本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种帕金森病致病基因、试剂盒及应用。
背景技术
帕金森病(parkinson’sdisease，pd)，为一种常见的神经退行性疾病(neurodegenerativediseases)，患病率高，国内外流行病学调查显示65岁以上的老年人群中pd的患病率约为1～2％，80岁以上老年人群患病率高达4％。我国现有约250万名pd患者，随着我国人口老龄化及人均寿命的延长，预计到2030年，我国将有约500万名pd患者，占世界pd患者总数的57％。pd患者隐袭起病，早期临床表现多不明显，给临床工作中早期诊断带来很大困难，而当患者出现典型的帕金森症状进行临床诊断时，此时患者多已进入疾病中晚期，已错过最佳干预治疗期，给患者及家庭带来沉重负担。因此，对pd的病因和发病机制的探讨，以便更好地对pd进行早期诊断与及早防治将显得迫切而必要。
pd主要临床表现包括运动迟缓(bradykinesia)、静止性震颤(resttremor)、肌强直(rigidity)等运动症状和嗅觉障碍(hyposmia)、快动眼期睡眠行为障碍(rapideyemovementsleepbehaviordisorder,rbd)、焦虑/抑郁(anxiety/depression)、自主神经功能障碍(autonomicnervousdysfunction)等非运动症状(non-motorsymptoms)。其病理特征主要是中脑黑质多巴胺能神经元变性缺失和残留神经元胞体中路易小体(lewybody)、路易轴突(lewyneurities)的形成。至今，pd的病因及发病机制仍不十分明确，现多认为老年化因素(aging)、遗传因素(geneticfactors)和环境因素(environmentalfactors)及其共同作用而参与疾病发生。
自上世纪90年代鉴定了pd的第一个致病基因-snca以来，遗传因素对pd的贡献受到越来越多关注。目前，遗传因素在pd发病机制研究、药物研发、疾病早期诊断/预警研究等方面提供了新思路。至今，在致病基因研究方面，已有20个遗传性pd致病基因被明确：其中snca、uch-l1、lrrk2、htra2、gigyf2、vps35、eif4g1、dnajc13、chchd2及tmem230基因与常染色体显性(autosomaldominant，ad)遗传性pd相关；parkin、dj-1、pink1、atp13a2、pla2g6、fbxo7、dnajc6、synj1和vps13c基因与常染色体隐性(autosomalrecessive,ar)遗传性pd相关；rab39b与x连锁(x-linked)遗传性pd有关。上述致病基因的发现，为解析pd患者病因提供了新思路。
几十年来，国内外许多研究人员都对pd家系进行研究，希望鉴定出更多pd候选基因。本发明首次鉴定了pd的新候选基因nus1，对pd的诊断和治疗、发病机制提供了新思路。
nus1包含5个外显子(nm_138459.4)，共31345bp，编码一个由293个氨基酸组成的跨膜蛋白。nus1序列高度保守，并在大脑高表达(含黑质及基底节)，其具体功能仍不十分明确。nus1编码蛋白为nogo-b受体(nogo-breceptor)，其可与npc2蛋白互作，可参与细胞内胆固醇代谢、α-synuclein代谢等。
目前，pd治疗主要为对因治疗，尚无治愈手段。进行早期诊断，将使患者有机会获得及时、有效、合理的干预；同时新候选基因的发现及研究，也将为pd发病机制研究提供新思路。因此pd新候选基因的发掘及其突变位点的检测，将对潜在pd患者的超早期诊断、pd发病机制研究具有重要意义。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种帕金森病致病基因、试剂盒及应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种帕金森病致病基因，包括chr6:118015345、chr6:118014264、chr6:118014276、chr6:118015279和chr6:118028193，其具有seqidno.1-5的序列。
本发明还公开了一种帕金森病致病基因的检测试剂盒，其特征在于，包括有用于扩增上述的致病基因的试剂盒。
可选地，所述试剂盒中的引物序列如下所示：用于扩增chr6:118015345位点的引物组：seqidno:10和seqidno:11；用于扩增chr6:118014264位点的引物组：seqidno:8和seqidno:9；用于扩增chr6:118014276位点的引物组：seqidno:8和seqidno:9；用于扩增chr6:118015279位点的引物组：seqidno:10和seqidno:11，用于扩增chr6:118028193位点的引物组：seqidno:14和seqidno:15。
可选地，所述的检测试剂盒的反应体系中包括：dntp、用于pcr反应的dna聚合酶及其缓冲液。
本发明还公开了一种检测上述帕金森病致病基因的pcr方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样品组织dna的提取；
(2)通过权利要求3所述的引物对dna样本进行聚合酶链扩增反应，获取产物；
(3)对所述产物进行核苷酸序列测定，以确定所述生物样本中是否含有nus1基因的突变。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1)本发明提供了一种pd致病基因，通过对一个早发性pd核心家庭进行全基因组外显子组测序及sanger测序分析，发现了一个新的pd致病基因nus1基因的一种新生突变-c.691+2->a，针对该基因编码区序列设计诊断引物，发明检测试剂盒应用于pcr体外扩增基因组dna，结合sanger测序，检测pd致病基因nus1基因的突变，应用于临床基因诊断。
2)本发明提供了一种用于检测pd致病基因的检测试剂盒，通过将样品组织dna提取，再通过设计pcr扩增的致病基因nus1所有外显子及其外显子-内含子交界区序列的引物，提供了一种用于pd致病基因突变的检测试剂盒，该试剂盒检测方便、便捷。
3)本发明为pd的发病机制研究奠定了重要基础，为治疗提供全新的理论依据，应用pd致病基因的检测试剂盒，可为临床确诊疾病提供重要的依据和参考价值，也可用于开展基因诊断和遗传咨询，有利于对该疾病的早期诊断及早期预防治疗，指导优生优育。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明突变序列seqidno.1-5的示意图，即pd患者nus1基因测序的突变序列结果图；其中a表示一个早发性pd核心家庭中发现nus1基因的一种新生突变-c.691+2->a，pcr扩增产物上的chr6:118015345位碱基插入a碱基；b表示1例pd患者的pcr扩增产物上有chr6:118014264位碱基c突变a；c表示2例pd患者的pcr扩增产物上有chr6:118014276位碱基g突变c；d表示1例pd患者的pcr扩增产物上有chr6:118015279位碱基g突变c；e表示1例pd患者的pcr扩增产物上有chr6:118028193位碱基a突变t；其中图示从上至下(a-e)依次为seqidno.1、2、3、4、5。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1
本发明通过全基因组外显子组测序的方法在一个早发性pd核心家庭中发现nus1基因的一种新生突变(denovomutation)-c.691+2->a，该突变位于保守剪切位点，可对基因转录造成潜在影响，具体突变序列如seqidno:1所示。本发明又对另外1852例pd患者和1565例正常对照，进行nus1基因的突变检测，引物序列如表1所示，其中6例pd患者发现携带nus1基因的罕见变异，而无正常对照携带nus1基因的罕见变异。该结果可确定nus1基因是pd的新候选基因。
本发明涉及5个pd相关候选基因(nus1基因)的变异，如图1所示，这5个变异的序列如下：
1、nus1基因chr6:118015345插入a碱基，该突变位于保守剪切位点区域，可影响nus1基因转录版本的剪切，本突变在1例pd患者中发现，其序列如seqidno:1所示。
2、nus1基因chr6:118014264c等位基因突变为a，可导致159位氨基酸由亮氨酸变为异亮氨酸，本突变在1例pd患者中发现，其序列如seqidno:2所示，其突变前基因的核苷酸序列如seqidno:16所示。
3、nus1基因chr6:118014276g等位基因突变为c，可导致163位氨基酸由天冬氨酸变为组氨酸，本突变在2例pd患者中发现，其序列如seqidno:3所示，其突变前基因的核苷酸序列如seqidno:17所示。
4、nus1基因chr6:118015279g等位基因突变为c，可导致209位氨基酸由谷氨酰胺为组氨酸，本突变在1例pd患者中发现，其序列如seqidno:4所示，其突变前基因的核苷酸序列如seqidno:18所示。
5、nus1基因chr6:118028193a等位基因突变为t，该突变位于剪切位点区域，可能影响nus1基因转录版本的剪切，同时该突变位于3’utr区域，可影响microrna与nus1的信使rna结合，本突变在1例pd患者中发现，其序列如seqidno:5所示，其突变前基因的核苷酸序列如seqidno:19所示。
表1nus1基因引物序列
实施例2检测生物样本是否存在所述基因的突变的试剂盒
该试剂盒包括聚合酶链反应试剂，如dntp、用于pcr反应的dna聚合酶及其缓冲液；聚合酶链反应扩增体系中所使用的引物对(如表1所示)，序列如seqidno:6-15所示。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述的引物可以依据已知的核苷酸序列设计，通常为15-30个碱基，gc含量为45-50％左右，在适当的温度下与末端特异性结合，其可利用专门的计算机程序设计，所述的用于pcr反应的dna聚合酶是能够用于pcr扩增的酶。
实施例3nus1基因chr6:118015345插入a碱基突变的检测方法
(1)标本采集与处理。发明人对患者a及其父母(正常人)进行详细的病史、家族史的调查及全面的体格检查和相关辅助检查。在签署知情同意书以后，每人取肘静脉血10ml(枸橼酸钠抗凝)，4℃保存，两周内依照《分子克隆》第二版从血液中提取dna的方法提取dna。
(2)对样本dna目标片段进行pcr体外扩增。设计如下引物；
正向引物；5＇agatgcgtgaaaatttgttagct3＇(seqidno.10)
反向引物；5＇tcatactgtatcctcgtgtgaca3＇(seqidno.11)
反应体系和反应条件如下表2、3所示：
表2pcr反应体系(takarataqtmhotstartversion)
表3pcr反应程序
突变分析结果如下：
(1)对这例pd患者及其父母pcr扩增产物进行dna测序。
(2)测序结果分析：
应用sequenceanalysis软件对测序结果进行分析，将发现的突变序列与基因组序列进行比较，对测序结果进行对比分析。
测序分析显示：
1)该例患者的pcr扩增产物上的chr6:118015345位碱基插入a碱基(seqidno.1)。
2)该例患者父母nus1基因上均未发现上述突变及其他有意义的突变。
实施例4nus1基因其他位点突变的检测方法
1852例pd患者，1565例正常人；基本方法和步骤参见实施例1，在具体方法中针对该突变位点及邻近序列进行pcr扩增，使用的pcr引物序列见(seqidno.6-seqidno.15)。
(1)对这1852例pd患者，1565例正常人pcr扩增产物进行dna测序。
(2)测序结果分析
应用sequenceanalysis软件对测序结果进行分析。将发现的突变序列与基因组序列进行比较，对测序结果进行对比分析。
测序分析显示：
1)1例pd患者的pcr扩增产物上有chr6:118014264位碱基c突变a(seqdidno.2)。
2)2例pd患者的pcr扩增产物上有chr6:118014276位碱基g突变c(seqidno.3)。
3)1例pd患者的pcr扩增产物上有chr6:118015279位碱基g突变c(seqidno.4)。
4)1例pd患者的pcr扩增产物上有chr6:118028193位碱基a突变t(seqidno.5)。
5)1565例正常人nus1基因上均未发现上述突变及其他有意义的突变。
上述1565例正常对照中未发现nus1基因罕见变异，确定上述的突变是pd的重要新候选基因。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110>中国科学院
<120>一种帕金森病致病基因、试剂盒及应用
<130>2018
<160>19
<170>siposequencelisting1.0
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