抗IDH1R132H单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗idh1r132h单克隆抗体及其应用。

背景技术

神经胶质瘤是成人中最常见的原发性颅内肿瘤，严重影响患者的认知、语言及运动等功能。其5年病死率在全身肿瘤中位列第三，是全球难治性肿瘤之一。按照胶质瘤细胞与星形胶质细胞或少突胶质细胞在形态学上的相似性，who胶质瘤分类方案将成人弥散性胶质瘤主要划分为星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤；同时根据细胞的异型性、细胞增殖情况、血管增生以及坏死情况等，将各形态学亚型的胶质瘤按照恶性级别进一步诊断为i到iv级。其中i、ii级为低恶性度胶质瘤(i级星形细胞瘤仅发生于儿童)，ⅲ、ⅳ为高恶性度胶质瘤。在初次诊断的胶质瘤病人中，50％以上为恶性程度最高的iv级胶质瘤(即胶质母细胞瘤，gbm)，gbm患者的中位生存期仅有14个月左右，目前最好的治疗方案也只能短暂地延长患者生存期。此外，低恶性级别胶质瘤常常进展为高恶性级别的胶质瘤，导致病情恶化。不同的低恶性级别胶质瘤进展速度差异较大，其中机制仍不清楚。

异柠檬酸脱氢酶(idh)是三羧酸循环的关键酶，主要分为idh1、idh2和idh3亚型。研究表明，idh1(r132h)突变(idh1第132位由精氨酸突变为组氨酸，下文简称为idh1突变)为部分神经胶质瘤的主要标志物。无论是ⅲ、ⅳ级的高恶性度胶质瘤，还是ii级的低恶性度胶质瘤，含idh1突变与不含idh1突变的胶质瘤在其细胞学和遗传学起源、及临床表型上均有本质区别。含idh1突变的胶质瘤可能起源于少突胶质祖细胞，大约40％的idh1突变胶质瘤携带染色体1p19q共缺失，发病中位年龄在40岁左右，生存期可达10年以上。而idh1野生型胶质瘤可能起源于神经干细胞，携带与7号染色体扩增相伴随的10号染色体丢失，发病年龄在50岁以上，中位生存期为15个月以下。因此，2016年的who胶质瘤诊断指南将idh1突变定义为胶质瘤诊断和治疗的一个重要标志物。

胶质瘤样本中的idh1突变，可以用sanger测序、焦磷酸测序或ngs测序检测，但基于测序的检测方案无法与肿瘤的形态学结合，而胶质瘤样本都不同程度包含正常脑组织，因此，有一部分样本中的测序结果可能是假阴性结果。而基于抗体的免疫组化检测可与形态学紧密结合，能鉴别正常脑组织和胶质瘤组织，因此避免了测序实验中的假阴性结果。德国dianova公司首先建立了针对idh1突变的单克隆抗体(h09克隆)，证明单克隆抗体在诊断idh1突变的可行性。国内虽然已有单位申请针对idh1突变的单克隆抗体，但尚无已经授权的专利和临床许可的产品。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种抗idh1r132h单克隆抗体。

本发明提供的抗idh1r132h单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；所述重链可变区包括三个互补决定区cdrh1、cdrh2、cdrh3；所述轻链可变区包括三个互补决定区cdrl1、cdrl2、cdrl3；

所述cdrh1的氨基酸序列为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)seqidno.2第50-54位所示的氨基酸序列；

(a2)将seqidno.2第50-54位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；

(a3)与seqidno.2第50-54位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；

所述cdrh2的氨基酸序列为如下(a4)或(a5)或(a6)：

(a4)seqidno.2第69-85位所示的氨基酸序列；

(a5)将seqidno.2第69-85位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；

(a6)与seqidno.2第69-85位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；

所述cdrh3的氨基酸序列为如下(a7)或(a8)或(a9)：

(a7)seqidno.2第118-122位所示的氨基酸序列；

(a8)将seqidno.2第118-122位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；

(a9)与seqidno.2第118-122位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；

所述cdrl1的氨基酸序列为如下(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)seqidno.4第43-58位所示的氨基酸序列；

(b2)将seqidno.4第43-58位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；

(b3)与seqidno.4第43-58位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；

所述cdrl2的氨基酸序列为如下(b4)或(b5)或(b6)：

(b4)seqidno.4第74-80位所示的氨基酸序列；

(b5)将seqidno.4第74-80位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；

(b6)与seqidno.4第74-80位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；

所述cdrl3的氨基酸序列为如下(b7)或(b8)或(b9)：

(b7)seqidno.4第113-121位所示的氨基酸序列；

(b8)将seqidno.4第113-121位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；

(b9)与seqidno.4第113-121位所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列。

上述抗体中，所述重链可变区的氨基酸序列为如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)seqidno.2所示的氨基酸序列；

(c2)将seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；

(c3)与seqidno.2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列；

所述轻链可变区的氨基酸序列为如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)seqidno.4所示的氨基酸序列；

(d2)将seqidno.4所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的氨基酸序列；

(d3)与seqidno.4所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的氨基酸序列。

进一步的，所述重链可变区的编码基因序列为如下(e1)或(e2)或(e3)：

(e1)seqidno.1所示的dna分子；

(e2)与(e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述抗体重链可变区的dna分子；

(e3)在严格条件下与(e1)或(e2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述抗体重链可变区的dna分子；

所述轻链可变区的编码基因序列为如下(f1)或(f2)或(f3)：

(f1)seqidno.3所示的dna分子；

(f2)与(f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述抗体轻链可变区的dna分子；

(f3)在严格条件下与(f1)或(f2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述抗体轻链可变区的dna分子。

本发明的另一个目的是提供一株分泌上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株10g5-1。

本发明提供的分泌上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株10g5-1的保藏编号为cgmccno.15783。

本发明的杂交瘤细胞株10g5-1的分类命名为杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株已于2018年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmccno.15783。

本发明还有一个目的是提供与上述抗体相关的生物材料。

本发明提供的与上述抗体相关的生物材料为如下(1)-(3)中任一种：

(1)编码上述抗体或其可变区的核酸分子；

(2)含有(1)所述的核酸分子的载体；

(3)含有(1)所述的核酸分子或(2)所述的载体的宿主细胞。

上述生物材料中，所述核酸分子为如下(g1)-(g3)中任一种：

(g1)seqidno.1或seqidno.3所示的dna分子；

(g2)与(g1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述抗体或其可变区的dna分子；

(g3)在严格条件下与(g1)或(g2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述抗体或其可变区的dna分子。

本发明还有一个目的是提供上述抗体的衍生物。

本发明提供的衍生物为如下(h1)-(h6)中任一种：

(h1)含有上述抗体的融合蛋白；

(h2)含有上述抗体或其抗原结合部分的多特异或多功能分子；

(h3)含有上述抗体或其抗原结合部分的组合物；

(h4)含有上述抗体或其抗原结合部分的免疫偶联物；

(h5)将上述抗体或其抗原结合部分进行修饰和/或改造后得到的抗体；

(h6)含有上述互补决定区的抗体。

本发明还有一个目的是提供一种抗idh1r132h单克隆抗体。

本发明提供的抗idh1r132h单克隆抗体是由保藏编号为cgmccno.15783的杂交瘤细胞株分泌的。

本发明还有一个目的是提供一种检测或辅助检测待测样本是否携带idh1r132h突变的试剂盒。

本发明提供的检测或辅助检测待测样本是否携带idh1r132h突变的试剂盒包括上述抗idh1r132h单克隆抗体。

本发明最后提供了上述抗体或上述杂交瘤细胞株或上述生物材料或上述衍生物或上述试剂盒的新用途。

本发明提供了上述抗体或上述杂交瘤细胞株或上述生物材料或上述衍生物或上述试剂盒在检测待测样本是否携带idh1r132h突变中的应用。

本发明还提供了上述抗体或上述杂交瘤细胞株或上述生物材料或上述衍生物或上述试剂盒在制备检测待测样本是否携带idh1r132h突变的产品中的应用。

本发明还提供了上述抗体或上述杂交瘤细胞株或上述生物材料或上述衍生物或上述试剂盒在诊断或辅助诊断神经胶质瘤中的应用。

本发明还提供了上述抗体或上述杂交瘤细胞株或上述生物材料或上述衍生物或上述试剂盒在制备诊断或辅助诊断神经胶质瘤的产品中的应用。

本发明提供了一种抗idh1r132h单克隆抗体，并在胶质瘤样本中检测了其特异性和灵敏度。通过实验证明：本发明的抗idh1r132h单克隆抗体特异性好、灵敏度高，可用于检测胶质瘤样本中的idh1r132h突变。

附图说明

图1为10g5-1抗体和h09抗体与r132h突变型idh1抗原的亲和力检测的结果比较。

图2为使用10g5-1抗体对五例idh1r132h焦磷酸测序突变型样本进行免疫组化染色的结果。

图3为使用1og5-1抗体对五例idh1r132h焦磷酸测序野生型样本进行免疫组化染色的结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、抗idh1r132h单克隆抗体的制备

一、抗原多肽的制备

idh1野生型抗原多肽的氨基酸序列如下：kpiiigrhaygdqyc。本发明的idh1r132h突变抗原多肽的氨基酸序列如下：kpiiighhaygdqyc(编号：u6184cb080-d)，委托南京金斯瑞生物科技公司使用化学方法合成，其中，h为抗原多肽序列中的突变位点。

二、动物免疫

将步骤一制备的idh1r132h突变抗原多肽与klh偶联后免疫balb/c小鼠。具体步骤如下：

1、将步骤一获得的idh1r132h突变抗原多肽与弗氏完全佐剂按1：1的比例混匀，使抗原多肽的浓度为0.5毫克/毫升，得到抗原多肽溶液。

2、基础免疫：将步骤一获得的抗原多肽溶液与klh载体蛋白偶联，得到klh偶联多肽。将klh偶联多肽采用四肢肌肉注射的方式注射balb/c健康小鼠，注射剂量为每只小鼠注射50微克。

3、加强免疫：基础免疫后，分别在第二周、第四周、第七周进行加强免疫，将klh偶联多肽采用四肢肌肉注射的方式注射balb/c小鼠，注射剂量为每只小鼠注射25微克。

三、细胞融合和克隆筛选

从第2次加强免疫开始，每次免疫后第7天，从小鼠眼眶采血，采用elisa测定抗体效价，筛选针对idh1r132h突变抗原多肽(kpiiighhaygdqyc)有高效价免疫反应，同时对idh1野生型多肽(kpiiigrhaygdqyc)具有相对低效价免疫反应的小鼠血清，并取其脾脏细胞，与小鼠浆细胞瘤sp2/0细胞株融合。融合后细胞培养于15块96孔培养板，经hat培养基筛选存活细胞，扩增至24孔培养板，取其培养上清，采用elisa检测其针对idh1r132h突变抗原多肽(kpiiighhaygdqyc)及idh1野生型多肽(kpiiigrhaygdqyc)的差异性免疫反应，发现20个能针对idh1r132h突变抗原多肽特异免疫反应的母克隆。针对上述20个母克隆的上清，进一步在携带idh1r132h突变及不携带idh1r132h突变的胶质瘤样本石蜡切片中检测，最终选取了5株开展亚克隆培养。亚克隆培养上清再次在携带idh1r132h突变及不携带idh1r132h突变的胶质瘤样本石蜡切片中验证，最终得到能稳定分泌idh1r132h单克隆抗体且能在胶质瘤样本石蜡切片中高度灵敏和特异检测idh1r132h突变的单克隆杂交瘤细胞株10g5-1，并将杂交瘤细胞株10g5-1分泌的idh1r132h单克隆抗体记作10g5-1单克隆抗体。

杂交瘤细胞株10g5-1的分类命名为杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株已于2018年5月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为cgmccno.15783。

上述elisa测定抗体效价的方法如下：

1、抗原包被：分别将突变型及野生型idh1抗原多肽用包被缓冲液稀释，按1

μg/ml，100μl每孔加入384孔板中包被，4℃放置过夜；

2、洗涤：次日倾去孔内的液体，洗涤液洗3次；

3、封闭：每孔加入100μl封闭液，室温放置0.5h；

4、洗涤：用洗涤液洗3次；

5、加待测样品(一抗)：将含单克隆抗体的血清在另一块板上用pbs连续稀释(按照1：2梯度从1：1000连续稀释至1：512000)，按100μl每孔的量加到已包被的板上，每个样品平行做两份，免疫前小鼠血清作为阴性对照。加盖37℃恒温箱温育1-2h。

6、洗涤：用洗涤液洗3次；

7、加酶标二抗(peroxidase-conjugatedaffinipuregoatanti-rabbitigg，fcγfragmentspecific)，用封闭液按l：1000比例稀释，每孔加入100μl，加盖37℃恒温箱温育1h；

8、洗涤：用洗涤液洗5次，蒸馏水洗2次；

9、显色：加新鲜配制的底物溶液，100μl/孔，室温暗处放置5～30min至显示蓝色；

10、终止反应、比色：每孔加50μl终止液。颜色变黄；用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值。

四、10g5-1单克隆抗体的制备及纯化

将步骤三获得的杂交瘤细胞株10g5-1于含10％(体积分数)fbs的dmem培养基中扩增后采取转瓶培养，培养14天后，弃沉淀，取上清液；将上清液离心，去除细胞碎片，浓缩，并采用标准化蛋白a纯化流程，获得18mg、纯度为90％的10g5-1单克隆抗体溶液。

五、10g5-1单克隆抗体的序列

对10g5-1单克隆抗体进行测序。具体步骤如下：从杂交瘤细胞株10g5-1中分离总rna，并将其逆转录为cdna；以cdna为模板进行pcr扩增，得到抗体的vh和vl序列。然后将扩增的序列重组到质粒中，并转入大肠杆菌。再使用菌落pcr来筛选具有正确插入片段长度的细菌克隆。从中选取五个具有正确插入片段长度的克隆提取dna进行测序。将来自不同克隆的序列相互比对，这些克隆中都一致的序列即为抗体所对应的核苷酸序列，再根据核苷酸序列确定其编码的相应蛋白质的氨基酸序列。

测序结果表明：10g5-1单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.2所示，其中，框架区fr1的氨基酸序列为seqidno.2第20-49位、互补决定区cdrh1为seqidno.2第50-54位、框架区fr2的氨基酸序列为seqidno.2第55-68位、互补决定区cdrh2为seqidno.2第69-85位、框架区fr3的氨基酸序列为seqidno.2第86-117位、互补决定区cdrh3为seqidno.2第118-122位、框架区fr4的氨基酸序列为seqidno.2第123-133位。10g5-1单克隆抗体的重链可变区的编码基因序列如seqidno.1所示。

10g5-1单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.4所示，其中，框架区fr1的氨基酸序列为seqidno.4第20-42位、互补决定区cdrl1为seqidno.4第43-58位、框架区fr2的氨基酸序列为seqidno.4第59-73位、互补决定区cdrl2为seqidno.4第74-80位、框架区fr3的氨基酸序列为seqidno.4第81-112位、互补决定区cdrl3为seqidno.4第113-121位、框架区fr4的氨基酸序列为seqidno.4第122-131位。10g5-1单克隆抗体的重链可变区的编码基因序列如seqidno.3所示。

实施例2、抗idh1r132h单克隆抗体的亲和力检测

使用biacore8k平台测定并比较本发明的杂交瘤细胞株10g5-1所产生的抗idh1r132h单克隆抗体及目前通用的h09克隆所产生的抗idh1r132h单克隆抗体与idh1r132h突变抗原多肽的亲和力。具体步骤如下：

1、将idh1r132h突变抗原多肽在25℃条件下固定于基质之上，工作缓冲液为hbs-ep缓冲液。固定过程如下：首先，将cm-5传感芯片的flowcells使用50mmol/lnhs(n-羟基琥珀酰亚胺)和200mmol/ledc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)活化100s，流速为10μl/min。随后，使用乙酸钠(ph5.0)将浓度为1μg/ml的抗原多肽稀释至10mmol/l。并注入第二个flowcell，使其达到5单位响应值的水平，而第二个flowcell保持空白。当氨基偶联完成后，剩余的偶联位点使用1mol/l的乙醇胺盐酸盐溶液封闭200s。

2、将待检测的抗体分别按如下梯度稀释：10g5-1：0nm、1.25nm、2.5nm、5nm、10nm、20nm、40nm；ha09：0nm、6.25nm、12.5nm、25nm、50nm、100nm、200nm，然后分别按照30μl/min的速度流过flowcell进行检测。当一种抗体检测完毕后，使用ph1.5的甘氨酸-盐酸溶液快速洗脱已固定多肽，使flowcell再生。

3、使用biacore8kevaluation软件评估计算实验结果。

结果如表1所示。结果表明：本发明的杂交瘤细胞株10g5-1所产生的抗idh1r132h单克隆抗体对idh1r132h突变抗原多肽(u6184cb080-d)的亲和力要比目前通用的h09克隆所产生的抗idh1r132h单克隆抗体高，其亲和力平衡常数要比h09低近10倍。

表1、亲和力检测结果比较

实施例3、抗idh1r132h单克隆抗体的应用及其灵敏性和特异性验证

以经焦磷酸测序验证的五例携带idh1r132h突变的胶质瘤组织样本和五例不携带idh1r132h突变的胶质瘤组织样本(由北京神经外科研究所提供)作为待测样本进行免疫组化实验，检测本发明的杂交瘤细胞株10g5-1所产生的抗idh1r132h单克隆抗体的灵敏度和特异性。具体步骤如下：1、烤片：胶质瘤石蜡切片至于60℃烤片过夜；2、脱蜡水化：依次用二甲苯i(10min)，二甲苯ii(10min)，无水乙醇i(5min)，无水乙醇ii(5min)，95％乙醇i(5min)，95％乙醇ii(5min)，75乙醇i(5min)，75％乙醇ii(5min)浸泡切片，最后蒸馏水冲洗1分钟，1×pbs冲洗5分钟；3、抗原修复：将切片完全浸入装有edta抗原修复液的烧杯中(ph＝8.0)，用高压锅盛水烧开，然后将上述烧杯放入高压锅，关紧盖子。加热至阀门开始旋转时再计时三分钟，停止加热，自然冷却至室温，pbs缓冲液冲洗切片3分钟×3次；4、阻断内源性过氧化物酶：滴加适量3％过氧化氢室温孵育10分钟，pbs缓冲液冲洗切片3分钟×3次；5、一抗孵育：滴加100微升一抗，放入湿盒，4℃过夜，pbs缓冲液冲洗切片3分钟×3次；6、封闭：滴加100微升山羊血清，室温封闭30min，pbs缓冲液冲洗切片3分钟×3次；7、二抗孵育：滴加适量反应增强液，室温孵育30分钟；pbs缓冲液冲洗3分钟×3次，随后滴加增强酶标山羊抗鼠igg聚合物，室温孵育30分钟，pbs缓冲液冲洗切片3分钟×3次；8、显色：滴加新鲜配置的dab显色液显色2分钟，使用蒸馏水中断反应；9、复染：使用苏木素染色液漂染8秒，迅速用蒸馏水中断染色；10、脱水，透明，随后使用中性树胶封片，待干燥后显微镜下观察染色结果。

结果如图2和图3所示，图2为五例idh1r132焦磷酸测序突变样本进行免疫组化染色的结果，图3为五例idh1r132焦磷酸测序野生型样本进行免疫组化染色的结果。结果表明：10g5-1单克隆抗体在五例idh1r132h突变的胶质瘤样本石蜡切片中均显示阳性结果，而在五例不携带idh1r132h突变的胶质瘤样本石蜡切片中均显示阴性结果。表明本发明的抗体具有较高的灵敏性与特异性。

序列表

<110>北京金岱生物科技有限公司

<120>抗idh1r132h单克隆抗体及其应用

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>399

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

atgggatggagctgtatcatcctctttttggtagcagcagctacaggtgtccactcccag60

gtccaactgcagcagcctgggactgagctggtgaagcctggggcttcagtgcacctgtcc120

tgcaaggcttctgggtacaccttcaccacctactggatgcactgggtgaaacagaggcct180

ggacaaggccttgagtggattggagatattaatcctagcaatggtgagacttactacaat240

gagaagttcaggaacaaggccacactgactgtggacaaatcctccagaacagcctacatg300

cacctcagcagcctgtcatctgaggactctgcggtctattattgtgcaaggggctttaaa360

gactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctca399

<210>2

<211>133

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

metglytrpsercysileileleupheleuvalalaalaalathrgly

151015

valhisserglnvalglnleuglnglnproglythrgluleuvallys

202530

proglyalaservalhisleusercyslysalaserglytyrthrphe

354045

thrthrtyrtrpmethistrpvallysglnargproglyglnglyleu

505560

glutrpileglyaspileasnproserasnglygluthrtyrtyrasn

65707580

glulyspheargasnlysalathrleuthrvalasplysserserarg

859095

thralatyrmethisleuserserleusersergluaspseralaval

100105110

tyrtyrcysalaargglyphelysasptyrtrpglyglnglythrthr

115120125

leuthrvalserser

130

<210>3

<211>393

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atgaagttgcctgttaggctgttggtgctgatgttctggattcctgttgccagcagtgat60

gttttgatgacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctccatc120

tcttgcagatctagtcagaccattttatatagtgatggagtcacctatttggaatggtac180

ctgcagaaaccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccagccgattttct240

ggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatcagc300

agagtggtggctgaggatctgggaatttattactgctttcaaggttcacatgttccattc360

acattcggctcggggacaaagttggaaataaaa393

<210>4

<211>131

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

metlysleuprovalargleuleuvalleumetphetrpileproval

151015

alaserseraspvalleumetthrglnthrproleuserleuproval

202530

serleuglyaspglnalaserilesercysargserserglnthrile

354045

leutyrseraspglyvalthrtyrleuglutrptyrleuglnlyspro

505560

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