本发明涉及一种大肠杆菌压力响应型启动子及其制备方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
作为原核生物，大肠杆菌遗传背景清晰，基因操作简单，且生长周期短，可实现高密度发酵等使得它具有原核表达系统的许多优点。目前大肠杆菌已广泛用于基础研究及大规模的工业化生产，主要体现在用于外源蛋白的表达、代谢途径重构生产有价值的目的产物等。其表达系统中强启动子的应用对于外源蛋白的高效表达起到关键作用。
为了提高目的产物产量，代谢工程中常用的手段是利用强启动子过量表达合成代谢途径中关键酶的编码基因，但大肠杆菌中启动子活性较强的大多为诱导型启动子(如T7启动子)。诱导表达过程中需添加诱导剂，不适于大规模生产，还可能对细胞具有一定的毒性。细胞对诱导剂感应也存在非均一性，即诱导物浓度效应往往只是增加群体中基因表达的细胞数而非各单个细胞的表达水平，不具有表达的均一性。并且为了细胞在不同的环境条件下(如低温、高盐浓度、低pH等)，均能高强度地表达外源蛋白，构建一种能够强自诱导型启动子对于扩展大肠杆菌的工业化应用具有重大意义。
技术实现要素：
为了解决大肠杆菌在不同环境下均无需添加诱导剂高强度表达外源基因的问题，本发明提供了大肠杆菌压力响应型启动子及其制备方法。所述压力包括低温、低pH、高渗透压。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.19任一所示。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子是由大肠杆菌σ因子：σ24|、σ32、σ38、σ70识别的启动子串联组合突变得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子是由大肠杆菌σ因子：σ24|、σ32、σ38、σ70识别的启动子-35及-10区串联组合得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述启动子是由大肠杆菌σ因子：σ24|、σ32、σ38、σ70识别的启动子对间隔序列兼并突变得到的。
本发明还提供一种构建大肠杆菌强自诱导型启动子的方法，主要包括以下步骤：
(1)串联保守序列；将σ24|、σ32、σ38、σ70识别的-35区及-10区人为组合，构建σ38-70、σ32-70、σ24-70、σ32-38、σ24-38、σ32-24、σ70-24-32、σ32-38-24、σ24-38-32-709种启动子。
(2)兼并突变：对构建的9种启动子的间隔序列设计兼并引物随机突变，构建对应的五个启动子文库。
(2)高通量筛选：对构建的9种启动子文库，以绿色荧光蛋白作为指示蛋白，筛选指标为相对荧光强度，筛选压力响应型启动子。
本发明还提供携带所述启动子的载体，可以是pColaDuet-1、pRSFDuet-1、pACYCdUET-1、pCDFDuet-1、pETDuet-1、pET28a、pET20b、pET32a、pET22b、pUC18等载体。
有益效果：本发明所获得的启动子在不同的压力(如低pH、高盐、低温)环境条件下，均能高效的启动GFP的表达。
附图说明
图1所示为所设计的9种大肠杆菌强自诱导型启动子
图2所示为所构建启动子库的筛选结果
图3所示为所筛选的强自诱导型启动子在不同压力条件下生长曲线及相对荧光强度。
具体实施方式
序列表中为相关核苷酸序列信息：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.19筛选得到的最优压力响应强自诱导型启动子核苷酸序列。
GFP荧光强度的检测方法：样品12000Xg，离心2min，收集菌体，PBS缓冲液洗三次，用PBS稀释到一定浓度的菌体悬液，取200μL加入96孔酶标板。程序设置为：中度震板1min，600nm处检测菌体浓度；激发光为495nm，吸收光为525nm，增益80，检测用光。
培养基：LB培养基(酵母浸膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L)。
实施例1启动子文库的构建(图1)
荧光蛋白GFP表达载体的构建：pCOLADet-GFP质粒的构建：用引物egfp F、egfp R为引物，PCR获得编码GFP的基因。对PCR产物及质粒pCOLADuet-1分别用BglII及XhoI双酶切，胶回收后用T4DNA连接酶连接构建重组载体pCOLADet-GFP。
启动子文库的构建：所设计的启动子文库序列如图1所示，根据图1设计引物如下表1所示，以pCOLADet-GFP为模板，用下表1的引物对进行PCR，进行引物介导的启动子替换。PCR所扩增的产物用DpnI消化后直接转化BL21DE3，涂布LB平板，即可获得启动子文库。
表1
实施例2启动子文库的筛选人工序列
将所构建的含有启动子的重组质粒转化大肠杆菌BL21DE3，涂布平板，获得转化子，挑取转化子至96孔板培养(37℃、200rpm)，酶标仪测定菌液的OD600和GFP荧光强度，筛选不同表达水平的突变体文库。将初筛获得含有启动子的重组大肠杆菌在摇瓶水平发酵检测启动子所启动的GFP荧光强度，此即为复筛，复筛结果如图2所示。
实施例3启动子对压力响应条件测试
将复筛得到的含有启动子的重组大肠杆菌，在下述(1)～(4)所述的不同压力条件下培养(250mL三角瓶，装液量25mL，转速220rpm)，检测GFP的荧光强度；
(1)正常条件：37℃，pH～7.0，LB培养基；
(2)低温：20℃，pH～7.0，LB培养基；
(3)高渗透压：往LB培养基中添加终浓度0.5M NaCl，37℃，pH～7.0，LB培养基；
(4)低pH：往培养基中添加柠檬酸缓冲液调节pH至4.5，37℃，NaCl 0.17M，LB培养基。
从图3A-3D可以看出，所筛选获得的启动子在不同压力条件下，相对于T7启动子，都有较强的荧光强度，尤其是P21285及191启动子。
启动子核苷酸序列如下所示：
Sequence1-191：TTGACACGAACTATGAGCCTTGATATAATTCTGACTCCCCATACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence2-295：TTGACATGAACTAGTAGCCTTGATATAATTCTGACTCCCCATACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence3-1975：TTGACAAGAACTACGAGCCTTGATATAATTCTGACTCCCCATACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence4-1925：TTGACAAGAACTAGCTGCCTTGATATAATTCTGACTCCCCATACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence5-21285：GAACTATCGCCTTGAAACATTCTCTGACCCCATTGACAGTCTTGTCCGGCCCACTTATAATGCTATACTACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence6-11223：GAACTATGGCCTTGATCAGATCTCTGACCCCATTGACATTCTTGTTCAACCGGGTTATAATGCTATACTACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence7-21280：GAACTAGCGCCTTGATTCTACGTCTGACCCCATTGACAGTCTTGTGTAACGCCGTTATAATGCTATACTACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence8-21294：GAACTAAGGCCTTGAAAGATGCTCTGACCCCATTGACAGTCTTGTGGCCATTGGTTATAATGCTATACTACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence9-21273：GAACTATCGCCTTGAATCATTCTCTGACCCCATTGACAATCTTGTACGGGCCGCATATAATGCTATACTACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence10-11225：GAACTAGCGCCTTGAATCGGGATCTGACCCCATTGACAGTCTTGTAGGTTAGAGATATAATGCTATACTACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence11-11294：GAACTACTGCCTTGAAAAGCGTTCTGACCCCATTGACATTCTTGTCGCATATGTCTATAATGCTATACTACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence12-21265：GAACTACCGCCTTGAACGTCGATCTGACCCCATTGACATTCTTGTTCTGAAGGTGTATAATGCTATACTACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence13-11235：GAACTAAGGCCTTGATTCCCTGTCTGACCCCATTGACATTCTTGTTTGGGGGCTCTATAATGCTATACTACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence14-11257：GAACTACTGCCTTGACGAACGTTCTGACCCCATTGACAGTCTTGTACCCAATGTATATAATGCTATACTACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence15-2977：TTGACAAGAACTAGGCGCCTTGATATAATTCTGAAGCCCCATACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence 16-21232：
GAACTAGAGCCTTGACCCAACTTCTGACCCCATTGACAATCTTGTGTCCCAGCGATATAATGCTATACTACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence 17-21233：
GAACTAAGGCCTTGACATCCATTCTGACCCCATTGACAATCTTGTCCTTAAGGAGTATAATGCTATACTACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence 18-2975：
TTGACATGAACTAAGAGCCTTGATATAATTCTGAAGCCCCATACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
Sequence 19-21215：
GAACTACCGCCTTGAAGAACACTCTGACCCCATTGACAATCTTGATAGAAGGCTATAATGCTATACTACATATGGCAGATCTAAGGAGGAAAATAT
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种大肠杆菌压力响应型启动子及其制备方法
<160> 39
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttgacacgaa ctatgagcct tgatataatt ctgactcccc atacatatgg cagatctaag 60
gaggaaaata t 71
<210> 2
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttgacatgaa ctagtagcct tgatataatt ctgactcccc atacatatgg cagatctaag 60
gaggaaaata t 71
<210> 3
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttgacaagaa ctacgagcct tgatataatt ctgactcccc atacatatgg cagatctaag 60
gaggaaaata t 71
<210> 4
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttgacaagaa ctagctgcct tgatataatt ctgactcccc atacatatgg cagatctaag 60
gaggaaaata t 71
<210> 5
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gaactatcgc cttgaaacat tctctgaccc cattgacagt cttgtccggc ccacttataa 60
tgctatacta catatggcag atctaaggag gaaaatat 98
<210> 6
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaactatggc cttgatcaga tctctgaccc cattgacatt cttgttcaac cgggttataa 60
tgctatacta catatggcag atctaaggag gaaaatat 98
<210> 7
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
gaactagcgc cttgattcta cgtctgaccc cattgacagt cttgtgtaac gccgttataa 60
tgctatacta catatggcag atctaaggag gaaaatat 98
<210> 8
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gaactaaggc cttgaaagat gctctgaccc cattgacagt cttgtggcca ttggttataa 60
tgctatacta catatggcag atctaaggag gaaaatat 98
<210> 9
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gaactatcgc cttgaatcat tctctgaccc cattgacaat cttgtacggg ccgcatataa 60
tgctatacta catatggcag atctaaggag gaaaatat 98
<210> 10
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gaactagcgc cttgaatcgg gatctgaccc cattgacagt cttgtaggtt agagatataa 60
tgctatacta catatggcag atctaaggag gaaaatat 98
<210> 11
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gaactactgc cttgaaaagc gttctgaccc cattgacatt cttgtcgcat atgtctataa 60
tgctatacta catatggcag atctaaggag gaaaatat 98
<210> 12
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gaactaccgc cttgaacgtc gatctgaccc cattgacatt cttgttctga aggtgtataa 60
tgctatacta catatggcag atctaaggag gaaaatat 98
<210> 13
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gaactaaggc cttgattccc tgtctgaccc cattgacatt cttgtttggg ggctctataa 60
tgctatacta catatggcag atctaaggag gaaaatat 98
<210> 14
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gaactactgc cttgacgaac gttctgaccc cattgacagt cttgtaccca atgtatataa 60
tgctatacta catatggcag atctaaggag gaaaatat 98
<210> 15
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ttgacaagaa ctaggcgcct tgatataatt ctgaagcccc atacatatgg cagatctaag 60
gaggaaaata t 71
<210> 16
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gaactagagc cttgacccaa cttctgaccc cattgacaat cttgtgtccc agcgatataa 60
tgctatacta catatggcag atctaaggag gaaaatat 98
<210> 17
<211> 98
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gaactaaggc cttgacatcc attctgaccc cattgacaat cttgtcctta aggagtataa 60
tgctatacta catatggcag atctaaggag gaaaatat 98
<210> 18
<211> 71
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ttgacatgaa ctaagagcct tgatataatt ctgaagcccc atacatatgg cagatctaag 60
gaggaaaata t 71
<210> 19
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gaactaccgc cttgaagaac actctgaccc cattgacaat cttgatagaa ggctataatg 60
ctatactaca tatggcagat ctaaggagga aaatat 96
<210> 20
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ctattagatc taaggaggaa aatatatggg taagggagaa gaacttttca c 51
<210> 21
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ctattagatc taaggaggaa aatatatggg taagggagaa gaacttttca c 51
<210> 22
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 22
gctatactnt ataatacata tggcagatct aaggagg 37
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 23
nnnnnnnntg tcaannacaa gaatttccta atgcaggagt cg 42
<210> 24
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(13)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 24
ccccatnnnn nnntataata catatggcag atctaaggag g 41
<210> 25
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 25
nnnntgtcaa nntcaaggca tttcctaatg caggagtcg 39
<210> 26
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(9)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 26
tctgannnnt ataatacata tggcagatct aaggagg 37
<210> 27
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 27
nnnnnnnntg tcaanntagt tcatttccta atgcaggagt cg 42
<210> 28
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(12)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 28
ccccatnnnn nngctatact acatatggca gatctaagga gg 42
<210> 29
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 29
nnnnacaaga nntcaaggca tttcctaatg caggagtcg 39
<210> 30
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(8)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 30
tctgannngc tatactacat atggcagatc taaggagg 38
<210> 31
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(16)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 31
nnnnnnnnac aaganntagt tcatttccta atgcaggagt cg 42
<210> 32
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(12)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 32
ccccatnnnn nntctgaaca tatggcagat ctaaggagg 39
<210> 33
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(4)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(12)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 33
nnnntagttc nntcaaggca tttcctaatg caggagtcg 39
<210> 34
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(15)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 34
gatataattc tganncccca tacatatggc agatctaagg agg 43
<210> 35
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(8)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 35
aaggcnnnta gttcntgtca aatttcctaa tgcaggagtc g 41
<210> 36
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 36
aactagctat actnnnnnnn ntctgaacat atggcagatc taaggagg 48
<210> 37
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(11)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(19)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 37
catggggnnn nacaagannt caaggcattt cctaatgcag gagtcg 46
<210> 38
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(21)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 38
gacantcttg tnnnnnnnnn ntataatgct atactacata tggcagatct aaggagg 57
<210> 39
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(19)
<223> n is a, c, g, t or u
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(28)
<223> n is a, c, g, t or u
<400> 39
aatggggtca gannnnnnnt caaggcnnta gttcatttcc taatgcagga gtcg 54