本发明属于水产养殖水质改良技术领域，具体涉及一种用于养殖水环境氨氮降解的微生物制剂及其应用。
背景技术
随着水产养殖业的发展，池塘逐年老化，养殖水质、底质受到严重污染，导致养殖病害频繁发生，水质改良成为健康养殖的主要措施之一。近年来，水质改良剂的研究也在不断的发展中。传统的水质改良剂利用物理和化学的原理，通过吸附或增加水体溶氧来改善水质，效率较低，无法解决目前高密度养殖模式下的水质净化的要求。
专利号为cn201410517092.0的中国发明专利公开了一种应用于水产养殖环境改良的微生物制剂。该微生物制剂以沼泽红假单胞菌菌株psb20和枯草芽孢杆菌菌株nd04为原料，能够降解水产养殖水环境中的氨氮、亚硝酸，且对饵料残留有机质也具有较好的分解效果，同时还能一定程度上对养殖水体中治病弧菌起到抑制生长的效果。但由于其在兼顾水体中氨氮及亚硝酸盐的降解及维持，对高残饵或其他应激条件下导致的养殖水环境中氨氮骤增情况下应急降解效果相对有限，所以，研制一种能快速缓解氨氮骤增的水环境改良剂是本领域从业人员所迫切需要的。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于养殖水环境且特异性更强的氨氮降解的微生物制剂，可显著降低氨氮及有机质含量，同时具有显著地抑制弧菌的效果。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于养殖水环境氨氮降解的微生物制剂，按质量百分比计，包括26％～50％的沼泽红假单胞菌psb20菌剂和50％～74％的载体；所述沼泽红假单胞菌psb20菌剂由沼泽红假单胞菌psb20菌株培养得到；所述沼泽红假单胞菌psb20菌株的保藏号为cgmccno:9632。
优选的，所述沼泽红假单胞菌psb20菌剂的有效活菌数≥5×108cfu/g。
优选的，所述载体为硅藻土和/或沸石粉。
优选的，所述载体的粉碎细度为120～150目。
优选的，所述沼泽红假单胞菌psb20菌剂的制备方法包括如下步骤：
(1)将psb20菌株菌种接种至基础培养基，在25～35℃，2500～3500lx下光照培养72～144h，得种子液；
(2)将所述种子液按照体积浓度5％～20％的接种量接种至扩繁培养基，30～35℃，2500～3500lx下光照培养3～5d，得菌液；
(3)向所述菌液中添加絮凝剂，絮凝后去上清，得浓稠菌膏；
(4)将所述浓稠菌膏和保护剂混合，得到沼泽红假单胞菌psb20菌剂。
优选的，所述基础培养基包括如下重量份的组分：醋酸钠3～4份、磷酸二氢钾0.4～0.8份、氯化铵0.5～1.5份、硫酸镁0.1～0.5份、氯化钙0.02～0.08份、氯化钠0.5～1.5份、酵母膏0.5～1.5份、硫酸锰0.01～0.03份、硫酸亚铁0.002～0.008份和水1000份。
优选的，所述扩繁培养基包括如下重量份的组分：氯化铵0.5～1.5份、醋酸钠2～5份、氯化镁1～3份、氯化钙0.05～0.15份、磷酸二氢钾0.4～0.8份、磷酸氢二钾0.2～0.6份、酵母膏0.05～0.15份和水1000份。
优选的，所述絮凝剂的添加体积为菌液体积的5～15％，所述絮凝剂为0.4～1.0g/l的硫酸铝钾溶液。
优选的，每1l浓稠菌膏添加保护剂的量为0.1～0.5g；所述保护剂为固体海藻糖。
本发明还提供了上述微生物制剂在养殖水环境氨氮降解中的应用。
有益效果：本发明提供了一种用于养殖水环境氨氮降解的微生物制剂，所述微生物制剂包括26％～50％的psb20菌剂和50％～74％的载体。将本发明提供的微生物制剂应用于水产养殖水环境，氨氮测量值降低87.5％，有机质含量降低64.4％，弧菌总数降低47.8％。
具体实施方式
本发明提供了一种用于养殖水环境氨氮降解的微生物制剂，按质量百分比计，以所述微生物制剂为100％，所述微生物制剂包括26％～50％的沼泽红假单胞菌psb20菌剂和50％～74％的载体。
在本发明中，所述沼泽红假单胞菌psb20菌剂占所述微生物制剂总质量的26％～50％，优选为30％～48％，更优选为40％～45％。本发明对所述沼泽红假单胞菌psb20菌剂的来源不作特别限定，按照本领域常规方法活化扩繁psb20菌株制备得到的沼泽红假单胞菌psb20菌剂均可。所述psb20菌株为沼泽红假单胞菌菌株psb20(rhodopseudomonaspalustris)，于2014年09月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno:9632，涉及所述菌株的专利公开号为cn104498382。
在本发明中，所述沼泽红假单胞菌psb20菌剂制备方法优选包括如下步骤：
(1)将沼泽红假单胞菌psb20菌株菌种接种至基础培养基，在25～35℃，2500～3500lx下光照培养72～144h，得种子液；
(2)将所述种子液按照体积浓度5％～20％的接种量接种至扩繁培养基，30～35℃，2500～3500lx下光照培养3～5d，得菌液；
(3)向所述菌液中添加絮凝剂，絮凝后去上清，得浓稠菌膏；
(4)向所述浓稠菌膏中添加保护剂，得到所述沼泽红假单胞菌psb20菌剂。
本发明先将沼泽红假单胞菌psb20菌株菌种接种至基础培养基中光照培养，得种子液。在本发明中，所述基础培养基可选用本领域常规市售的基础培养基。所述基础培养基优选包括以下重量份的组分：醋酸钠3～4份、磷酸二氢钾0.4～0.8份、氯化铵0.5～1.5份、硫酸镁0.1～0.5份、氯化钙0.02～0.08份、氯化钠0.5～1.5份、酵母膏0.5～1.5份、硫酸锰0.01～0.03份、硫酸亚铁0.002～0.008份和水1000份；更优选包括醋酸钠3.3份、磷酸二氢钾0.6份、氯化铵1份、硫酸镁0.3份、氯化钙0.05份、氯化钠1份、酵母膏1份、硫酸锰0.023份、硫酸亚铁0.005份和水1000份。在本发明中，所述基础培养基的ph值优选为7.5～8.5，更优选为8。所述培养的温度优选为25～35℃，更优选为30℃。所述光照培养的光照强度优选为2500～3500lx，更优选为3000lx。所述光照培养的时间优选为72～144h，更优选为108h。活化培养后得到种子液；所述种子液的od660值为1.4～2.2。
得到种子液后，本发明将所述种子液接种至扩繁培养基中光照培养，得菌液。在本发明中，所述扩繁培养基可选择本领域常规市售的扩繁培养基。所述扩繁培养基优选包括以下重量份的组分：氯化铵0.5～1.5份、醋酸钠2～5份、氯化镁1～3份、氯化钙0.05～0.15份、磷酸二氢钾0.4～0.8份、磷酸氢二钾0.2～0.6份、酵母膏0.05～0.15份和水1000份；更优选包括氯化铵1份、醋酸钠3.5份、氯化镁2.0份、氯化钙0.1份、磷酸二氢钾0.6份、磷酸氢二钾0.4份、酵母膏0.1份和水1000份。在本发明中，所述扩繁培养基的ph值优选为7.0～7.5，更优选为7.2。所述培养的温度优选为30～35℃，更优选为32℃。所述光照培养的光照强度优选为2500～3500lx，更优选为3000～3300lx。所述光照培养的时间优选为3～5d，更优选为4d。在本发明中，所述光照培养优选使用日光光照，当遇阴天或夜晚无法使用日光光照时，本发明优选采用60w/25l的白炽灯进行照射。扩繁培养后得到菌液，所述菌液呈深红色，od660≥1.8。在本发明中，所述扩繁培养优选在透明塑料农膜中进行。
得到菌液后，本发明向所述菌液中添加絮凝剂，絮凝后去上清，得浓稠菌膏。在本发明中，所述絮凝剂的添加体积优选为菌液体积的5～15％，更优选为10％。所述絮凝剂优选为硫酸铝钾溶液。所述硫酸铝钾溶液的浓度优选为0.4～1.0g/l，更优选为0.5g/l。所述絮凝优选在静置环境下进行。所述絮凝的时间优选为6～15h，更优选为8～12h。所述去上清的方法优选为离心，所述离心的转速优选为5000rpm，离心的时间优选为15min。
得到浓稠菌膏后，本发明向所述浓稠菌膏中添加保护剂，得到沼泽红假单胞菌psb20菌剂。在本发明中，每1l浓稠菌膏添加保护剂的量优选为0.1～0.5g，更优选为0.8g。所述保护剂优选为固体海藻糖。本发明对所述保护剂的来源不作特别限定，本领域常规市售产品均可。
在本发明中，所述沼泽红假单胞菌psb20菌剂的有效活菌数优选≥5×108cfu/g，更优选≥5×109cfu/g。所述沼泽红假单胞菌psb20菌剂在本发明中的作用是降解水产养殖水环境中的氨氮，分解饵料残留有机物，抑制弧菌生长。
本发明提供的微生物制剂还包括载体。所述载体占所述微生物制剂总质量的50％～74％，优选为55％～70％，更优选为55％～60％。所述载体的粉碎细度优选为120～150目，更优选为130～140目。所述载体优选为硅藻土和/或沸石粉。当所述载体为硅藻土和沸石粉的混合物时，硅藻土和沸石粉的质量比优选为1∶2～2∶1，更优选为1.3∶1.6～1.7∶1.4。
在本发明中，上述微生物制剂的制备方法优选包括以下步骤：将所述psb20菌剂和所述载体混合后干燥制得。在本发明中，所述干燥的温度优选为30～40℃，更优选为35℃。所述干燥后，本发明优选将制得的微生物制剂置于低温条件下保存。所述保存的温度优选为2～10℃，更优选为4℃。
本发明还提供了上述微生物制剂在水环境氨氮降解中的应用。将所述微生物制剂兑水稀释后全池泼洒。每立方米水体使用微生物制剂的量优选为1～5g，更优选为2g。所述兑水倍数优选为5～15倍，更优选为10倍。所述泼洒间隔优选为3～10天，更优选为7天。
下面结合实施例对本发明提供的一种应用于养殖水环境氨氮降解的微生物制剂进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
(1)菌株psb20的培养：
取菌株psb20并将其接种至基础培养基(醋酸钠3.3g、磷酸二氢钾0.6g、氯化铵1.0g、硫酸镁0.3g、氯化钙0.05g、氯化钠1.0g、酵母膏1.0g、硫酸锰0.023g、硫酸亚铁0.005g、水1000ml，ph7.5～8.5)中，27℃，2500lx下光照培养72h，当培养液的od660达1.5时即制得种子液。
按体积比10％的接种量将种子液接种至透明塑料农膜(内含扩繁培养基：氯化铵1.0g、醋酸钠3.5g、氯化镁2.0g、氯化钙0.1g、磷酸二氢钾0.6g、磷酸氢二钾0.4g、酵母膏0.1g、水1000ml、ph7.2)，30～35℃(温度过高时则采用喷水降温)，并利用太阳光光照培养3天(阴天及夜晚时采用60w/25l白炽灯照射)，当菌液呈现深红则培养完成。
(2)菌株psb20的浓缩及固化：往菌株psb20培养好获得的菌液中添加浓度为0.5g/l的硫酸铝钾溶液，静置过夜絮凝，去上清；添加固体海藻糖，得到沼泽红假单胞菌psb20菌剂。其中，硫酸铝钾溶液的添加量为菌株psb20培养好获得的菌液体积的5％；固体海藻糖的添加量为：每1l经絮凝后得到的浓稠菌膏中添加固体海藻糖0.1g。
(3)制备微生物制剂：向添加了固体海藻糖的菌液中加入硅藻土(粉碎细度120目)，然后于30℃下风干，分装保存于4℃备用；硅藻土的添加量为：每1l经絮凝后得到的浓稠菌膏中添加硅藻土1000g。
实施例2
对实施例1所制备得到的产品成分进行测定：用生理盐水对实施例1制备的产品进行梯度稀释后，采用双层平板法对各稀释液涂布后于35℃培养，技术结果显示实施例1所制备的产品中psb20活菌数为5.82×109cfu/ml。
实施例3
取实施例1制备所得的微生物制剂，在养殖南美白对虾虾塘使用：
设计一组对照组，一组实验组；实验组中每立方米水体每次使用4g实施例1制备所得微生物制剂，使用时兑水稀释10倍后进行全池泼洒，且每周使用一次；对照组为空白对照，即不使用实施例1制备所得微生物制剂；一个月后取虾塘水样检测其氨氮、弧菌总数及有机质含量。
试验结果：对照组氨氮测量值为0.8mg/l、弧菌总数为790cfu/ml、有机质含量为1.6％；而实验组的氨氮测量值为0.1mg/l、弧菌总数为412cfu/ml、有机质含量为0.57％。说明使用本发明提供的微生物制剂对虾塘进行全池泼洒，氨氮、有机质及弧菌的含量均有明显下降。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。