本发明属于功能酶筛选及应用
技术领域：
，具体涉及一种脂类水解酶及其在epa/dha甘油酯合成中的应用。
背景技术：
脂类水解酶(lipolyticenzymes，ec3.1.1.x)是α/β水解酶家族的一员，可催化酯键的水解和合成，并广泛存在于动物、植物和微生物中。脂类水解酶在水相中可催化水解反应的进行，在有机体系中可催化转酯、酯合、酯交换和氨解等多种反应的进行。脂类水解酶作用高效，反应条件温和，并且反应过程中不需要辅酶的添加。不仅如此，脂类水解酶还具有高的化学、区域和立体选择性，它已成为工业生产的重要催化剂，如食品加工、洗涤剂、医药、精细化工等行业。工业化对脂类水解酶需求的日益增长，也促进了筛选方法的不断完善和发展。其中全基因组测序法是通过对已证明有脂类水解酶活力的菌株进行全基因组测序，并从里面找到丰富的脂类水解酶片段。通过分子克隆的手段对其基因组里面的相关基因蛋白进行异源表达，进一步对脂类水解酶进行详细的分析可以获得良好性状的脂类水解酶。所以，全基因组测序法成为获得优良性状酶催化剂的一种高效手段。二十碳五烯酸(epa，eicosapentaenoicacid)和二十二碳六烯酸(dha，docosahexaenoicacid)是广泛存在于海洋鱼油中的多不饱和脂肪酸，是人体生长发育和代谢过程中重要的生理活性物质，具有防治心血管疾病、治疗糖尿病、抑制肿瘤细胞、抗炎和减肥等功效。epa/dha的主要存在形式有游离型、乙酰型、磷脂型和甘油酯型四大类，其中甘油酯型是鱼油中epa/dha的主要存在形式。与游离型、乙酰型相比，甘油酯型epa/dha不易被氧化，消化利用率高，食用不存在安全性问题。与磷脂型相比，甘油酯型epa/dha来源更为广泛，同时甘油酯型epa/dha还存在单甘酯、二甘酯及三甘酯等生理活性各异的构型，因此获得特定构型的epa/dha甘油酯已成为目前研究的热点，而获得特定构型epa/dha甘油酯的前提是，能够筛选得到具有特异性催化活性的脂类水解酶，通过脂类水解酶催化的转酯或者酯合反应，合成具有特定构型的epa/dha甘油酯。因此通过高效的全基因组测序分析法，获得具有高效催化活性和高度特异性催化能力的脂类水解酶，对于合成特定构型的epa/dha甘油酯，及其后续活性研究及产品开发具有重要意义。技术实现要素：本发明的目的是提供一种新型脂类水解酶e7，以及利用该脂类水解酶的特异性转酯活性催化合成epa/dha单甘酯的方法。本发明首先提供一种脂类水解酶，该酶包含有：1)氨基酸序列为seqidno:1的酶；2)在1)中取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，由1)所衍生的，具有1)中脂类水解酶功能的酶；3)编码上述脂类水解酶的基因，其核苷酸序列为seqidno:2；4)本发明同时提供一种重组表达载体，该重组表达载体携带有编码上述脂类水解酶的基因；5)本发明还提供重组宿主，用于重组表达上述的脂类水解酶；6)本发明的脂类水解酶用于制备催化合成epa/dha单甘酯。其一种具体制备方法，是使用脂类水解酶e7酶粉催化乙酯型epa/dha与甘油发生转酯反应来制备epa/dha单甘酯。本发明的有益效果：本发明的脂类水解酶e7具有在非水相催化合成反应的能力，可催化乙酯型epa/dha与甘油反应合成epa/dha单甘酯，在催化合成48h后，可特异性地催化epa/dha乙酯转化成epa/dha单甘酯，体现了该脂类水解酶在合成epa/dha单甘酯制备上的潜能。附图说明图1：本发明的脂类水解酶e7进化树分析及多重序列比对示意图。图2：本发明的脂类水解酶e7的sds-page电泳图；泳道0为蛋白marker，泳道1为表达后菌体破碎液上清，泳道2为表达后菌体破碎液沉淀，泳道3为纯化后的脂类水解酶e7。图3：脂类水解酶e7酶学性质研究；a是e7的最适温度，b是e7的最适ph，c是表面活性剂对脂类水解酶e7活力的影响。图4：脂类水解酶e7催化合成epa/dha单甘脂的tlc层析图。具体实施方式本发明用到了分子生物学和酶催化领域使用的常规技术和方法，下面将结合实施例和附图对该发明进行详细的描述，但保护范围并不仅限于此。实施例1：全基因组测序的脂类水解酶片段的克隆表达对本实验筛选出来的寡养单胞菌进行全基因组测序后，通过序列预测分析，我们从中找到了一些具有假定脂类水解酶活性的目的片段。挑选部分脂类水解酶片段(e7,e3,e4,e5,e6,l2,l4,l5,l6,l7)进行异源表达，载体使用pet-28a(+)，宿主采用bl21(de3)。对上述脂类水解酶工程菌进行诱导发酵，发酵结束后，50ml发酵液离心去除上清，菌体先利用0.9％nacl溶液进行冲洗，后使用6mltris-hcl缓冲液(100mm，ph7.5)进行复溶，并于冰浴下进行超声破碎。破碎液上清用于长链底物特异性功能的验证，以pnpb为底物进行酶活检测。实施例2：脂类水解酶e7基因序列分析脂类水解酶e7的家族分类，使用文献已报道的方法来进行，使用mega6.0软件构建e7与其他家族脂类水解酶的进化树，clustalx软件用于对脂类水解酶进行多序列比对，espript3.0(http://espript.ibcp.fr/espript/espript/)用于比对序列的输出。如图1a所示，e7属于脂类水解酶第ⅱ家族，并具有典型的催化三联体ser(39位)，asp(193位)，his(294位)(图1b)。该酶与genbank中已报道蛋白的氨基酸相似度为79％(stenotrophomonassp.)。实施例3：脂类水解酶e7的纯化重新对脂类水解酶e7进行诱导发酵，发酵结束后，通过离心收集菌体，并使用灭菌生理盐水清洗菌体一次。清洗结束后，使用含有100mm咪唑的tris-hcl缓冲液(ph8.0，100mm)复溶菌体，并置于超声波细胞粉碎机上进行超声破碎，破碎液上清用于脂类水解酶e7的纯化。该纯化过程采用镍柱(1ml，qiagen，hilden，germany)来进行，蛋白的梯度洗脱使用含有不同浓度咪唑(20mm-500mm)的tris-hcl缓冲液(ph8.0，100mm)。洗脱后的溶液分别进行收集，并使用超滤浓缩管(～10kda)进行浓缩脱盐，并进行蛋白电泳分析及脂肪酶/脂类水解酶酶活检测。上述脂类水解酶e7的蛋白凝胶电泳结果如图2所示，条带0是蛋白marker，条带1是菌体破碎液上清，条带2是菌体破碎液沉淀，条带3是纯化后的脂类水解酶e7。实施例4：脂类水解酶e7酶学性质研究经实施例3纯化后的脂类水解酶e7，用作酶学性质研究。(1)脂类水解酶e7最适温度脂类水解酶e7的最适温度，通过在不同温度(30，35，40，45，50，55，60，70，75℃)下孵育反应，并检测吸光值a405来确定。最适温度下的活性定义为100％，其他温度下的活性以对最高活性的百分比表示。由结果(图3a)可以看出，温度<65℃时，随着温度的升高，脂类水解酶活性逐渐升高，温度>65℃后，随着温度升高，脂类水解酶活性逐渐降低，e7的最适温度为65℃。(2)脂类水解酶e7最适phph对脂类水解酶e7活性的影响，使用不同ph的不同缓冲液来检测。该过程使用的缓冲液包括：100mm柠檬酸缓冲液(ph4.0-6.0)，100mm磷酸钠缓冲液(ph6.0-8.0)，100mmtris-hcl缓冲液(ph8.0-9.0)和100mmna2co3-nahco3缓冲液(ph9.0-10.0)。最适ph下的活性定义为100％，其他ph下的活性以百分比来表示。结果(图3b)显示，e7在ph为9的na2co3-nahco3缓冲液中显示出最高的水解活性，并且较之酸性条件，e7在碱性条件下显示出更高的水解活性，说明e7属于一个典型的碱性脂类水解酶。(3)表面活性剂对脂类水解酶e7活性的影响为了检测表面活性剂对脂类水解酶e7的影响，我们通过向反应液中添加不同的表面活性剂(终浓度0.5％)来测定，其中使用的试剂包括：sds，tritonx-100，tween20，tween60和tween80。反应液中未添加表面活性剂时测得的活性定义为100％，添加了表面活性剂的以百分比表示。结果如图3c所示，通过与未添加表面活性剂的样品对比，发现tritonx-100对脂类水解酶酶活的提高具有轻微促进作用，提高了8.7％，sds则对e7的活性具有显著的抑制效果。(4)金属离子对酶活的影响金属离子对脂类水解酶e7活性的影响，通过向反应体系中添加终浓度为1mm和10mm的金属离子(cocl2，kcl，licl，fecl3，cacl2，mgcl2，cuso4，zncl2和nicl2)以及na2-edta来测定。未添加金属离子和na2-edta的作为对照，其活性定义为100％，结果如表1所示。外部添加金属离子，并未对e7水解活性的提高起到显著的促进作用，在1mm金属离子的添加量下，ca2+和k+对酶活的提高有一定的促进作用，酶活分别提高到121.1％和151％，其他金属离子和na2-edta则对e7的酶活有抑制作用。在10mm金属离子和na2-edta的添加量下，脂类水解酶e7的水解活性都受到了不同程度的抑制，其中zn2+对酶活的抑制效果最强，活性仅为对照组的23.2％。表1金属离子对e7活性的影响(5)有机溶剂对酶活的影响有机溶剂对脂类水解酶e7活性的影响，通过向反应体系中添加终浓度为25％、50％和100％的有机溶剂来进行检测，选择的有机溶剂包括：甲醇、乙醇、乙腈、正己烷、氯仿、二甲亚砜、丙酮、正丙醇、异丙醇、异辛烷和环己烷。测定前，将酶液与有机溶剂混合后置于30℃下震荡孵育3h，残余的脂类水解酶酶活用比色法进行测定。对于疏水性有机溶剂，孵育后的混合液通过离心去除有机溶剂后，剩余的酶液水相进行酶活测定；对于亲水性有机溶剂，孵育后的混合液用缓冲液进行稀释，至有机溶剂的浓度为5％后进行测定，消除有机溶剂对酶活测定的影响。如表2所示，e7在低浓度(25％)的亲水有机溶剂中保持了较好的活性，并且随着浓度提高到50％，酶活呈现明显的下降趋势，但当亲水有机溶剂的浓度提高到100％后，e7在部分亲水有机溶剂中的活性较之50％下的活性，有了明显提高，比如e7在50％乙腈中残留的活性为65％，在100％乙腈中的活性为117％。e7在疏水性有机溶剂中活性要比亲水性中的提高的多。其中，e7在无水正己烷中活性较高，经孵育后，残留活性仍可达到130.6％，这暗示了e7在正己烷中进行非水相催化的潜力。表2e7在不同有机溶剂中的耐受性实施例5：脂类水解酶e7催化合成epa/dha甘油酯重新发酵脂类水解酶e7，离心收集后的大肠杆菌，使用生理盐水除去杂蛋白，进行冷冻干燥，制得的e7酶粉用于epa/dha单甘酯合成的研究。反应体系如下：epa/dha乙酯:甘油摩尔比3:2；5ml正己烷，1700u脂类水解酶e7(以对pnpb的水解活性定义)。将反应混合液置于50℃水浴摇床中震荡反应，tlc法检测生成的epa/dha单甘酯含量。tlc结果如图4所示，在tlc图谱上,1为生成的epa/dha单甘酯(mag)；同时通过高效液相色谱检测生成的epa/dha单甘酯的含量为7g/l，结果表明筛选得到的脂类水解酶e7在制备epa/dha单甘酯方面具有较高开发应用潜力。实施例6：脂类水解酶e7突变体利用含有脂类水解酶e7的基因载体pet-28a(+)为模版，通过重叠延伸pcr的方法获得突变体e7’，突变位点为15和第16位氨基酸aa变为ff(序列如序列表seqidno:3所示)。重新构建表达载体，宿主采用bl21(de3)，进行异源表达。发酵脂类水解酶e7’，离心收集后的大肠杆菌，使用生理盐水除去杂蛋白，进行冷冻干燥，制得的e7’酶粉用于epa/dha单甘酯合成的研究。反应体系如下：epa/dha乙酯:甘油摩尔比3:2；5ml正己烷，1700u脂类水解酶e7(以对pnpb的水解活性定义)。将反应混合液置于50℃水浴摇床中震荡反应，tlc法检测生成的epa/dha单甘酯含量。通过高效液相色谱检测生成的epa/dha单甘酯的含量为15g/l，结果表明筛选得到的脂类水解酶e7’在制备epa/dha单甘酯方面具有较高开发应用潜力,实验效果远远大于脂类水解酶e7。取对数生长期的黑色素瘤b16细胞，将细胞悬液调整至细胞浓度为2×10个·ml后，接种于96孔培养板，每孔180μl。实验设置空白对照组、阴性对照组和实验组。种板时，空白对照组只加细胞培养液、其他组都加细胞悬液。在5％co2、37℃孵育24h，待细胞贴壁后，分别加入20μl脂类水解酶e7’溶液，设3个重复，使终浓度为加入时的1/10，培养72h。弃培养基，用磷酸缓冲液(pbs)润洗2次，每孔加入1％tritonx-100溶液100μl，迅速放入-80℃低温冰箱冻存30min。室温下融化使得细胞完全破裂。37℃预温后加入1％左旋多巴溶液(用pbs稀释,使其ph<7)20μl，37℃反应2h后,测定490nm处吸光度值。以终浓度为200μg·ml的熊果苷为阳性对照，培养液为阴性和空白对照。酪氨酸酶活性抑制率＝[(阴性对照组平均吸光度值-实验组平均吸光度值)/(阴性对照组平均吸光度值-空白对照组平均吸光度值)]×100结果见表1所示：表1组别药品浓度ug.ml抑制率％空白对照00熊果苷对照组20051.1脂类水解酶e7’20062.1由表1可以看出，脂类水解酶e7’对于酪氨酸酶活性抑制率高于熊果苷对照组，证明其具有降低酪氨酸酶活性，美白皮肤的功效。序列表<110>中国海洋大学<120>一种脂类水解酶及其在epa/dha甘油酯合成中的应用<141>2018-08-10<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>2<211>617<212>prt<213>寡养单胞菌(stenotrophomonas)<400>2metleuleuserlysargproileargserleumetalaalaalaile151015alaleualaalavalproalametalaglygluserprotyrserarg202530alavalphepheglyaspserleuthraspalaglytyrpheargpro354045leuleuaspproglyvalargprovalthrglyglnphethrthrasn505560proglyleuvaltrpserglnglnleualaasntyrtyrglyleuasp65707580glythrproasnglyasnglyglnasnglyaspasntyralavalgly859095glyalaargvalservalaspglualaglyglyleuglyalailepro100105110serleulysserglnalaalaargtyrleualaalaasnglyglylys115120125alaaspalaasnalaleutyrthrvaltrpglyglyalaasnaspleu130135140phealaalathrargalaalaalaglyglyalaserglnalaglnval145150155160glnglyileileglyalaalavalthraspglnilealaleuvalgly165170175alaleulysglnalaglyalaglntyrvalleuvalproasnleupro180185190aspvalglyilethrproglnpheargglyproasnalaalaalaala195200205thralaleuseralaglytyrasnlysalaleutyrglyglyleulys210215220glnalaglyileglupheileproleuaspthrpheserileleuarg225230235240gluvalthralaasnproalamettyrglyphethrasnvalthrser245250255thralacyslysileaspproasnasnserthralaserileilegly260265270cysasnprothrsertyrvalserproaspalaalaasnthrtyrleu275280285phealaaspglyvalhisprothrthralaglyhisglnleuleugly290295300glntyralavalservalleugluglyproargleuglnglnvalleu305310315320serhisseralaglnthrileglyargserargalaaspglnvalser325330335methisleuglyglyargproalaaspglyleusertrptrpglygly340345350valargglyaspleuglnargtyrasphisalaaspleutyraspgly355360365leualaproalaglyleupheglyileasptrpalaargaspglymet370375380valpheglyglyphealaglypheglyargleuasnalaaspphegly385390395400asnserargglyaspphethrglnlysaspthrthralaglyleuphe405410415alaglytrptyrhisaspargiletrpvalasnglyglnvalsertyr420425430thrtrpleusertyraspvalasnarglysvalglnleuglyproala435440445thrarggluhisglyglyserproaspglyserasnleuthralaala450455460leuasnalaglytyrglupheglythrgluglyglyphearghisgly465470475480proilealaservaliletrpglnlysvallysileaspglytyrthr485490495gluseralaalaalaglythrleualathralaleuglytyrasparg500505510glnasnvalaspserthrvalglyargileglytrpglnalaargphe515520525aspglyglythrvallysprotyralaglnleuthrtyrasphisglu530535540phegluaspthrlysglnalaseralatrpleuglnthrleuproglu545550555560leuglysertyrargvalproglyleuasnpheasplysasntyrala565570575thrvalvalleuglyalaargthrgluleupheglyleuglnserasn580585590pheglyleuseralaseralaglyglnlysargalaglnaspalathr595600605leuphealaasnpheserglyserphe610615<210>3<211>1854<212>dna<213>寡养单胞菌(stenotrophomonas)<400>3atgctgctcagcaaacgcccgatccgctccctgatggcggccgcgatcgcgctggccgcg60gtaccggccatggcaggcgaatccccgtattccagagccgtgttcttcggtgacagcctc120accgatgccggctatttccgcccgctgctggatccgggcgtgcggccggtcaccggccag180ttcaccaccaacccgggcttggtgtggtcgcaacagttggccaattactacggcctcgat240ggcacgcccaacggtaatggccagaatggcgacaactacgccgttggcggcgcccgtgta300tcggtcgacgaagcgggtggcctgggagccattccgtcgctgaagtcgcaggccgcccgt360taccttgccgcaaatggcggcaaggctgacgccaatgccctgtacaccgtctggggcggt420gccaatgacctgttcgcggccacgcgcgcagcggccggcggtgcatcgcaggcccaggtg480cagggcatcatcggggcagcagtcaccgaccagatcgccctggtgggcgcactgaagcag540gccggggcacagtatgtgctggtgccgaatctgccggacgtgggcatcactccgcagttc600cgcggccccaacgccgctgccgccaccgcgctgtcggccggctacaacaaggccctgtac660ggtggcctgaagcaggcgggcatcgagttcattccgctcgacaccttcagcatcctgcgc720gaggtgaccgccaatccggccatgtatggcttcaccaacgtcaccagcacggcctgcaag780atcgatccgaacaattccactgcgagcatcatcggctgcaacccgaccagctacgtcagc840ccggatgcggccaacacctacctgttcgccgacggcgtgcatccgaccaccgccggccat900cagctgctgggccagtacgcggtctcggtgctggaaggcccgcgtctgcagcaggtgctg960agccactcggcacagaccatcggccgctcgcgtgccgaccaggtcagcatgcacttgggt1020ggtcgcccggccgacggcctgtcctggtggggcggcgtgcgtggtgacctgcagcgctat1080gaccatgccgacctgtacgacggcctggcgccggccggcctgttcggtatcgactgggcg1140cgcgacggcatggtgttcggcggcttcgccggcttcggccgcctcaatgccgacttcggc1200aacagccgtggcgacttcacccagaaggacaccaccgccggtctgttcgcgggctggtac1260cacgaccgcatctgggtcaatggccaggtcagctacacctggttgtcctatgacgtgaac1320cgcaaggtccagctgggtccggccacccgcgagcacggtggttcgccggacggcagcaac1380ctgactgctgccctgaacgccggttacgagttcggcaccgaaggcggcttccgccacggc1440ccgattgcttcggtgatctggcagaaggtgaagatcgacggttacaccgaaagcgctgcg1500gccggcaccctggccaccgcactgggttacgaccgccagaacgttgattcgaccgtcggt1560cgcatcggctggcaggcccgcttcgatggcggcaccgtcaagccgtacgcgcagttgacc1620tacgaccacgagttcgaagacaccaagcaggccagtgcctggctgcagaccctgccggaa1680ctgggcagctatcgcgtgcccggcctgaacttcgacaagaactacgccaccgtggtgctg1740ggtgcccgtaccgagctgttcggcctgcagagcaacttcggcctgagcgcttcggccggg1800cagaagcgtgcccaggacgcgacgctgttcgccaacttcagcggcagcttctaa1854<210>1<211>617<212>prt<213>寡养单胞菌(stenotrophomonas)<400>1metleuleuserlysargproileargserleumetalapheph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