggctgcaca1200cgtgctacaatggccggtacaatgagctgcgatgccgtgaggtggagcgaatctcaaaaa1260gccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagttggagttgctagta1320atcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtca1380cgtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcccaacccttgtggagggagccgtcg1440aaggtgggactggcgattgggacgaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaaggtgcggc1500tggatcacctcctt1514当前第1页1 2 3