本发明属于植物病害生物防治技术领域。具体而言，本发明涉及一株能够高效防治丝瓜根结线虫的米氏假单胞杆菌及其用途，以及采用该米氏假单胞杆菌制备的生物防治制剂。
背景技术
植物寄生线虫是一类重要的植物病原物，每年给全球农业造成约1570亿美元的经济损失。常见根结线虫有四个种类，即南方根结线虫(meloidogyneincognita)、北方根结线虫(m.hapla)、爪哇根结线虫(m.javanica)和花生根结线虫(m.arenaria)。据不完全统计，根结线虫的寄主植物多达3000多种，包括经济、粮食、果树、蔬菜、花卉等作物，其中危害最为严重的是茄科、葫芦科和十字花科等植物。发病田的寄主常年减产15％～20％，严重时达到70％以上。丝瓜是农家庭院种植蔬菜的主要品种，在满足人们日常需要、改善生活条件方面起着重要作用。然而丝瓜根结线虫严重威胁着丝瓜生产。一般病株率为26％～48％，死亡率9.5％。
目前防治丝瓜根结线虫的方法包括农业防治和化学防治。其中，农业防治效率低、劳动量大、而且防治作用并不明显；而化学防治的长期用药，使丝瓜根结线虫产生抗药性，最终导致防治效果不理想，再加上化学药剂的大量使用对丝瓜质量安全与环境造成许多负面影响。而生物防治具有对人畜安全、环境兼容性好且病原菌不易产生抗药性等优点，因此丝瓜根结线虫的绿色无公害生物防治越来越多的受到人们关注。
假单胞菌在自然界分布广泛，种类繁多，是植物根际土壤周围起生物防治功能的主要细菌类群。目前，世界各地对假单胞菌的应用研究有了大量的报道，涉及领域包括用于农业生物防治、植物生长调节、环境保护和医药开发等，其中，在生物防治与促植物生长方面的研究最为透彻、应用最为广泛，生物防治主要作用对象为植物病原真菌，如雪霉叶枯菌、镰刀菌、棉花黄萎病菌、炭疽菌等。假单胞菌对植物生长的促进作用主要通过其产生的植物生长激素。在环境保护方面，假单胞菌主要被用于化学农药的降解、废水处理、油污处理等。用假单胞菌防治线虫鲜有报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一株用于高效防治丝瓜根结线虫的新的微生物——米氏假单胞杆菌yt1001。本发明的米氏假单胞杆菌菌株容易在在丝瓜根系周围定殖，且防治丝根结线虫的效果好，具有良好的应用前景。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：本发明所提供的菌株为米氏假单胞杆菌(pseudomonasmigulae)菌株yt1001，是从青岛胶州湾大沽河入海口湿地泥中分离获得的，已于2018年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为cgmccno.15214。其具有以下生物学特性：革兰阴性，杆状，运动，不产芽胞；在nbta平板上，菌落均呈红色；在kmb平板上，菌落圆形隆起，边缘整齐，湿润，粘稠，易挑起，菌落初期透明，后期脓状样，菌落较大，显不同程度的黄色。
本发明米氏假单胞杆菌(p.migulae)菌株yt1001的培养方法或繁殖方法包括：
(1)普通培养保存采用na培养基，配方为：胰蛋白胨10g，牛肉粉3g，氯化钠5g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph调至7.2～7.4。
(2)实验室液体培养采用nybd液体培养基，配方为：牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠4.5g，水1000ml，ph调至7.2～7.4。
(3)固体培养基配方：固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比为98.8∶0.2；所述固料按质量比计为木粉∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝38∶30∶22∶10；所述无机盐的组分及重量比为：磷酸二氢钾22％，硫酸镁8％，硫酸锌3％，硫酸铵13％，轻质碳酸钙54％。
(4)发酵培养基配方：同(3)中固体培养基配方。
本发明还提供一种用于防治丝瓜根结线虫的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的米氏假单胞杆菌(p.migulae)菌株yt1001。
并且，本发明还提供了一种用于防治丝瓜根结线虫的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有根结线虫的丝瓜植株施用上述米氏假单胞杆菌(p.migulae)菌株yt1001或者上述生物防治制剂。
本发明也提供了上述米氏假单胞杆菌菌株yt1001或者上述生物防治制剂在防治丝瓜根结线虫中的用途。
本发明所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)制备所述米氏假单胞杆菌yt1001的种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，27～29℃下恒温培养；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至发酵培养基，在室温27～29℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。
在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将所述米氏假单胞杆菌的孢子移植到nybd液体培养基，27～29℃摇床振荡培养1～3d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，27～29℃下振荡培养1～3d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1∶15的比例混合，过滤，将滤液按体积比1∶6的比例接种至发酵培养基，室温27～29℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养3～4d；活性菌≥40亿/克。
其中，步骤(1)中的nybd液体培养基，配方为：牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠4.5g，加水至1000ml，ph调至7.2～7.4。
步骤(2)中的固体培养基配方：固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比98.8∶0.2；所述固料按质量比计为木粉∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝38∶30∶22∶10；所述无机盐的组分及重量比为：磷酸二氢钾22％，硫酸镁8％，硫酸锌3％，硫酸铵13％，轻质碳酸钙54％。
步骤(3)中的发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。
实验表明，本发明的米氏假单胞杆菌菌株容易在在丝瓜根系周围定殖，且防治丝根结线虫的效果好，最后一次施药后14d其防治效果为57.17％。从丝瓜长势看，米氏假单胞杆菌(p.migulae)菌株yt1001对丝瓜具有明显的促进生长效果，没有药害，安全可靠。由该米氏假单胞杆菌制备的生物防治制剂，不仅能够高效的防治丝瓜根结线虫，还能有效促进丝瓜生长，是一种极具应用前景的生物防治制剂。该微生物制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治丝瓜根结线虫。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围内。
实施例1
1、米氏假单胞杆菌(p.migulae)yt1001的分离与纯化
本发明的米氏假单胞杆菌(p.migulae)yt1001是从青岛胶州湾大沽河入海口湿地泥中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：
(1)菌株的分离
样品于2014年5月11日采集自青岛市胶州湾大沽河入海口泥样，称取1g样品于99ml无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μl10-2、10-3、10-4稀释液涂布于lb培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取lb培养基上的不同形态的微生物菌落于lb培养基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化菌株，并编号保存。
(2)丝瓜根结线虫高效拮抗菌株的筛选
①初筛
a.根结线虫二龄幼虫悬浮液的制备
从丝瓜根部挑取新鲜卵块，置于自制孵化装置中进行孵化，24h后开始收集幼虫，每天收集一次，共收集一周。线虫液稀释为100条/ml，4℃保存待用。
b.菌株对南方根结线虫二龄幼虫的作用
吸取菌悬液2ml，加入直径为7.5cm的灭菌培养皿中，再加入2ml二龄幼虫的悬浮液，以清水作对照，各处理3次重复，25℃培养。分别在12h、24h、36h、48h和60h后观察线虫的活力。
c.菌株对南方根结线虫卵块孵化的作用
吸取菌悬液2ml，加入直径为7.5cm的灭菌培养皿中，再加入10粒卵块，以清水作对照，各处理3次重复，25℃培养。分别在24h、48h和60h后观察幼虫的孵化情况。
②复筛
将筛选到的具有高效拮抗活性的菌株进行复筛，主要是经过耐温性、耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的菌株，进行盆栽防治试验和田间试验。
本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治丝瓜根结线虫病的米氏假单胞杆菌(p.migulae)yt1001。实验证明，该米氏假单胞杆菌发酵液在防治丝瓜根结线虫病中显示出非常高效的防治效果，使得丝瓜长势良好。因而，本发明的米氏假单胞杆菌是具有广泛应用前景的米氏假单胞杆菌新菌株，可以用于制备防治丝瓜根结线虫病的生物防治制剂。
2、菌株鉴定
(1)微生物学特性：革兰阴性，杆状，运动，不产芽胞；在nbta平板上，菌落均呈红色；在kmb平板上，菌落圆形隆起，边缘整齐，湿润，粘稠，易挑起，菌落初期透明，后期脓状样，菌落较大，显不同程度的黄色。
(2)分子生物学特性
该菌株的16srdna基因序列测定结果如下(seq-1)：gtcctcccgaaggttagacttagctacttctggtgcaacccactcccatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcgacattctgattcgcgattactagcgattccgacttcacgcagtcgagttgcagactgcgatccggactacgatcggttttctgggattagctccacctcgcggcttggcaaccctctgtaccgaccattgtagcacgtgtgtagcccaggccgtaagggccatgatgacttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtctccttagagtgcccaccattacgtgctggtaactaaggacaagggttgcgctcgttacgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacagccatgcagcacctgtctcaatgttcccgaaggcaccaatccatctctggaaagttcattggatgtcaaggcctggtaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcatttgagttttaaccttgcggccgtactccccaggcggtcaacttaatgcgttagctgcgccactaagagctcaaggctcccaacggctagttgacatcgtttacggcgtggactaccagggtatctaatcctgtttgctccccacgctttcgcacctcagtgtcagtatcagtccaggtggtcgccttcgccactggtgttccttcctatatctacgcatttcaccgctacacaggaaattccaccaccctctaccatactctagctcgacagttttgaatgcagttcccaggttgagcccggggatttcacatccaacttaacgaaccacctacgcgcgctttacgcccagtaattccgattaacgcttgcaccctctgtattaccgcggctgctggcacagagttagccggtgcttattctgtcggtaacgtcaaaacagcaaagtattaatttactgcccttcctcccaacttaaagtgctttacaatccgaagaccttcttcacacacgcggcatggctggatcaggctttcgcccattgtccaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctggaccgtgtctcagttccagtgtgactgatcatcctctcagaccagttacggatcgtcgccttggtgagccattacctcaccaactagctaatccgacctaggctcatctgatagcgcaaggcccgaaggtcccctgctttctcccgtaggacgtatgcggtattagcgtccgtttccgagcgttatcccccactaccaggcagattcctaggcattactcacccgtccgccgctctcaagagaagcaagcttctctctaccgctcgactgcatgtgtatctgc。
(3)细胞形态和理化实验结果
米氏假单胞杆菌(p.migulae)yt1001的细胞形态和理化实验结果如表1所示。
表1米氏假单胞杆菌(p.migulae)yt1001的细胞形态和理化实验结果
实施例2
1、米氏假单胞杆菌菌种发酵过程
nybd液体培养基，配方为：牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠4.5g，水1000ml，ph调至7.2～7.4。
固体培养基配方：固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比为98.8∶0.2；所述固料按质量比计为木粉∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝38∶30∶22∶10；所述无机盐的组分及重量比为：磷酸二氢钾22％，硫酸镁8％，硫酸锌3％，硫酸铵13％，轻质碳酸钙54％。配制方法：加入适量的水(10-15倍质量)溶解无机盐，得到无机盐溶液；无机盐溶液与固料混合，并加入水最终调整固体培养基的含水量为40-60％，以将固体培养基攥在手中，指缝中有水但不会滴落为宜。
发酵培养基同固体培养基。
米氏假单胞杆菌(p.migulae)菌株yt1001大量固体发酵过程：
①菌种种子液培养
将米氏假单胞杆菌菌株(p.migulae)yt1001从试管斜面中挑取少量细菌，移至nybd液体培养基中，28℃摇床振荡培养1～3d，此为种子液。
②固体生产菌种的培养
将种子液按10％的比例接种到固体培养基(500ml三角瓶)中，28℃恒温培养1～3d，中间多次振荡。
③大量固体发酵：
将②中固体培养的培养物加入无菌水按质量比1∶15比例稀释，并用灭菌纱布过滤，除去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1∶6接种于大量发酵培养基。将接种的原料置于发酵室(28℃和相对湿度85％以上)中发酵培养3～4d，即可得到固体发酵培养物，活性菌可达到40亿/克。
为了明确米氏假单胞杆菌(p.migulae)菌株yt1001固体发酵培养物对丝瓜根结线虫的防治效果，为其推广应用提供依据。我们于2016年10月～12月在山东省寿光市进行试验，现将试验结果报告如下：
1供试材料及方法
1.1供试药剂
按本发明实施例1发酵方法生产的米氏假单胞杆菌(p.migulae)菌株yt1001固体发酵培养物(40亿/克)；1.8％阿维菌素乳油(河南绿野之星作物保护有限公司生产，市售)。
1.2试验材料与防治对象
试验材料为丝瓜，品种为寿光长绿丝瓜；防治对象为丝瓜根结线虫病。
1.3试验地情况
试验地设在山东省寿光市洛城街道办事处日光温室。该地区由于连续种植丝瓜，丝瓜根结线虫病的发生也日益严重，特别是在温室条件下四季连续发病，其毁苗种植事件经常发生。试验土壤类型为潮土，有机质含量为3.25％，ph值为7.6，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时丝瓜根结线虫处于发病初期。
1.4试验设计及安排
本试验共3个处理，分别为米氏假单胞杆菌(p.migulae)菌株yt1001固体发酵培养物15倍液、1.8％阿维菌素乳油300倍液、不施药清水作对照，每个处理4次重复，每个处理60株。于发病初期对病株及其附近植株灌根，连续2次，每次每病株灌药液300ml。于2016年11月16日和12月13日各灌根一次。
1.5试验调查及计算方法
1.5.1气象条件
第1次施药(11月16日)当日多云，风力3级，最高气温为13℃，最低气温为8℃，相对湿度为72％。第2次施药(12月15日)，当日晴，风力3级，最高气温为5℃，最低气温为-5℃，相对湿度为67％。
1.5.2药效及安全性调查
药效调查：最后一次施药后14d进行调查。调查30株，调查病株及根系受侵染程度，记录病情级数并计算病情指数。
安全性调查：于第一次施药后7d和14d观察丝瓜的安全性，如有药害发生，详细描述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。
丝瓜根结线虫分级标准：
0级：根系上无根结。
1级：轻度感染，仅有少量的小根结，根结率在3％以下。
2级：根结率为3％～25％。
3级：根结较多，根结率为25％～50％。
4级：在根瘤上有再次根结，50％～75％根系有根结。
5级：根结相互连接成根结团块，75％以上根系有根。
1.5.3药效计算方法
防治效果按式(1)、(2)计算：
式中：ck0——空白对照区施药前病情指数；
ck1——空白对照区施药后病情指数；
pt0——药剂处理前施药前病情指数；
pt1——药剂处理后施药后病情指数。
1.5.4对丝瓜的直接影响
观察药剂对丝瓜有无药害，记录药害的类型和程度。此外，也要记录对丝瓜长势的影响。
用下列方式记录药害：
(a)如果药害能被测量或计算，要用绝对值表示，例如株高。
(b)在其他情况下，可以按下列两种方法估计药害程度和频率：
①按照药害分级方法记录每小区的药害程度，以—、+、++、+++、++++表示。
药害分级方法：
—：无药害；
+：轻度药害，不影响植物生长；
++：中度药害，可复原，不会降低植物生物量；
+++：中度药害，影响植物正常生长，对植物生物量造成一定程度的降低；
++++：严重药害，植物生长受阻，植物生物量降低严重。
②将药剂处理区与空白对照区比较，评价其药害百分率。同时，要准确描述植物的药害症状(矮化、褪绿、畸形等)。
2结果
2.1供试药剂对丝瓜根结线虫的防治效果
化学防治具有效果快、效率高等优点，但其长期用药，可使丝瓜根结线虫产生抗药性，最终导致防治效果不理想，再加上化学药剂的大量使用对丝瓜质量安全与环境造成许多负面影响。而生物防治具有对人畜安全、环境兼容性好且病原菌不易产生抗药性等优点，因此丝瓜根结线虫的绿色无公害生物防治越来越多的受到人们关注。表3结果显示，米氏假单胞杆菌(p.migulae)菌株yt1001固体发酵培养物对丝瓜根结线虫防治效果为57.17％，与1.8％阿维菌素乳油66.67％的防治效果相差较小，表现出了较好的防治效果，尤其是作为具有对人畜安全、环境兼容性好且病原菌不易产生抗药性等优点的生防菌剂表现出了较好的防治效果。
表2三种药剂处理前丝瓜根结线虫病害情况
表3三种药剂处理对丝瓜根结线虫的防治效果
2.2丝瓜安全性调查
经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，丝瓜生长正常，无药害产生，说明米氏假单胞杆菌固体发酵培养物对丝瓜安全。
3小结
3.1从病情指数和防治效果来看，米氏假单胞杆菌(p.migulae)菌株yt1001(保藏号cgmccno.15214)对丝瓜根结线虫具有较好的防治效果，最后一次施药后14d其防治效果为57.17％。
3.2从丝瓜长势看，米氏假单胞杆菌(p.migulae)菌株yt1001对丝瓜具有明显的促进生长效果，没有药害，安全可靠。
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<110>山东济宁邦尔利工贸有限公司
<120>一株米氏假单胞杆菌及其在防治丝瓜根结线虫中的应用
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<213>米氏假单胞杆菌（pseudomonasmigulae）菌株yt1001的16srdna基因序列
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