本发明涉及一种非生物胁迫特异性表达的启动子，尤其涉及甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子及其应用，属于植物基因工程领域。
背景技术：
温度是植物生长发育过程中最重要的环境因素之一。低温不仅影响农作物生长发育和产量，也制约农作物的耕作时间和地理分布。据联合国粮食及农业组织(FAO，Food and Agriculture Organization of the United Nations)最新数据统计，我国甘薯种植面积为337万公顷，占世界种植面积的40％，是最大的种植甘薯国；总产量713万吨，占世界甘薯产量的73％。甘薯因其耐贫瘠、易管理、产量高和丰富的营养价值，广泛的应用在人们日常消费、动物饲料以及工业燃料中，是继水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食产物。然而甘薯喜温、不耐寒，与水稻、玉米、棉花相似，易受低温影响，造成减产。甘薯不论苗期生长或是收获后储藏对低温都非常敏感。当气温降到15℃，甘薯就停止生长，低于9℃，薯块将逐渐受冷害而腐烂；地上部茎叶经霜冻后很快丧失活力而死亡。甘薯的不耐低温性严重制约了甘薯产业的发展。
为应对低温等各种非生物逆境，植物形成了复杂的调控网络来感知、响应及适应外界环境的变化。ICE-CBF转录因子途径在植物抗寒机理研究的最为深入。在许多植物中，过表达ICE或CBF都可以提高植物的抗寒性。在拟南芥中，CBF3转录因子不仅调控大量下游抗逆基因的表达，同时其自身的表达也受到上游基因的作用。其上游转录因子ICE1可以结合在CBF3启动子的MYC元件(或ICE box)上来激活CBF3的表达以应答低温胁迫。
在本发明中我们根据甘薯主栽品种徐薯18中克隆得到的IbCBF3基因序列，设计引物通过染色体步移的方法获得该基因的启动子序列。用PLACE中的plant care软件对该序列进行了分析，启动子元件预测结果显示：在IbCBF3启动子中除了转录必须的TATA-box、GATA-box以CAAT-box等保守元件外，还存在一些感应环境胁迫、光、水分、激素应答及生长发育调节的元件，如响应参与光调节的ACE、ATCT-motif、GATT-motif、G-box和I-box等；脱落酸应答因子ABRE；乙烯应答因子ERE和茉莉酸甲酯应答因子CGTCA-motif等。此外该启动子还包含多个能与上游调控因子ICE基因结合MYCRE顺式作用元件CANNTG等。并利用双荧光表达系统，通过烟草叶片的瞬时表达，验证该启动子在低温条件下可以结合到上游基因，诱导和低温胁迫有关基因的表达。
技术实现要素：
本发明旨在提供甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子及其应用，该启动子属于低温响应途径中关键转录因子CBF3的启动子，内容涉及其cDNA全长序列、功能域分析，该基因低温胁迫诱导下能与上游基因IbICE1结合，诱导下游基因的表达。
本发明的第一个目的是提供一种甘薯IbCBF3非生物胁迫特异性表达的启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
扩增所述甘薯IbCBF3启动子任意片段的引物对如SEQ ID NO.2～11所示。
扩增所述甘薯IbCBF3启动子全长的引物对如SEQ ID NO.12～13所示。
甘薯IbCBF3上游基因IbICE1，其特征在于序列表中SEQ ID NO.14所示的cDNA片段。
扩增所述甘薯IbICE1启动子全长的引物对如SEQ ID NO.15～16所示。
本发明实施例中提供构建甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子的方法，
(1)对甘薯IbCBF3基因启动子的克隆，以甘薯cDNA为模板，对该序列PCR扩增，获得甘薯IbCBF3基因启动子序列全长；
(2)构建甘薯IbCBF3上游基因IbICE1，连接到T-blunt载体上，并将其转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，获得重组载体IbCBF3pro-GUS和CaMV35S-IbICE1；
(3)重组载体质粒分别转化至农杆菌菌株GV3101中，在YEP培养基中提取单菌落基因组进行PCR验证。
本发明的第二目的是提供含有所述启动子的重组载体。
所述本发明的一种实施例中，所述重组载体为IbCBF3pro-GUS和CaMV35S-IbICE1。
本发明还提供一种烟草双荧光酶表达系统的构建，含有重组载体、重组菌、转基因细胞系或表表达盒。
所述含有上述SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.14所示的DNA片段。
本发明的第三目的是利用上述甘薯低温诱导特异性表达的启动子在植物的遗传育种中的应用。
所述启动子为核苷酸序列中的2118位碱基的核酸序列,该核酸序列编码一个受低温诱导的、能调控冷诱导基因的转录因子。
所述启动子区域包含4个ABRE、1个ERE和1个CGTCA-motif等顺式作用元件,能特异的对脱落酸、乙烯和茉莉酸甲酯等激素应答。该启动子还包含5个MYCRE顺式作用元件CANNTG,能与上游调控因子IbICE1基因结合。
利用该基因启动子和上游调控基因IbICE1构建双荧光素酶报告系统载体，并利用农杆菌介导技术注射烟草叶片。实验表明在烟草受到低温胁迫时，IbICE1能与该基因启动子强烈结合，诱导报告基因(GUS基因)的表达。
本发明的有益效果：
本发明的DNA片段是甘薯低温胁迫途径中关键转录因子IbCBF3的启动子，该启动子含有多个逆境和激素响应元件。通过在烟草叶片中双荧光酶系统分析，该启动子在低温胁迫下与上游基因IbICE1快速结合，诱导下游基因的表达情况，可以用于甘薯耐低温性研究和转基因育种。
附图说明
图1为双荧光表达载体示意图
图2为烟草叶片中启动子受低温诱导结合上游基因
具体实施方式
实施例1甘薯IbCBF3基因启动子的克隆
根据甘薯低温胁迫信号传导途径中重要的转录因子IbCBF3的cDNA序列，按Clontech公司的genome walker试剂盒说明书要求利用已获得的IbCBF3基因的全长序列设计3个特异性引物(SEQ ID NO.2:SP1:5'-GAAGTTGAGACAGGCGGAGCAG-3’；SEQ ID NO.3SP2:5'-GTCTCCCGAAACTTCTTCCTCCC-3'；SEQ ID NO.4SP3:5’-CCAACAACACCTCTTCATCCGACA-3',设计方向为需要扩增的未知区域方向，SP2的位置位于SP1的内侧，SP3位于SP2的内侧)和试剂盒中提供的四种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物AP1、AP2、AP3、AP4为引物进行巢式PCR扩增。将扩增结果进行胶回收后测序。设计SEQ ID NO.5～6(SEQ ID NO.5:5’-TGATAGTGAGTTGGGTTAGC-3；SEQ ID NO.6:5’-TCCATATACGGCGGTACTT-3’),以甘薯cDNA为模板，对该序列PCR扩增，扩增产物进行胶回收后测序，验证该序列。并根据测序结果，设计第二次genome walking的特异引物(SEQ ID NO.7SP4:5’-GGAGTGTGATAAGGAGACAG-3’；SEQ ID NO.8SP5:5’-CGCTACTGAAAGAGACAACA-3’；SEQ ID NO.9SP6:5’-CCTTCACGGTGCAGAATG-3’,SP6的位置位于SP5的内侧，SP5位于SP4的内侧)和试剂盒中提供的四种经过独特设计的退火温度较低的兼并引物AP1、AP2、AP3、AP4为引物进行巢式PCR扩增，将扩增结果进行胶回收后测序。设计SEQ ID NO.10～11(SEQ IDNO.10:5’-CATCTCGCCTAACTGTCAA-3’；SEQ ID NO.11:5’-GCTAACCCAACTCACTATCA-3’),以甘薯cDNA为模板，对该序列PCR扩增，扩增产物进行胶回收后测序，验证该序列。拼接两次genome walking结果，获得甘薯IbCBF3基因启动子序列全长。
实施例2甘薯IbCBF3基因启动子的序列分析
PLACE中的plant care软件对该序列进行了分析，结果显示：在IbCBF3启动子中除了转录必须的TATA-box、GATA-box以及CAAT-box等保守元件外，还存在一些感应环境胁迫、光、水分、激素应答及生长发育调节的元件，如响应参与光调节的ACE、ATCT-motif、GATT-motif、G-box和I-box等；脱落酸应答因子ABRE；乙烯应答因子ERE和茉莉酸甲酯应答因子CGTCA-motif等。此外该启动子还包含多个能与上游调控因子ICE基因结合MYCRE顺式作用元件CANNTG。
实施例3双荧光表达载体的构建
以徐薯29的cDNA为模板，分别用引物SEQ ID NO.12～13(SEQ ID NO.125’-GATTGGGAAGAAAGTAT-3’；SEQ ID NO.135’-ATACGGCGGTACTTAGTAAAC-3’)扩增IbCBF3的启动子全长序列和引物SEQ ID NO.15～16(SEQ ID NO.155’-ATGTTATCAAGAGTGACAAGC’；SEQ ID NO.165’-GATCATCCCGTTGAAGCTAG’)扩增IbICE1基因，连接到T-blunt载体上，并将其转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。在LB培养基中加入卡那霉素，经平板筛选，获得单菌落，提取单菌落基因组进行PCR验证，通过验证的单菌落摇菌提取质粒进行测序。按TAKARA公司的In-fusion试剂盒说明书要求分别将IbCBF3启动子(简称IbCBF3pro)和IbICE1基因构建到载体pBI101和pCAMBIA1200中，获得重组载体IbCBF3pro-GUS和CaM35S-IbICE1。
实施例4烟草叶片中启动子受低温诱导结合上游基因的分析
重组载体质粒IbCBF3pro-GUS和CaM35S-IbICE1分别转化至农杆菌菌株GV3101中，在YEP培养基中加入卡那霉素或者氯霉素，经平板筛选，获得单菌落，提取单菌落基因组进行PCR验证。挑取农杆菌单菌落接种在液体YEP培养基，30℃过夜培养。取100μl过夜培养液转接到含有100μM乙酰丁香酮(As)的新鲜的YEP培养基中，30℃培养4-6小时，培养液OD600达到0.8-1.0，离心收集菌体。用浸染液(50mM Mes-KOH，50mM MgCl2和200μM As)重新悬浮菌体，分别调至终浓度OD600＝1.5后，注射烟草叶片，并放在室温恢复2天。把烟草移入4℃处理3小时，同时设计独照组(25℃处理3小时)，进行GUS染色分析。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江苏徐淮地区徐州农业科学研究所(江苏徐州甘薯研究中心)
<120> 甘薯IbCBF3基因非生物胁迫特异性表达的启动子及其应用
<130> 2018.4.24
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2118
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtgtaggat cacagagcag tggtccgttc ttaggcatcc taaatgagca gtcagcctaa 60
cacaacatat ttggaaaata ccacaaatat taccacctat tatatctaac acatgaatat 120
atgaaaaata ttatatgtac tctcattttc tactctcaac ttttatggca tgtttggttg 180
gatggaaaat caattccatg gaaaagattt tccaaaaagt tgaggaaaat gatgaataat 240
tatgttgttt ggttggatgg aaaatgtttt ccatggaatt tgacttccca aaagaaagga 300
aaataaattc tttggttgag ataggtattt tgttttccaa agagattggg aagaaagtat 360
aagcccttgg actattttac cctcatcaaa attgactaat tacacatgta tatatagcca 420
aaccattaat tactaaaggc atattgatct ttatattcat aattccttac cattccaaac 480
ccaaccaaat aatggaattc atatttccaa taatttcttt tccaccaacc aaacagtggg 540
atctattttc ctggtaccac ggaatttgaa tttcatttcc ttcaaatatt ttctagcaac 600
caaacgaact gttacttttc cacacaaatc ttgatataga tacttatatt gaaatctaca 660
tgaaaaaata gcttattagt gtccgtcata tcaagaaata aaatgtccat gtagtagata 720
tattggtaat aattgattct agaaaaagta atgtagtatt gtcacaaatt tggtacaata 780
cgacaagttg atactgagat ttgtgaatct ccagccttcc gtacaggtgt actaggtggt 840
agtaggtacc taggcgatga aagggacaaa ggagtagaga tttggtggtt ccttgacaag 900
atttgggcgg ggcatgggat gaagccatta ggcatgtggc tcacgcgttt ccgtggaaaa 960
accaccggcg ttttactgct tccaaccaat catcaatcct aataatgttt tttttttttt 1020
tgagaaatca atcctaataa tgttggcggt tgtaaaacta acatctcgcc taactgtcaa 1080
ccgcgtctat catctccatc tttcatcctc caattaactg tcacctcgct ccaaacaatc 1140
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ctgtactcta tgtattgctg attatatatt tattttaaag aaaattaata taaaatttga 1260
aattttacgt agccgtataa aaatcttgtg tgagaccgtt ttacgaatct taatctattt 1320
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gcgtgaccca aatccagttg gcagtttgaa tgaccccacc acgtacagct ggctattcac 1860
ttcatcatat tttccatatt tacctcaatt cccagttcct tcctcctagg ctgtctcctt 1920
atcacactcc gtgttttttc gcgtctccaa cgtaagctta tcaccttaca cttatcgaac 1980
actccccccc tcacccaccc atacgcatac atatatatat aactcccatt ttaggtagtg 2040
tgttaattac ttcatacata cacactccat tttagctttt ccatatatat atatatactt 2100
tactaagtac cgccgtat 2118
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<400> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtctcccgaa acttcttcct ccc 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ccaacaacac ctcttcatcc gaca 24
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<212> DNA
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tccatatacg gcggtactt 19
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<211> 20
<212> DNA
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<212> DNA
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<210> 10
<211> 19
<212> DNA
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catctcgcct aactgtcaa 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gctaacccaa ctcactatca 20
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
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<400> 12
gattgggaag aaagtat 17
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
atacggcggt acttagtaaa c 21
<210> 14
<211> 1638
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
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gatttggggt gtgagagtgg gtttcttgaa actcaagccc tgagtggttt gagtagaggg 480
ggaggggttt tgggtggtgg gtttggtgat ttgagctgtc agaacttctt gggggctccc 540
aacttgagct ctgttcctca atttggttca acccatttgc tgcaacttcc acacaatggt 600
ggaggagggg ggtttggtcc actagggttt ggagagggct atgtgaatgt gaatgagaat 660
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tttgataaga agagtgaagt gaatgagagg aagaggaaag ggagcaatgg gggggatgaa 900
ttggaggatg tgagcattga tggctccaac ttgaactatg actcagatga gcttgtcgaa 960
aacagtggca aagttgatga aagtgtgaag aatggtggaa ttagctcctc caatgccact 1020
gggggtgacc aaaaggggaa gaagaaaggg cttccagcca agaacttgat ggccgaaagg 1080
aggcgtagga agaagctcaa cgacaggctt tacatgttga ggtctgttgt cccgaagatt 1140
agtaagatgg acagagcttc gattttaggg gatgcaattg aatacttgaa ggaacttctg 1200
cagaaaatca atgacctcca caatgaactc gagtctactc ctccttgctc cgcattaacc 1260
cctaattcga gtttctaccc gttgacacca actgcatctg ccctaccctg ccgtatcaaa 1320
gaagaaatca gtccaactgc atttgcaagc ccgctgtcta gtccaactgg acagcctgca 1380
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<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
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<211> 20
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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