本发明属于生物技术和治疗领域,具体涉及靶向KRAS的siRNA及其在制备胰腺癌治疗药物中的应用。
背景技术:
胰腺癌是发生率居全球前列、恶性程度很高且死亡率第一的恶性肿瘤,其5年生存率低于1%。胰腺癌的发生通常与吸烟、酒精、高脂肪饮食及环境污染等因素相关。目前胰腺癌早期确诊率不高,主要以手术治疗为主,结合放化疗等方式。手术死亡率高,治愈率很低,并无其他有效治疗方案。
KRAS基因是一种肿瘤驱动基因,其过表达及突变通常会不同程度引起肿瘤等相关疾病。在胰腺癌发生发展过程中,KRAS基因起着非常重要的作用。多数胰腺癌患者携带KRAS基因突变,而以G12D突变占绝大多数,约为70-85%以上。目前并没有针对KRAS靶向治疗的药物,因此,开发针对KRAS基因靶点的药物尤为迫切。
siRNA是一类小RNA序列,通常是20-25nt的双链RNA。siRNA可以通过结合靶基因的编码区(CDS),引起mRNA水平的降解,导致蛋白翻译受阻。大量的研究表明,siRNA可以作用于多种靶基因,从而治疗该基因引起的各类疾病。
技术实现要素:
本发明的目的是提供一种靶向KRAS的siRNA及其在制备胰腺癌治疗药物中的应用。
本发明要求保护一种核酸分子,为GP-1、GP-2、GP-8、GP-6、GP-4或GP-10;
GP-1由单链核酸分子GP-1A和单链核酸分子GP-1B形成;单链核酸分子GP-1A如序列表的序列1所示;单链核酸分子GP-1B如序列表的序列2所示;
GP-2由单链核酸分子GP-2A和单链核酸分子GP-2B形成;单链核酸分子GP-2A如序列表的序列1所示,且5’末端的第1至3位核苷酸和3’末端的第1至3位核苷酸均为2'氟代核糖核苷酸;单链核酸分子GP-2B如序列表的序列2所示;
GP-8由单链核酸分子GP-8A和单链核酸分子GP-8B形成;单链核酸分子GP-8A如序列表的序列1所示,且5’末端的第1至3位核苷酸和3’末端的第1至3位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸,且5’末端的连续3个磷酸酯键和3’末端的连续3个磷酸酯键均为硫代磷酸酯键;单链核酸分子GP-8B如序列表的序列2所示;
GP-6由单链核酸分子GP-6A和单链核酸分子GP-6B形成;单链核酸分子GP-6A如序列表的序列1所示,且5’末端的第1至3位核苷酸和3’末端的第1至3位核苷酸均为2'氟代核糖核苷酸,且5’末端的连续3个磷酸酯键和3’末端的连续3个磷酸酯键均为硫代磷酸酯键;单链核酸分子GP-6B如序列表的序列2所示;
GP-4由单链核酸分子GP-4A和单链核酸分子GP-4B形成;单链核酸分子GP-4A如序列表的序列1所示,且5’末端的第1至3位核苷酸和3’末端的第1至3位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸;单链核酸分子GP-4B如序列表的序列2所示;
GP-10由单链核酸分子GP-10A和单链核酸分子GP-10B形成;单链核酸分子GP-10A如序列表的序列1所示,且所有的C和U均为锁核酸;单链核酸分子GP-10B如序列表的序列2所示。
本发明还保护述核酸分子在制备产品中的应用;所述产品的功能为如下(a)、(b)或(c)或(d):
(a)抑制癌细胞增殖;
(b)抑制癌细胞迁移;
(c)治疗癌症;
(d)抑制KRAS基因表达。
所述癌细胞为胰腺癌细胞。所述癌细胞为人胰腺癌细胞。所述癌症为胰腺癌。
本发明还保护一种产品,含有所述核酸分子;所述产品的功能为如下((a)、(b)或(c)或(d):
(a)抑制癌细胞增殖;
(b)抑制癌细胞迁移;
(c)治疗癌症;
(d)抑制KRAS基因表达。
所述癌细胞为胰腺癌细胞。所述癌细胞为人胰腺癌细胞。所述癌症为胰腺癌。
本发明还保护所述核酸分子的应用,为如下(a)、(b)或(c)或(d):
(a)抑制癌细胞增殖;
(b)抑制癌细胞迁移;
(c)治疗癌症;
(d)抑制KRAS基因表达。
所述癌细胞为胰腺癌细胞。所述癌细胞为人胰腺癌细胞。所述癌症为胰腺癌。
本发明还保护一种核酸分子,为GP-7、GP-3、GP-5、GP-9或GP-11;
GP-7由单链核酸分子GP-7A和单链核酸分子GP-7B形成;单链核酸分子GP-7A如序列表的序列3所示,且5’末端的第1至3位核苷酸和3’末端的第1至3位核苷酸均为2'氟代核糖核苷酸,且5’末端的连续3个磷酸酯键和3’末端的连续3个磷酸酯键均为硫代磷酸酯键;单链核酸分子GP-7B如序列表的序列4所示;
GP-3由单链核酸分子GP-3A和单链核酸分子GP-3B形成;单链核酸分子GP-3A如序列表的序列3所示,且5’末端的第1至3位核苷酸和3’末端的第1至3位核苷酸均为2'氟代核糖核苷酸;单链核酸分子GP-3B如序列表的序列4所示;
GP-5由单链核酸分子GP-5A和单链核酸分子GP-5B形成;单链核酸分子GP-5A如序列表的序列3所示,且5’末端的第1至3位核苷酸和3’末端的第1至3位核苷酸为2'-O-甲基核糖核苷酸;单链核酸分子GP-5B如序列表的序列4所示;
GP-9由单链核酸分子GP-9A和单链核酸分子GP-9B形成;单链核酸分子GP-9A如序列表的序列3所示,且5’末端的第1至3位核苷酸和3’末端的第1至3位核苷酸均为2'-O-甲基核糖核苷酸,且5’末端的连续3个磷酸酯键和3’末端的连续3个磷酸酯键均为硫代磷酸酯键;单链核酸分子GP-9B如序列表的序列4所示;
GP-11由单链核酸分子GP-11A和单链核酸分子GP-11B形成;单链核酸分子GP-11A如序列表的序列3所示,且所有的C和U均为锁核酸;单链核酸分子GP-11B如序列表的序列4所示。
本发明还保护述核酸分子在制备产品中的应用;所述产品的功能为如下(a)、(b)或(c)或(d):
(a)抑制癌细胞增殖;
(b)抑制癌细胞迁移;
(c)治疗癌症;
(d)抑制KRAS基因表达。
所述癌细胞为胰腺癌细胞。所述癌细胞为人胰腺癌细胞。所述癌症为胰腺癌。
本发明还保护一种产品,含有所述核酸分子;所述产品的功能为如下((a)、(b)或(c)或(d):
(a)抑制癌细胞增殖;
(b)抑制癌细胞迁移;
(c)治疗癌症;
(d)抑制KRAS基因表达。
所述癌细胞为胰腺癌细胞。所述癌细胞为人胰腺癌细胞。所述癌症为胰腺癌。
本发明还保护所述核酸分子的应用,为如下(a)、(b)或(c)或(d):
(a)抑制癌细胞增殖;
(b)抑制癌细胞迁移;
(c)治疗癌症;
(d)抑制KRAS基因表达。
所述癌细胞为胰腺癌细胞。所述癌细胞为人胰腺癌细胞。所述癌症为胰腺癌。
本发明提供了靶向KRAS基因的非化学修饰及化学修饰核酸分子,对胰腺癌具有较好的治疗效果,为临床治疗胰腺癌奠定了基础,具有重大的应用推广价值。
附图说明
图1为实施例1的结果。
图2为实施例2中GP-6的结果。
图3为实施例2中GP-7的结果。
图4为实施例2中GP-8的结果。
图5为实施例2中GP-9的结果。
图6为实施例3的结果。
图7为实施例4的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。如无特殊说明,各个核苷酸均为未进行修饰的常规核苷酸,各个核苷酸间均为常规磷酸酯键。如无特殊说明,实施例中的PBS缓冲液均为pH7.4的PBS缓冲液。Trypsin-EDTA溶液(Trypsin-EDTA Solution),0.05%Trypsin-EDTA,Gibco。转染试剂lipo2000,全称为Lipofectamin2000转染试剂(Invitrogen)。
siRNA为NC、PC、GP-1、GP-2、GP-3、GP-4、GP-5、GP-6、GP-7、GP-8、GP-9、GP-10或GP-11。
NC由单链核酸分子NC-A和单链核酸分子NC-B形成。
NC-A:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’;
NC-B:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。
PC由单链核酸分子PC-A和单链核酸分子PC-B形成。
PC-A(序列表的序列3):5’-GUUGGAGCUGAUGGCGUAGTT-3’;
PC-B(序列表的序列4):5’-CUACGCCAUCAGCUCCAACTT-3’。
GP-1由单链核酸分子GP-1A和单链核酸分子GP-1B形成。
GP-1A(序列表的序列1):5’-GGAGCUGAUGGCGUAGGCATT-3’;
GP-1B(序列表的序列2):5’-UGCCUACGCCAUCAGCUCCTT-3’。
GP-2由单链核酸分子GP-2A和单链核酸分子GP-2B形成。下划线标注的6个核苷酸(即正义链的5’末端的第1至3位核苷酸和3’末端的第1至3位核苷酸)均为2'氟代核糖核苷酸。
GP-2A:5’-GGAGCUGAUGGCGUAGGCATT-3’;
GP-2B:5’-UGCCUACGCCAUCAGCUCCTT-3’。
GP-3由单链核酸分子GP-3A和单链核酸分子GP-3B形成。下划线标注的6个核苷酸(即正义链的5’末端的第1至3位核苷酸和3’末端的第1至3位核苷酸)均为2'氟代核糖核苷酸。
GP-3A:5’-GUUGGAGCUGAUGGCGUAGTT-3’;
GP-3B:5’-CUACGCCAUCAGCUCCAACTT-3’。
GP-4由单链核酸分子GP-4A和单链核酸分子GP-4B形成。下划线标注的6个核苷酸(即正义链的5’末端的第1至3位核苷酸和3’末端的第1至3位核苷酸)均为2'-O-甲基核糖核苷酸。
GP-4A:5’-GGAGCUGAUGGCGUAGGCATT-3’;
GP-4B:5’-UGCCUACGCCAUCAGCUCCTT-3’。
GP-5由单链核酸分子GP-5A和单链核酸分子GP-5B形成。下划线标注的6个核苷酸(即正义链的5’末端的第1至3位核苷酸和3’末端的第1至3位核苷酸)为2'-O-甲基核糖核苷酸。
GP-5A:5’-GUUGGAGCUGAUGGCGUAGTT-3’;
GP-5B:5’-CUACGCCAUCAGCUCCAACTT-3’。
GP-6由单链核酸分子GP-6A和单链核酸分子GP-6B形成。下划线标注的6个核苷酸(即正义链的5’末端的第1至3位核苷酸和3’末端的第1至3位核苷酸)均为2'氟代核糖核苷酸。正义链5’末端的连续3个磷酸酯键和3’末端的连续3个磷酸酯键均为硫代磷酸酯键。
GP-6A:5’-GGAGCUGAUGGCGUAGGCATT-3’;
GP-6B:5’-UGCCUACGCCAUCAGCUCCTT-3’。
GP-7由单链核酸分子GP-7A和单链核酸分子GP-7B形成。下划线标注的6个核苷酸(即正义链的5’末端的第1至3位核苷酸和3’末端的第1至3位核苷酸)均为2'氟代核糖核苷酸。正义链5’末端的连续3个磷酸酯键和3’末端的连续3个磷酸酯键均为硫代磷酸酯键。
GP-7A:5’-GUUGGAGCUGAUGGCGUAGTT-3’;
GP-7B:5’-CUACGCCAUCAGCUCCAACTT-3’。
GP-8由单链核酸分子GP-8A和单链核酸分子GP-8B形成。下划线标注的6个核苷酸(即正义链的5’末端的第1至3位核苷酸和3’末端的第1至3位核苷酸)均为2'-O-甲基核糖核苷酸。正义链5’末端的连续3个磷酸酯键和3’末端的连续3个磷酸酯键均为硫代磷酸酯键。
GP-8A:5’-GGAGCUGAUGGCGUAGGCATT-3’;
GP-8B:5’-UGCCUACGCCAUCAGCUCCTT-3’。
GP-9由单链核酸分子GP-9A和单链核酸分子GP-9B形成。下划线标注的6个核苷酸(即正义链的5’末端的第1至3位核苷酸和3’末端的第1至3位核苷酸)均为2'-O-甲基核糖核苷酸。正义链5’末端的连续3个磷酸酯键和3’末端的连续3个磷酸酯键均为硫代磷酸酯键。
GP-9A:5’-GUUGGAGCUGAUGGCGUAGTT-3’;
GP-9B:5’-CUACGCCAUCAGCUCCAACTT-3’。
GP-10由单链核酸分子GP-10A和单链核酸分子GP-10B形成。下划线标注的核苷酸均为锁核酸(即正义链中所有的C和U均为锁核酸)。
GP-10A:5’-GGAGCUGAUGGCGUAGGCATT-3’;
GP-10B:5’-UGCCUACGCCAUCAGCUCCTT-3’。
GP-11由单链核酸分子GP-11A和单链核酸分子GP-11B形成。下划线标注的核苷酸均为锁核酸(即正义链中所有的C和U均为锁核酸)。
GP-11A:5’-GUUGGAGCUGAUGGCGUAGTT-3’;
GP-11B:5’-CUACGCCAUCAGCUCCAACTT-3’。
以上各个siRNA中,A代表正义链,B代表反义链。
实施例1、双荧光素酶试验
重组质粒:在psiCHECK2质粒(promega)的XhoI和NotI酶切位点之间插入序列表的序列5所示的双链DNA分子。
序列表的序列5:5’-CTTGTGGTAGTTGGAGCTGATGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGA-3’。
1、在10cm直径的细胞盘中采用DMEM培养液培养293A细胞至80-90%融合,弃除培养上清,用PBS缓冲液洗涤细胞。
2、完成步骤1后,在所述细胞盘中加入1ml Trypsin-EDTA溶液,混匀后,小心吸弃上清,37℃静置1分钟。
3、完成步骤2后,在所述细胞盘中加入2ml完全培养基,吹打使细胞,得到单细胞悬液。完全培养基:含10%胎牛血清的DMEM培养液。
4、取步骤3得到的细胞悬液,接种至24孔板(每孔1×105个细胞),37℃培养12小时。
5、将待测siRNA用DEPC-H2O溶解,得到siRNA浓度为20μM的siRNA溶液。
6、在一个1.5ml EP管中加入重组质粒、步骤5得到的siRNA溶液和DMEM培养液,混匀,得到100μl混合液甲(混合液甲中,含40ng重组质粒);在另一个EP管中加入99μl DMEM培养液和1μl转染试剂lipo2000,混匀并静置5min,得到100μl混合液乙;将上述两个混合液混匀,得到200μl混合液,室温静置20min,即为转染混合物。
7、取完成步骤4的24孔板,吸弃上清,每孔加入300μl DMEM培养液,静置20min后每孔加入200μl步骤6制备的转染混合物,每孔的500μl体系中siRNA浓度为1nM,37℃培养5小时。
8、取完成步骤7的24孔板,吸弃上清,用PBS缓冲液漂洗,然后加入DMEM培养液,37℃培养24小时。
9、采用Dual-Luciferase Reporter Assay System(promega,E1960)检测双荧光素酶。
(1)取完成步骤8的24孔板,吸弃上清,用PBS缓冲液清洗细胞。
(2)完成步骤(1)后,每孔加入125μl 1×PLB裂解缓冲液,室温轻缓晃动培养板,裂解15min。
(3)将步骤(2)得到的裂解产物转移至离心管中,3000rpm离心3min,收集上清液。
(4)取30μl步骤(3)得到的上清液,加至白色96孔板中,加入底物,在荧光显微镜下进行检测(promega)。
待测siRNA为NC、PC、GP-1、GP-2、GP-3、GP-4、GP-5、GP-6、GP-7、GP-8、GP-9、GP-10或GP-11。每种siRNA设置3个复孔。设置用等体积DEPC-H2O代替siRNA溶液的处理孔,3个复孔,命名为NC-FAM孔。
结果见图1。GP-1、GP-2、GP-6的抑制效果最佳,其次是GP-3、GP-4、GP-5、GP-7、GP-8、GP-9。
实施例2、KRAS RNA水平受siRNA影响
1、在10cm直径的细胞盘中采用DMEM培养液培养PANC-1细胞至80-90%融合,弃除培养上清,用PBS缓冲液洗涤细胞。
2、完成步骤1后,在所述细胞盘中加入1ml Trypsin-EDTA溶液,混匀后,小心吸弃上清,37℃静置1分钟。
3、完成步骤2后,在所述细胞盘中加入2ml完全培养基,吹打使细胞,得到单细胞悬液。完全培养基:含10%胎牛血清的DMEM培养液。
4、取步骤3得到的细胞悬液,接种至24孔板(每孔1×105个细胞),37℃培养12小时。
5、将待测siRNA用DEPC-H2O溶解,得到siRNA溶液。
6、在一个1.5ml EP管中加入步骤5得到的siRNA溶液和DMEM培养液,混匀,得到100μl混合液甲;在另一个EP管中加入99μl DMEM培养液和1μl转染试剂lipo2000,混匀并静置5min,得到100μl混合液乙;将上述两个混合液混匀,得到200μl混合液,室温静置20min,即为转染混合物。
7、取完成步骤4的24孔板,吸弃上清,每孔加入300μl DMEM培养液,静置20min后每孔加入200μl步骤6制备的转染混合物,每孔的500μl体系中siRNA浓度为0、0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10nM或100nM,37℃培养5小时。
8、取完成步骤7的24孔板,吸弃上清,用PBS缓冲液漂洗,然后加入DMEM培养液,37℃培养24小时。
9、取完成步骤8的24孔板,收集细胞,提取总RNA。总RNA进行反转录得到cDNA。以cDNA为模板,采用GAPDH基因为内参基因,通过实时定量PCR检测KRAS基因的相对表达量。
用于检测KRAS基因的引物对如下:
homo-Kras-F1:AACTTGTGGTAGTTGGAGCT;
homo-Kras-R1:CTCTATTGTTGGATCATATTCGTC。
用于检测GAPDH基因的引物对如下:
GAPDH-F:CATGAGAAGTATGACAACAGCCT;
GAPDH-R:AGTCCTTCCACGATACCAAAGT。
待测siRNA为GP-6、GP-7、GP-8或GP-9。每种siRNA设置3个复孔。
GP-6的结果见图2。GP-7的结果见图3。GP-8的结果见图4。GP-9的结果见图5。四种待测siRNA对于PANC-1细胞的内源KRAS基因表达均具有显著抑制作用。
实施例3、CCK8细胞增殖试验
1、取PANC-1细胞,用PBS缓冲液洗涤,然后用Trypsin-EDTA溶液37℃处理3分钟,然后用完全培养基悬浮,得到单细胞悬液。完全培养基:含10%胎牛血清的DMEM培养液。
2、取步骤1得到的细胞悬液,接种至96孔板(每孔3×103个细胞),37℃培养12小时。
3、将待测siRNA用DEPC-H2O溶解,得到siRNA溶液。
4、在一个1.5ml EP管中加入步骤3得到的siRNA溶液和DMEM培养液,混匀,得到100μl混合液甲;在另一个EP管中加入99μl DMEM培养液和1μl转染试剂lipo2000,混匀并静置5min,得到100μl混合液乙;将上述两个混合液混匀,得到200μl混合液,室温静置20min,即为转染混合物。转染混合物中siRNA浓度为1nM。
5、取完成步骤2的96孔板,吸弃上清,每孔加入100μl步骤4制备的转染混合物,37℃培养0、24、48或72小时。
6、完成步骤5后,取所述96孔板,每孔加入100μl DMEM培养液和10μl CCK8溶液,避光培养2小时,采用酶标仪检测450nm波长OD值。
待测siRNA为NC、PC、GP-1、GP-6、GP-7、GP-8或GP-9。每种siRNA设置3个复孔。设置用等体积DEPC-H2O代替siRNA溶液的处理孔,3个复孔,作为空白对照孔。
结果见图6。结果表明,siRNA能够降低PANC-1细胞的增殖。
实施例4、细胞侵袭
1、在10cm直径的细胞盘中采用DMEM培养液培养PANC-1细胞至80-90%融合,弃除培养上清,用PBS缓冲液洗涤细胞。
2、完成步骤1后,在所述细胞盘中加入1ml Trypsin-EDTA溶液,混匀后,小心吸弃上清,37℃静置1分钟。
3、完成步骤2后,在所述细胞盘中加入2ml完全培养基,吹打使细胞,得到单细胞悬液。完全培养基:含10%胎牛血清的DMEM培养液。
4、取步骤3得到的细胞悬液,接种至24孔板(每孔1×105个细胞),37℃培养12小时。
5、将待测siRNA用DEPC-H2O溶解,得到siRNA溶液。
6、在一个1.5ml EP管中加入步骤5得到的siRNA溶液和DMEM培养液,混匀,得到100μl混合液甲;在另一个EP管中加入99μl DMEM培养液和1μl转染试剂lipo2000,混匀并静置5min,得到100μl混合液乙;将上述两个混合液混匀,得到200μl混合液,室温静置20min,即为转染混合物。
7、取完成步骤4的24孔板,吸弃上清,每孔加入300μl DMEM培养液,静置20min后每孔加入200μl步骤6制备的转染混合物,每孔的500μl体系中siRNA浓度为1nM,37℃培养5小时。
8、取完成步骤7的24孔板,吸弃上清,用PBS缓冲液漂洗,然后加入DMEM培养液,37℃培养24小时。
9、取完成步骤8的24孔板,吸弃上清,加入含5%FBS的DMEM培养液静置培养24h,然后吸弃上清,用PBS缓冲液洗涤细胞。
10、取完成步骤9的24孔板,加入Trypsin-EDTA solution,混匀后,小心吸弃上清,37℃静置3-5分钟。
11、取完成步骤10的24孔板,加入含5%FBS的DMEM培养液,吹打使细胞形成单细胞悬液。
12、采用DMEM培养液,制备Matrigel浓度为10mg/L的凝胶,然后用60μl包被Transwell小室底部膜的上室面,孵育4小时,吸弃上清。
13、完成步骤12后,将步骤11得到的单细胞悬液(含3×103个细胞)接种于transwell小室上室,下室加入700μl含15%FBS的DMEM培养液,37℃静置培养48h。
14、完成步骤13后,取transwell小室,用PBS缓冲液冲洗,然后加入预冷的甲醇,-20℃固定10min,然后弃除甲醇,用PBS缓冲液冲洗,然后用棉签刮除transwell小室上表面的Matrigel胶,用PBS缓冲液冲洗上表面,然后将transwell小室倒置风干。
15、取完成步骤14的transwell小室放入一新的24孔板中,每孔加入200μl 0.1%结晶紫溶液,37℃染色30min。
16、取完成步骤15的transwell小室,用ddH2O洗涤,风干后在倒置显微镜下取若干视野,拍照计数。
待测siRNA为NC、GP-1、GP-6或GP-8。
结果见图7。结果显示,siRNA能够降低PANC-1细胞的侵袭能力。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州吉玛基因股份有限公司
上海吉玛制药技术有限公司
<120> 靶向KRAS的siRNA及其在制备胰腺癌治疗药物中的应用
<130> GNCYX181441
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
ggagcugaug gcguaggcat t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
ugccuacgcc aucagcucct t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
guuggagcug auggcguagt t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
cuacgccauc agcuccaact t 21
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
cttgtggtag ttggagctga tggcgtaggc aagagtgcct tga 43