本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种山核桃miR159a的前体基因及其在提前植 物开花中的应用。
背景技术：
miRNA是內源的、非编码RNA,长度约为20-24nt。近年来，人们发现miRNA与其靶基 因所组成的调控机制广泛存在于植物发育和胁迫应答的调控网络中。在这个过程中，miRNA 作为关键因子，降解靶基因或抑制靶基因表达，参与植物生长发育。基因组复制事件会产生 重复的miRNA簇，在开花植物中miRNA的前体具有编码多个miRNA成熟体的潜力，无论 是相同的还是不同的。
miR159家族主要在GA信号途径中起着重要作用，miR159是已经被证实的8个高度保 守的miRNA之一。最近有研究表明，miR159在拟南芥从营养生长到生殖生长转折时期发挥 着重要作用。过表达miR159非诱导条件下可促进开花。然而，山核桃miR159a的功能作用 尚未知晓。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种山核桃miR159a的前体基因，该前体基因经过Dicer剪切后形 成山核桃miR159a，山核桃miR159a能够沉默相关靶基因从而提前植物开花。
本发明提供了一种山核桃miR159a的前体基因，所述前体基因的序列如下:
(a)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，或
(b)与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、 至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有 98％或至少具有99％同源性且经剪切后生成山核桃miR159a的核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述miR159a的序列为SEQ ID NO：2。
本发明提供了上述前体基因的重组载体、转基因细胞系或重组菌。
在一个实施方案中，所述重组菌为将上述前体基因插入表达载体得到的重组菌。
另一方面，本发明提供了上述前体基因在提前植物开花中的应用。
在一个实施方案中，所述植物为拟南芥或烟草。
在一个实施方案中，所述植物是拟南芥。
在一个实施方案中，由于山核桃miR159a本身序列很短，只有21个bp，而前体序列相对 较长，通过将其前体序列连接到载体上，有利于转化实现，因此上述应用包括：将包含所述 山核桃miR159a的前体基因连接到载体上，通过农杆菌介导转化到拟南芥、筛选、培养和获 得转基因株系。
本发明提供了山核桃miR159a前体在提前植物开花中的应用。应用山核桃miR159a前体 序列，有望人为地提前植物开花。具体地，应用山核桃miR159a，有望调控山核桃的花期， 使得山核桃童期缩短，提前开花和结实。
附图说明
图1为山核桃雄花芽和雌花芽的总RNA；
图2为山核桃miR159a前体的表达载体菌液PCR检测；
图3为山核桃miR159a转基因拟南芥植株的抗性筛选；
图4为山核桃miR159a转基因拟南芥的PCR检测；
图5为观察到的野生型(WT)和山核桃miR159a转基因拟南芥的表型。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本 发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
1.材料
1.1实验材料
实验材料取自浙江省临安浙江农林大学山核桃基地(39N,119W)15年生的无性繁殖的 山核桃雄花芽和雌花芽，样品采下后立即液氮保存，带回实验室并放置在-80℃冰箱保存待用。 拟南芥野生型种子使用哥伦比亚生态型(Columbia-0)。
1.2实验试剂与仪器
DNA聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、Marker和TRIzol试剂均购自宝生物工程(大 连)有限公司；质粒提取试剂盒及DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司。 PCR仪为美国PE9700PCR仪，超净工作台购自苏州诚净净化科技有限公司。
1.3引物合成及测序
引物合成及测序均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
2.方法
2.1山核桃花芽总RNA的提取
采用改良CTAB+Trizol法提取花芽样品总RNA，步骤如下：
(1)在10mL离心管中加入3mL 65℃预热的CTAB提取缓冲液(10％CTAB，10％PVP40， 1.0M Tris-HCl(pH 8.0)，5M NaCl，0.6M EDTA(pH 8.0))，加入200μLβ-巯基乙醇；
(2)取-70℃保存的花芽2g，放入液氮充分预冷的研钵中，于液氮中充分研磨至百色粉末；
(3)将白色粉末迅速转入预热的提取液中，立即充分振荡混匀，65℃水浴30min，期间振荡 3-4次；
(4)在混合物中加入等体积的25:24:1(酸性饱和酚：氯仿：异戊醇)，约3ml。混合均匀后 14000rpm离心10min(常温)；
(5)取上清转入新的10ml离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)上下颠倒混匀， 12000rpm4℃离心10min后取上清；
(6)重复步骤4一次，直至中间层消失；
(7)上清转移至1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇后放置于-20℃冰箱冷冻30min。 12000rpm4℃离心10min弃掉上清，沉淀加入65℃预热好的SSTE400μL溶液至全溶；
(8)溶液中加入1mLTRIzol试剂，室温静置5min。再加入200μL氯仿摇匀，室温静置2-3min；
(9)4℃12000rpm离心15min；
(10)吸取上清，加入等体积异丙醇，室温静置10min；
(11)4℃12000rpm离心10min，弃掉上清，肉眼可见RNA沉于管底；
(12)加入1mL预冷的75％乙醇洗涤沉淀，温和振荡，8000rpm4℃离心5min，弃掉上清；
(13)重复步骤11，并将沉淀真空干燥7-10min；加入适量DEPC水溶解沉淀，-80℃保存备 用。
2.2cDNA合成
使用TAKARA试剂盒Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit，详细内容如下：
(1)在经过DEPC处理过的PCR管中配置下列反应体系:
(2)65℃保温5min，冰上迅速冷却(模板RNA变性)。
(3)再次配置反应体系如下：
(4)缓慢摇匀。
(5)42℃反应30-60min。
(6)95℃5min酶失活后，冰上冷却。
2.3前体序列的引物设计
依据山核桃miR159a的前体序列：
TGGGTGGATCGAGCTGCCGAGTTATGGATTCCACAGCCCTATCCCTTTCATTTGAGG CTATTTTGATAGGCTTGCGGGTTGCATAACTCGGGAGCTTCGTTACCTGAAGTCAGATCC TTGTTTGGATTGAAGGGAGCTCTACACCTGTTCTACTCTTTCCATGATCTATCAACTTAAG TTGATTGATTTACCTTTTATATGTTCTTATGTTTTATAAATTGTTACTGATTATTAACCTAGC ATTGATCGACTGTAAATATC，使用Primer Primer 5.0设计引物，引物两端分别加上酶切位点 KpnI和XbaI，
表1构建miR159a前体的反义表达载体的特异性引物
注：加黑部分为酶切位点
2.4PCR扩增反应
以山核桃cDNA为模板扩增，反应体系如下：
PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min。30 个循环后，72℃延伸10min。PCR反应完成后4℃暂时保存，其中退火温度可根据Tm值进行 调整。
2.5琼脂糖凝胶电泳检测与胶回收
将PCR反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为TAE(40mM Tris-乙酸盐，1mM EDTA)，核酸燃料为EB。紫外光检测电泳结果并回收PCR产物。利用上海生工公司的DNA 胶回收试剂盒进行胶回收，具体步骤如下：
(1)通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其他片段分开，用干净的手术刀片将含 有目的DNA的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5mL离心管中。每个胶块尽量不要超过400mg， 否则将会导致溶胶不完全。另外切胶过程应尽可能快，从而减少DNA在紫外线中暴露时间 来降低对DNA的损伤；
(2)根据胶块的质量和浓度，每100mg琼脂糖加300～600μL的比例加入Buffer B2；
(3)置于55℃金属浴10min，期间混匀2～3次直至胶块完全溶化为止；
(4)当目的片段＜500bp时，可加入1/3体积的Buffer B2的异丙醇，混匀。若≥500bp，则 此步骤可以省略；
(5)将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8,000xg离心30sec。倒掉收集管中的液体，并将吸 附柱放入同一个收集管中；
(6)加入500μL Wash Solution，9000xg离心30sec。再次倒掉收集管中的液体；
(7)重复一次步骤6；
(8)将带有收集管的吸附柱放入离心机，9000xg空离1min。扔掉收集管，并将吸附柱置于 灭过菌的1.5mL EP管中；
(9)打开吸附柱的盖子，室温放置10min。为了去除残留的酒精，否则会严重影响回收得率 和后续实验结果；
(10)在吸附膜中央加入15-30μL ddH2O。室温静置5min，9000xg离心1min。1.5mL EP管 底部收集的DNA溶液即为回收的DNA，-20℃保存。
2.6DNA回收片段与PMD-19T载体连接
根据PMD19-T载体使用说明书，在灭过菌的PCR反应管中将Vector与回收DNA片段 进行T-A克隆连接，反应体系如下：
轻轻混匀后16℃过夜连接10h以上，转化DH5α感受态。
2.7连接产物转化DH5α感受态
转化感受态具体操作步骤如下：取出适量DH5α感受态细胞并至于冰上冻融。在超净工 作台内向冰冷的感受态细胞中加入上述连接混合液，并用移液器吸头轻轻吸打混匀。置于冰 上20min。快速平稳放入42℃水浴中60s(热激，使细胞膜开放，重组质粒进入细胞)，并迅速 放入冰水混合物中，保持2min(使细胞膜关闭)。加入500μL无抗LB液体培养基，37℃恒温 振荡培养1h。室温下4000rpm离心5min，弃掉上清(保留少许培养基，约50μL)。超净台内， 用枪头轻轻吸打并重悬菌液，涂于氨苄抗性平板。倒置琼脂平板于37℃，平板通常在37℃温 育14h。
2.8重组子的筛选和鉴定
用10μL小号枪头挑取平板上至少5个单菌落(每个菌落均做好标记)，并置于含有800μL LB培养基(含相应抗生素)的1.5mL EP管中，37℃振荡培养4h左右至培养基浑浊，并对培养 基浑浊的菌样进行菌检验证，菌检验证载体构建成功的菌液取1mL送上海生工测序。利用 BLAST、CLUSTAL、MEGA4.0等软件对序列进行分析。
2.9表达载体的构建
将测序获得完全正确的序列，提取质粒后用KpnⅠ和XbaⅠ双酶切中间载体和表达载体 pCAMBIA13011(pC13011)，再用T4连接酶连接经过双酶切的pC13011载体和miR159a前 体片段，然后转化到大肠杆菌中提取质粒酶切验证。
2.10转化农杆菌
2.10.1电击杯的处理
(1)用移液枪吸取ddH2O反复冲洗电击杯3-5次；
(2)用75％的乙醇反复冲洗电击杯3-5次；
(3)将电击杯浸泡在无水乙醇中2h，然后倒掉乙醇，置于超净工作台中让残余酒精挥发；
(4)酒精挥发完全后，盖好电击杯盖子，室温保存备用。
2.10.2电转化
采用仪器为伯乐公司GenePμLser Xcell电穿孔仪进行感受态细胞的转化。主要参数为：电脉 冲2.5μF、电压2.5kV、电阻200Ω。操作步骤如下：
(1)取出保藏的农杆菌GV3101感受态细胞放置冰上融化；
(2)取1μL质粒加入到解冻的感受态细胞中，轻轻混匀；
(3)将混合液加到电击杯中(-20℃预冷)，在电脉冲为2.5μF、电压2.5kV、电阻200Ω的 参数条件下电击；
(4)取出电击杯，迅速加入800μL预热的无抗的YEP液体培养基，悬浮细胞后，转移到1.5mL 的离心管中；
(5)28℃，220rpm震荡培养2h左右；
(6)取30-40μL菌液，用无菌的涂布棒将菌液均匀的涂在含有相应抗生素YEP平板上，倒置 放入28℃培养箱培养2-3天。
2.10.3电转化农杆菌及其检测
将酶切验证正确的pC13011-miRNA159a质粒转化到农杆菌GV3101中，再从农杆菌中提 取质粒后，转化到大肠杆菌中提质粒，酶切验证。验证正确的含有pC1301-miRNA159a质粒 的农杆菌，-80℃保存菌种。
2.11拟南芥遗传转化及其转基因植株纯合子的筛选
2.11.1拟南芥的种植
(1)将野生型拟南芥种子均匀撒在1/2MS固体培养基中；
(2)4℃冰箱避光春化处理2天；
(3)4天后，移至培养室培养，条件为温度23℃，光强7000-9000Lx，光照16小时，黑 暗8小时；
(4)待拟南芥长出2片子叶和2片真叶后，将其移植到含基质的盆中，继续培养。
2.11.2拟南芥的遗传转化
(1)农杆菌菌液的准备：配制含有卡那霉素和利福平的YEP固体培养基，倒平板，划线 以活化保存的农杆菌，28℃倒置培养2天。挑单菌落至1mL含相应抗生素的YEP液体培养 基中，28℃培养2天，再转移至100mL相同的培养基中扩大培养，直至培养液浑浊变为橙 色，测其OD值达到1.2时停止培养；
(2)4000rpm，离心10min，倒掉上清液，用浸染介质悬浮菌体；
(3)浸花法转化拟南芥
a.选取开花初期的拟南芥，将花序浸入含有目的基因农杆菌的转化介质中，约10-20秒；
b.将浸染过的拟南芥植株平放于一个大容器中，避光培养24小时；
c.第二天，放置正常条件下继续培养；
d.收获拟南芥种子，干燥；
2.11.3拟南芥转基因种子的筛选及种植
(1)将转基因种子均匀撒在1/2MS的固体培养基中(培养基中潮霉素的浓度为50mg/L)。 同时将野生型拟南芥种子撒在不含潮霉素培养基中，作为对照；
(2)4℃避光春化处理2天；
(3)4天后将撒有野生型拟南芥种子的培养皿打开，置于培养室中正常培养，而含有转基 因种子的培养皿则避光培养；
(4)48小时后，将含有转基因种子的培养皿置于光下正常培养。转基因成功的植株就会 生长，反之不生长；
(5)待拟南芥长出2-4片真叶后，移植到含有泥炭的盆中，继续培养；
(6)观察对照拟南芥(野生型拟南芥)和转山核桃miR159a的拟南芥的生长情况。
3.实验结果
3.1山核桃花芽的总RNA提取分析
利用改良CTAB+TRizol法提取山核桃花芽及拟南芥叶片总RNA(见图1)，并通过紫外 分光光度计测定每个RNA样品260nm及280nm的吸光度，并以此计算RNA的浓度及纯度， 并在1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。所提RNA的光密度比值均在2.0-2.2之间，说 明总RNA基本无糖类、酚及蛋白质的污染；电泳结果则显示RNA样品的18s和28s两条带 非常清晰，可推断RNA没有降解，符合下步实验的要求。
3.2山核桃miR159a前体序列的克隆
根据所设计的引物序列，使用PCR扩增，产物经连接到pMD19-T(simple)，菌检PCR 进行检测(图2)，并送到上海生工测序，验证了山核桃miRNA159a前体的存在。
3.3山核桃miR159a的功能验证
将所获得前体序列，进行表达载体的构建，将miR159a前体序列连接到pC13011表达载 体上，构建miR159a反义表达载体，转化到DH5α感受态细胞中，将连接成功的单克隆提取 质粒，转化到土壤农杆菌GV3101中，进行拟南芥转基因。对山核桃miR159a反义转基因拟 南芥植株进行抗性筛选(如图3)，筛选到纯合后，将筛选出的转基因拟南芥体取DNA，进 行PCR检测(如图4，PCR扩增获得筛选山核桃miRNA159a前体基因)对其表型进行观察发 现:反义表达载体的转基因拟南芥较野生型抽薹开花早10天左右(图5)。
以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明 的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 浙江农林大学
<120> 山核桃miR159a 的前体基因及其在提前植物开花中的应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 95
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgggtggatc gagctgccga gttatggatt ccacagccct atccctttca tttgaggcta 60
ttttgatagg cttgcgggtt gcataactcg ggagcttcgt tacctgaagt cagatccttg 120
tttggattga agggagctct acacctgttc tactctttcc atgatctatc aacttaagtt 180
gattgattta ccttttatat gttcttatgt tttataaatt gttactgatt attaacctag 240
cattgatcga ctgtaaatat c 261
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tttggattga agggagctct a 21