本发明所属生物医药技术领域，涉及一种产红景天苷的重组菌及构建方法和红景天苷的生物生产方法。
背景技术
红景天苷(salidroside)，分子式为c14h20o7，分子量为300.30。红景天苷具有良好的抗高原反应、抗氧化、抗辐射、抗疲劳等多种药理活性，被亚欧国家广泛应用于脑缺血、疲劳、缺氧和神经退化性疾病。
红景天苷通常从3-5年的野生红景天(rhodiola)的根中提取，代价很高。因为红景天分布在北半球海拔2500-5500米以上的地区，如阿尔泰山脉、喜马拉雅地区，生长及其缓慢。化学方法合成红景天苷需要进行选择性保护、活化或使用昂贵的金属催化剂，不利于工业生产。
技术实现要素：
本发明利用一种酮基脱羧酶基因以及一种糖基转移酶基因，在工程大肠杆菌中实现了以葡萄糖等生物质碳源合成红景天苷，使生产成本最低化。
本发明的第二个目的是提供产红景天苷的重组菌的构建方法。
本发明的第三个目的是提供产红景天苷的重组菌发酵制备红景天苷的方法。
本发明的技术方案概述如下：
产红景天苷的重组菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：
(1)人工全合成带trc启动子的酮基脱羧酶基因skdc，所述序列如seqidno.1所示；人工全合成带tac启动子的糖基转移酶基因sugt2,所述序列如seqidno.2所示；
(2)将带trc启动子的skdc基因，通过λ-red同源重组技术整合到大肠杆菌sybe-002447中，同时敲除feab基因，得到trs1菌株；
(3)将带trc启动子的sugt2基因，通过λ-red同源重组技术整合到大肠杆菌trs1菌株中，同时敲除laci基因，得到sdr1菌株。
按上述方法构建产红景天苷的重组菌sdr1菌株。
产红景天苷的重组菌sdr1制备红景天苷的方法，其特征是包括如下步骤：
将重组菌sdr1菌株接种在lb培养基中，37℃，220rpm，震荡培养2-4h，在od600到达0.8-1.0之间时，转接到含有葡萄糖的m9培养基中进行发酵36h，生产红景天苷。
本发明的优点：
红景天苷具有抗高原反应、抗氧化、保护心脏等多种药理活性，应用于药品、食品、化妆品品等工业生产中。本发明使用工程大肠杆菌，葡萄糖为碳源，利用组成型表达发酵生产红景天苷，微生物合成成本低、产量高。本发明可解决红景天苷的来源问题，同时最大限度的降低了生产成本，有利于工业化生产。
具体实施方式
利用一种酮基脱羧酶基因skdc以及一种糖基转移酶基因sugt2，在工程大肠杆菌中实现了以葡萄糖为生物质碳源合成红景天苷生产成本最低化。
原始底盘大肠杆菌是高产酪氨酸的菌株，名称为sybe-002447，分类命名：大肠埃希氏菌(escherichiacoli)。现于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号为cgmccno.7962。保藏时间为2013年7月22日，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。
本发明所用pkd46质粒购买自普如汀生物技术(北京)有限公司。
lb培养基组成为：10g/lnacl、10g/l蛋白胨和5g/l酵母粉，余量为水，0.1mpa压力121℃下灭菌20min。
含有葡萄糖的m9培养基组成为：0.5g/lnacl、1.0g/lnh4cl、3.0g/lkh2po4、17.1g/lna2hpo4·12h2o、0.025％酵母粉，余量为水，培养基在0.1mpa压力121℃下灭菌20min。灭菌完后加入过膜的终浓度为5mmmgso4、0.1mmcacl2以及灭菌的10g/l葡萄糖。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
本发明设计了红景天苷的人工生物合成途径，详细的合成过程如下：以葡萄糖或者其他生物质为碳源，经过酪氨酸途径合成对羟基苯丙酮酸。对羟基苯丙酮酸在酮基脱羧酶(skdc)的催化作用下合成4-羟基苯乙醛，4-羟基苯乙醛在大肠杆菌內源乙醇脱氢酶(adh)催化下生成4-羟基苯乙醇(酪醇)，在糖基转移酶(sugt2)的催化下，酪醇与udp-葡萄糖结合合成红景天苷。
实施例1酮基脱羧酶基因skdc和糖基转移酶基因sugt2表达盒的设计
优选酮基脱羧酶基因，使用jcat在线密码子优化软件(http：//www.jcat.de)结合optimizer在线密码子优化工具(http://genomes.urv.es/optimizer/)，以大肠杆菌对密码子的偏好性进行优化，设计全长skdc基因，并在基因前加入trc启动子，构成skdc表达盒，合成序列如seqidno.1示。
优选糖基转移酶基因，使用jcat在线密码子优化软件(http：//www.jcat.de)结合optimizer在线密码子优化工具(http://genomes.urv.es/optimizer/)，以大肠杆菌对密码子的偏好性进行优化，设计全长sugt2基因，并在基因前加入trc启动子，构成sugt2表达盒，合成序列如seqidno.2示。
实施例2λ-red同源重组方法敲除feab基因同时整合skdc基因到底盘菌株sybe-002447染色体上。
敲除feab基因同时整合skdc基因到底盘菌株sybe-002447染色体上的底盘菌株构建过程详细步骤如下：
敲除feab基因同时整合skdc基因到底盘菌株sybe-002447染色体上的底盘菌株构建过程详细步骤如下：
1、整合片段的制备：以kf(seqidno.3)为上游引物，以kr(seqidno.4)为下游引物，以seqidno.1为模板，采用phantamaxsuper-fidelitydna聚合酶，pcr制备kc片段。pcr应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。将得到的kc片段利用pcr产物回收试剂盒纯化回收。
2、同源重组：把pkd46质粒导入菌种sybe-002447，获得sybe-002447/pkd46，将活化的菌种sybe-002447/pkd46，接种于10mllb液体培养基中，30℃，200rpm，培养至od600为0.4-0.6。加入终浓度为10mml-阿拉伯糖，继续培养3h，4℃下4000rpm离心8min，收集细胞。弃上清，加入冰预冷的10％甘油洗涤细胞2次，制备成电转感受态细胞。取kc片段7.5μl，加入到100μl电转感受态细胞中，轻轻旋转混匀。将混合物加入2mm的冰预冷电击杯中，2.5kv电击4-6ms。然后加入1mllb培养基，37℃复苏2h后涂布平板，37℃过夜培养。
3、整合菌株筛选：挑取单菌落，以tf(seqidno.5)为上引，tr(seqidno.6)为下引，采用taqdna聚合酶，进行菌落pcr验证。pcr条带大小约为1900bp时，获得敲除feab基因同时将skdc基因整合到底盘菌株sybe-002447染色体上的菌株trs1/pkd46。菌落pcr应条件为预变性：97℃，5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1.5min，25个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
4、缺失pkd46：挑取pcr验证正确单菌落，在42℃下无抗生素的平板上连续传代3次。在氨苄青霉素抗性平板和无抗性平板上同时接种，氨苄青霉素抗性平板不生长，无抗性平板上生长的菌落为pkd46缺失菌株，即获得敲除feab基因同时将skdc基因整合到底盘菌株sybe-002447染色体上的菌株trs1。37℃液体lb培养后，甘油保存。
实施例3λ-red同源重组方法敲除laci基因同时整合sugt2基因到大肠杆菌底盘菌株trs1染色体上。
敲除laci基因同时整合sugt2基因到大肠杆菌底盘菌株trs1染色体上的菌株构建过程详细步骤如下：
1、整合片段的制备：以uf为上游引物(seqidno.7)、以ur为下游引物(序列seqidno.8)，以seqidno.2为模板,pcr制备uc片段。pcr反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；4℃保存。将得到的uc片段利用pcr产物回收试剂盒纯化回收。
2、同源重组：将活化的菌种trs1/pkd46，接种于10mllb液体培养基中，30℃，200rpm，培养至od600为0.4-0.6。加入终浓度为10mml-阿拉伯糖，继续培养3h，4℃下4000rpm离心8min，收集细胞。弃上清，加入冰预冷的10％甘油洗涤细胞2次，制备成电转感受态细胞。取uc片段7.5μl，加入到100μl电转感受态细胞中，轻轻旋转混匀。将混合物加入2mm的冰预冷电击杯中，2.5kv电击4-6ms。然后加入1mllb培养基，37℃复苏2h后涂布平板，过夜培养。
3、整合菌株的筛选：挑取单菌落，以if(20bplaci上游同源臂，seqidno.9)为上引，ir(20bpsugt2下游引物，seqidno.10)为下引，采用taqdna聚合酶，进行菌落pcr验证。pcr条带大小约为1500bp时，获得整合sugt2基因到底盘菌株trs1染色体上的菌株sdr1/pkd46。
4、缺失pkd46：挑取pcr验证正确单菌落sdr1/pkd46，在42℃于无抗平板传代3次。在氨苄青霉素抗性平板和无抗性平板上同时接种，氨苄青霉素抗性平板不生长，无抗性平板上生长的菌落为pkd46缺失菌株，即获得敲除laci基因同时将sugt3基因整合到菌株trs1染色体上的菌株sdr1。37℃液体lb培养后，甘油保存。
实施例4重组菌trs1的发酵及检测
将重组菌trs1接种在lb培养基中，37℃，220rpm，震荡培养2-4h，在od600到0.8-1.0之间时，然后转接到含有葡萄糖的m9培养基中发酵36h，合成酪醇。
在发酵过程中不同时间点，取发酵液1ml，然后12000r/min离心10分钟，取上清，用0.22μm的微孔滤膜过滤后进行高效液相色谱(hplc)系统检测。色谱条件如下：c18(4.6×250mm)色谱柱；流动相为20％甲醇-80％超纯水溶液-0.1％甲酸；流速1ml/min；进样量20μl；柱温室温；紫外检测器，检测波长225nm。
trs1菌株摇瓶发酵36h，酪醇产量为1.6g/l。
实施例5重组菌sdr1的发酵及检测
将重组菌sdr1接种在lb培养基中，37℃，220rpm，震荡培养2-4h，在od600到0.8-1.0之间时，然后转接到含有葡萄糖的m9培养基中发酵36h，合成红景天苷。
在发酵过程中不同时间点，取发酵液1ml，然后12000r/min离心10分钟，取上清，用0.22μm的微孔滤膜过滤后进行高效液相色谱(hplc)系统检测。色谱条件如下：c18(4.6×250mm)色谱柱；流动相为20％甲醇-80％超纯水溶液-0.1％甲酸；流速1ml/min；进样量20μl；柱温室温；紫外检测器，检测波长225nm。
sdr1菌株摇瓶发酵36h，红景天苷产量为0.7g/l。
序列表
<110>天津大学
<120>一种红景天苷的生物生产方法
<160>10
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1847
<212>dna
<213>人工序列()
<400>1
ttgacaattaatcatccggctcgtataatgagaggatggctccggttaaacaggacttca60
acatcgacgttcagaccatcgaaaacaccgacatctctctgtctgaatacatctacctgc120
gtatcgctcaactgggtgttaaatctatcttcggtgttccgggtgacttcaacctgaacc180
tggttgacgaactggacaaagttccgcagctgaaatggatcggttgctgcaacgaactga240
acgctacctacgctgctgacggttacgctaaagctagtggtactatcggtgttgttgtta300
ccacctacggtgttggtgaactgtctgctatcaacggtatcgctggtgctttcgctgaat360
acgctccggttctgcacatcgttggtacttctgctatggctaccaaacgtctggaacacg420
ttcacaacatccaccacctggctggttctaaaaacttcctggaccgtccggaccactaca480
tctacgaaaaaatggttgacgacatctgcatcgttaaagaatctctgtctgaaatcgaaa540
acgcttgcggtcagatcgacaacgctatcgttcagacctacctgctgtctcgtccgggtt600
acctgttcctgccgcgtaacatggctaccatgaaagttccgcgtgaacgtctgttcaacc660
agccgctggctctggaacgtgttgacctgcacccgggtgaaaccctgcaagttgttgaaa720
aaatcctggaaaaattctaccacgctaaagaaccggctctgatcgttgactacctgaccc780
gtccgttccgtatgatggaaaactgctctaaactgatcggtgctctggaaaacaaagtta840
acatcttctctcgtccgatgtctaaaggtttcgttgacgaatctcacccgcgttacatcg900
gttgctacatcggtaaacagtctaaacacccgtctacctctgacatcctggaaaaaaaat960
ctgacttcatcctgtctgttggtactttcgacgttgaaaccaacaacggtggtttcacct1020
ctaaactgccgcaggaacacctggttgaactgaacccgcacttcacccgtgttggtactc1080
aatgcttctctaacgttaacatgtgccacgttctgccgctgctggcttctaaactgcgtg1140
gtgacctgatctctatggctaccgttcacccgaacgacttctctctgcgtaaaaaagaaa1200
aagctcaagacaaaatgaaagctctgaaccagtctcacctggttaaatctaccgaactgc1260
tgctgaacgctaacgacaccctgatcgttgaaacctgctctttcatgttcgctgttccgg1320
acatcgctttcccgaacaacacccagttcatctctcaatctttctacaactctatcggtt1380
acgctctgccggctaccctgggtgtttctatcgctaaacgtgacttccgtaaaccgggta1440
aagttgttctgatccagggtgacggttctgctcaaatgaccatccaggaactggctacca1500
tggttcgtcagaaagttaaaccgaccatcctgctgctgaacaacgaaggttacaccgttg1560
aacgtatgatcctgggtccgaccaaagaatacaacgacatcgctccgaactgggactgga1620
ccggtatgctgcgtgctttcggtgacatccgtggtcactctaaatctatctctatcgaca1680
cctgcggtcgtctggacaaactggttcagacccgtgaatttcaggaaccgacccacctga1740
acttcgttgaactgatcctgggtcgtatggacgctccggaacgtttcgctaacatggtta1800
aagaaatcgctaacctggaacacgcttctaaatctatccactaataa1847
<210>2
<211>1505
<212>dna
<213>人工序列()
<400>2
ttgacaattaatcatccggctcgtataatgagaggatgggttctcagatcatccacaact60
ctcagaaaccgcacgttgtttgcgttccgtacccggctcagggtcacatcaacccgatga120
tgcgtgttgctaaactgctgcacgctcgtggtttttacgttacattcgttaacaccgttt180
acaaccacaaccgtttcctgcgttctcgtggttctaacgctctggacggtctcccatcgt240
tccgtttcgaatcgatcgctgacggtctgccggaaaccgacatggacgctacccaggaca300
tcaccgctctgtgcgaatctaccatgaaaaactgcctggctccgttccgtgaactgctgc360
agcgtatcaacgctggtgacaacgttccgccggtttcttgcatcgtttctgacggttgca420
tgtctttcaccctggacgttgctgaagaactgggtgttccggaagttctgttctggacca480
cctctggctgcgcgttcctggcttacctccacttctacctgttcatcgaaaaaggtctgt540
gcccgctgaaagacgaatcttacctgaccaaagaatacctggaagacaccgttatcgact600
tcatcccgaccatgaaaaacgttaaactgaaagacatcccgtctttcatccgtaccacca660
acccggacgacgttatgatctctttcgctctgcgtgaaaccgaacgtgctaaacgtgctt720
ctgctatcatcctgaacaccttcgacgacctggaacacgacgttgttcacgctatgcagt780
ctatcctcccaccggtatacagcgttggtccgctgcacctgctggctaaccgtgaaatcg840
aagaaggttctgaaatcggtatgatgtcttctaacctgtggaaagaagaaatggaatgcc900
tggactggctggacaccaaaacccagaactctgttatctacatcaacttcggttctatca960
ccgttctgtctgttaaacagctggttgaatttgcttggggtctggctggttctggtaaag1020
aatttctgtgggttatccgtccggacctggttgctggtgaagaagctatggttccgccgg1080
acttcctgatggaaaccaaagaccgttctatgctggcttcttggtgcccgcaggaaaaag1140
ttctgtctcacccggctataggcggcttcctgacccactgcggttggaactctatcctgg1200
aatctctgtcttgcggtgttccgatggtttgctggccgttcttcgctgaccagcagatga1260
actgcaaattctgctgcgacgaatgggacgttggtatcgaaatcggtggtgacgttaaac1320
gtgaagaagttgaagctgttgttcgtgaactgatggacggtgaaaaaggtaaaaaaatgc1380
gtgaaaaagctgttgaatggcagcgtctggctgaaaaagctaccgaacacaaactgggtt1440
cttctgttatgaacttcgaaaccgttgtttctaaattcctgctgggtcagaaatctcagg1500
actaa1505
<210>3
<211>70
<212>dna
<213>人工序列()
<400>3
ttgtcgctgcgtacactgaaatcacactgggtaaataataaggaaaagtgttgacaatta60
atcatccggc70
<210>4
<211>70
<212>dna
<213>人工序列()
<400>4
agacaaaaaaacggcaccaggtgccgttttttacttatgagcgaaccagattagtggata60
gatttagaag70
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>人工序列()
<400>5
gtaaataataaggaaaagtg20
<210>6
<211>20
<212>dna
<213>人工序列()
<400>6
ttagtggatagatttagaag20
<210>7
<211>70
<212>dna
<213>人工序列()
<400>7
tcggcgaagccaagcccagcgcagatgcggtcctcaatcgcgcgttgcgcatgtctggta60
ctccgcacat70
<210>8
<211>70
<212>dna
<213>人工序列()
<400>8
gcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatttagtcctga60
gatttctgac70
<210>9
<211>20
<212>dna
<213>人工序列()
<400>9
tcctcaatcgcgcgttgcgc20
<210>10
<211>20
<212>dna
<213>人工序列()
<400>10
ttagtcctgagatttctgac20