本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种ω-转氨酶突变体及其应用。
背景技术
手性胺类化合物是具有重要价值的医药及精细化工中间体。目前，超过70％的药物，如神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等都是以手性胺作为中间体来合成的。
来自于土曲霉(aspergillusterreus)的ω-转氨酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，可以高效生产手性胺，催化氨基供体上的氨基转移到前手性的受体酮，得到手性胺和副产物酮，反应过程需要磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate，plp)的参与，催化过程如下所示：
研究表明，该酶野生型在40℃下的半衰期仅为6.9min，其热稳定性有待进一步提高。
目前，酶稳定性改造的方法有三种，分别是：非理性设计，理性设计和半理性设计三个方面。其中，基于序列的半理性设计是通过对天然蛋白质序列进行统计学分析，得到的结果用于指导鉴定可能的靶标位点。较常用的方法是对蛋白质进行一致性突变。一致性突变方法认为在同源蛋白质中某一个氨基酸位置，一致的氨基酸比不一致的氨基酸对蛋白质稳定性的平均贡献要高，因此用一致的氨基酸取代不一致的氨基酸，可以提升酶的稳定性。
申请公布号为cn107058256a的发明专利申请文献公开了一种ω-转氨酶突变体，该突变体获得的方法是利用ncbi数据库和blast软件比对筛选获得与ω-转氨酶同源的氨基酸序列，通过weblogo程序得到序列一致性结果，并结合ω-转氨酶的序列确定需要突变的氨基酸残基位点，通过定点突变技术进行实验验证。
根据上述方法，该发明分别提供了第77位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸，或第97位氨基酸由谷氨酰胺突变为谷氨酸，或第210位氨基酸由组氨酸突变为天冬酰胺，或第245位氨基酸由天冬酰胺突变为天冬氨酸，或第292位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸，或者第295位氨基酸由异亮氨酸突变为缬氨酸的突变体。
此外，二硫键(disulfidebond)是2个巯基被氧化所形成的-s-s-形式的硫原子间的共价键。在蛋白质中，两个半胱氨酸形成二硫键，能够固定蛋白质的三级结构，降低蛋白质解折叠熵，提高蛋白质稳定性。
申请公布号为cn105950581a的发明专利申请文献公开了一种引入二硫键的ω-转氨酶突变体，该突变体是由土曲霉(aspergillusterreus)ω-转氨酶131位的精氨酸和134位的天冬氨酸分别突变为半胱氨酸获得。该突变体的半失活温度比野生型提高了1.6℃；在40℃下的半衰期为10.4min，比野生型延长了3.5min，较野生型提高了50.7％，热稳定性大大提高。
虽然，上述突变体与野生型ω-转氨酶相比能够提高半失活温度以及延长半衰期；但是，若要在实际生产中更好地加以应用，上述突变体的半失活温度和半衰期仍有待进一步提高。
技术实现要素：
本发明通过组合序列一致性突变和引入二硫键的两种不同理性设计方法，实现了ω-转氨酶热稳定性的进一步提高，获得了一个具有极佳热稳定性的ω-转氨酶突变体。
首先，本发明利用序列一致性突变筛选热稳定高的ω-转氨酶突变体，具体方法如下：
(1)利用ncbi数据库和blast软件比对筛选获得与ω-转氨酶同源的氨基酸序列；
(2)利用weblogo程序(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)得到序列一致性结果，并结合ω-转氨酶的序列确定需要突变的氨基酸残基位点；
(3)根据氨基酸残基位点设计定点突变引物，以ω-转氨酶基因为模板，进行定点pcr扩增，纯化后，转化至宿主细胞，获得定点突变文库；
(4)从所述定点突变文库中筛选ω-转氨酶突变体，通过实验确定热稳定性提高的ω-转氨酶突变体(h210n/i77l)。
与此同时，根据ω-转氨酶的三维结构模型并分析蛋白质结构中b-factor数据，结合键长、键角、能量等生物信息学特征，使用生物信息学计算软件disulfidebydesign(dbd，http://cptweb.cpt.wayne.edu/dbd2)以及disulfidebondsinproteins(modip，http://caps.ncbs.res.in/dsdbase/modip.html)对该酶进行引入二硫键的理性设计，选出二硫键潜在的引入位点；在ω-转氨酶突变体h210n/i77l的基础上引入一对额外的二硫键(m150c-m280c)，获得ω-转氨酶突变体(h210n/i77l/m150c/m280c)。
所述ω-转氨酶突变体(h210n/i77l/m150c/m280c)的氨基酸序列如seqidno.2所示。
本发明又提供了编码所述ω-转氨酶突变体的基因。
所述的基因，核苷酸序列如seqidno.1所示。
ω-转氨酶突变体(h210n/i77l/m150c/m280c)是指ω-转氨酶(来自土曲霉(aspergillusterreus)，核苷酸序列如seqidno.3所示，氨基酸序列如seqidno.4所示)的第77位的氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸、第150位的氨基酸由甲硫氨酸突变为半胱氨酸、第210位的氨基酸由组氨酸突变为天冬酰胺以及第280为的氨基酸由甲硫氨酸突变为半胱氨酸。
本发明还提供了包含所述基因的表达单元。
本发明还提供了包含所述基因的重组载体。重组载体的启动子可以为常用的t7启动子、iac启动子或arabad启动子，在这些启动子的作用下，ω-转氨酶突变体可以直接在大肠杆菌宿主细胞中实现胞内可溶表达。重组载体所选用的原始载体可以是常用的用于蛋白表达的载体，比如pet28a。
本发明还提供了包含所述基因的基因工程菌。
本发明还提供了包含所述重组载体的基因工程菌。
可以将目的基因片段整合到基因工程菌的基因组上以获得稳定表达所述ω-转氨酶突变体蛋白的重组基因工程菌，也可以是通过质粒的形式存在。可以选择常用的用于蛋白表达的基因工程菌，优选为e.colibl21(de3)。
本发明还提供了所述ω-转氨酶突变体在催化(r)-(+)-α-甲基苄胺生成苯乙酮中的应用。手性选择性为(r)型。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明ω-转氨酶突变体由土曲霉(aspergillusterreus)ω-转氨酶77位的异亮氨酸、150位的甲硫氨酸、210位的组氨酸和280位的甲硫氨酸分别突变为亮氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和半胱氨酸获得，该ω-转氨酶突变体的半失活温度(t5010)为50.3±0.5℃，比野生型提高了11.8℃，在40℃下的半衰期(t1/2)为114.6±2.8min，是野生型的16.6倍，热稳定性显著提高。
(2)本发明利用ncbi数据库和blast软件比对筛选获得与ω-转氨酶同源的氨基酸序列，通过weblogo程序得到序列一致性结果，并结合ω-转氨酶的序列确定需要突变的氨基酸残基位点，通过定点突变技术进行实验验证，找到序列一致性突变中热稳定提高最多的突变酶，并在此基础上引入一对额外的二硫键(m150c-m280c)，获得的ω-转氨酶突变体(h210n/i77l/m150c/m280c)；该方法可有效地提高正突变概率，提高实验效率及可行性，并筛选得到热力学稳定性明显优于野生酶的突变酶。
附图说明
图1为质粒pet28a(+)-ω-at的基因图谱。
图2为ω-转氨酶序列一致性分析结果图。
图3为突变体在ω-转氨酶三级结构中的位置图(以球表示)及其序列一致性分析结果图。
图4为实施例1中不同突变体酶和野生型酶的半失活温度t5010结果。
图5为实施例1中不同突变体酶和野生型酶的半衰期t1/2结果。
图6为实施例1中不同突变体酶和野生型酶的最适温度结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例所描述的具体物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书的保护范围。
实施例中未注明的实验方法，如感受态细胞制备、转化以及lb培养基配制等参照《分子克隆实验指南》第三版(j.萨姆布鲁克、d.w.拉塞尔著，黄培堂译，科学出版社，2002)中的方法进行。
下列实施例中涉及的实验材料如下：
(1)lb培养基：10g/l胰蛋白胨(购于oxoid)，5g/l酵母粉(购于oxoid),10g/l氯化钠(购于生工生物工程有限公司(上海))，ph7.0。lb固体培养基：lb液体培养基加入2％(质量比)琼脂粉。
(2)dpni酶购于thermoscientific公司，primestarmaxdna聚合酶、限制性内切酶ndei、hindш、t4dna连接酶购于takara公司(宝生物工程大连有限公司，中国)。
引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成(中国)。质粒提取试剂盒、dna琼脂糖凝胶回收试剂盒、pcr产物纯化试剂盒以及sds-page凝胶制备试剂盒购于康为世纪生物科技有限公司公司(中国)。
氯化钠、甘油、氯化钙、咪唑、冰醋酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、5-磷酸吡哆醛、考马斯亮蓝蛋白质浓度测定试剂盒、ni-nta层析介质、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)、硫酸卡那霉素、dna和蛋白质marker购于生工生物工程有限公司(上海)。
(3)缓冲液配方：
20mmol/l洗脱缓冲液：50mmol/l磷酸二氢钠，300mmol/l氯化钠，20mmol/l咪唑，ph8.0；50mmol/l洗脱缓冲液：50mmol/l磷酸二氢钠，300mmol/l氯化钠，50mmol/l咪唑，ph8.0；100mmol/l洗脱缓冲液：50mmol/l磷酸二氢钠，300mmol/l氯化钠，100mmol/l咪唑，ph8.0；250mmol/l洗脱缓冲液：50mmol/l磷酸二氢钠，300mmol/l氯化钠，250mmol/l咪唑，ph8.0。
凝胶染色液：甲醇45.4ml，冰醋酸9.2ml，0.05g考马斯亮蓝r250，溶解于100ml去离子水；凝胶脱色液：甲醇5ml，冰醋酸7.5ml，溶解于100ml去离子水；电泳缓冲液：3.03gtris，14.4g甘氨酸，1gsds，用去离子水定容至1l，0.22μm的滤纸抽滤后4℃冷藏。
实施例1
1.序列一致性分析
根据ncbi数据库中aspergillusterreus的ω-转氨酶基因序列(genbank:xm_001209325)以及密码子使用数据(http://www.kazusa.or.jp/codon/)中的escherichiacoli密码子使用频率分布表，分析ω-转氨酶的密码子使用情况。密码子优化的ω-转氨酶基因(ω-opt-ta基因)，其核苷酸序列如seqidno.3所示，其编码的蛋白质共325个氨基酸，氨基酸序列如seqidno.4所示。
通过blast比对，设置e-value最大值为10-3，序列冗余度不超过0.9，共筛选获得同源的氨基酸序列91条。依据序列一致性进行突变位点的筛选，筛选的原则是突变的保守性阈值为0.6，即在多序列比对中该位点氨基酸类型所占的比例达到60％以上，利用weblogo程序(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)得到序列一致性分析结果(如图2)，共筛选出6个突变位点：h210n、q97e、g292d、n245d、i295v和i77l(本实施例仅列举h210n、i77l和两个位点组合后的实验结果)。
2.二硫键位点的选择
将氨基酸序列如seqidno.4所示的ω-转氨酶的pdb文件(pdbid：4ce5)分别上传至dbdv2.12软件(http://cptweb.cpt.wayne.edu/dbd2)和modip软件(http://caps.ncbs.res.in/dsdbase/modip.html)中进行预测易于形成二硫键的位点，modip软件预测了153个可以引入二硫键的位点，并基于形成二硫键的可能性大小，使用a、b、c、d进行排序。dbdv2.12软件充分考虑了蛋白质中形成二硫键的各种因素，包括两个半胱氨酸的c-s键旋转角度χ1，s-s键旋转角度χss，cα之间的距离rα,cβ之间的距离rβ的平均范围等，预测出43个易于形成二硫键的位点。
为了获得小型且有效的突变库，我们选择modip软件预测的a等级的二硫键位点与dbdv2.12软件预测的二硫键位点的重叠点，作为本发明引入二硫键的位点，将其突变为半胱氨酸；选取m150c-m280c位点作为引入二硫键的位点。
3.组合突变
在引入h210n/i77l突变位点的基础上，再引入1对额外的二硫键(m150c-m280c)。
4.克隆
本发明中经密码子优化的ω-转氨酶基因(ω-ta基因)委托通用生物系统(安徽)有限公司进行全基因合成，基因合成服务中使用pet-28a质粒作为克隆载体，酶切位点分别为ndei和hindiii。构建的重组质粒pet-28a-ω-opt-ta转入e.colibl21(de3)，获得重组菌。
采用定点突变pcr方法依次对ω-转氨酶基因通过定点突变引入相应的突变位点，定点突变的引物和模板如表1所示。
表1ω-转氨酶位点定点突变引物的设计
以pet-28a-ω-opt-ta质粒为模板，进行定点pcr扩增。pcr扩增体系为50μl，包含：primestarmaxdnapolymerase25μl，1μl上游引物(10μm)，1μl下游引物(10μm)，1μl质粒模板(100ng/μl)，高温灭菌的超纯水补至总体积50μl。
pcr扩增程序为：98℃变性1min后，进入扩增循环，即98℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸3min，共循环30次，最后再72℃延伸7min。pcr产物经过电泳检测，其条带单一、清晰。
所得定点pcr反应产物用dpni在37℃下酶解2h以消除父本模板，酶解产物采用热激法转化入化学感受态细胞e.colidh5α，转化液涂布含有卡那霉素(50μg/μl)的lb固体平板得到定点突变文库,于37℃培养12h。
5.突变酶的表达和纯化
从定点突变文库中随机挑取1～3个单菌落，培养并提取质粒，样品送至通用生物系统(安徽)有限公司测定核苷酸序列，以确定是否引入预期的突变，测序引物为t7通用引物。
引入预期突变的质粒转化入e.colibl21(de3)中，挑取单菌落接种至加有5mllb液体培养基的试管中，37℃、200r/min条件下培养过夜。将培养好的菌液以1％比例(体积比)的接种量接种至含50μg/ml卡那霉素的100ml的lb培养基(胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，调节ph7.0)中，37℃、180r/min培养至od600值为0.4～0.6时，加入适量体积的iptg(终浓度为0.5mmol/l)，然后在25℃、150r/min条件下诱导培养18h后，收集菌体。
将收集的菌体用磷酸盐缓冲液洗涤两次，后用10％发酵液体积的破胞缓冲液重悬，超声波破碎细胞，超声破胞工作条件为：功率300w，工作3s，间歇6s，超声8分钟。破胞液于12000r/min，4℃条件下离心处理30min，收集上清液，即得到含有的ω-转氨酶粗酶液。
采用ni-nta亲和层析对所得的粗酶液进行分离纯化。经上样、清洗和洗脱，收集洗脱液，透析除去小分子即得到纯酶。适当稀释后，以考马斯亮蓝法测定纯酶的浓度。
本实施例获得的ω-转氨酶突变体分别是：
a.突变体i77l(第77位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸)；
b.突变体h210n(第210位氨基酸由组氨酸突变为天冬酰胺)；
c.突变体h210n/i77l(第77位氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸，且第210位氨基酸由组氨酸突变为天冬酰胺)；
d.突变体m150c-m280c(第150位的氨基酸由甲硫氨酸突变为半胱氨，且第280为的氨基酸由甲硫氨酸突变为半胱氨酸)；
e.突变体h210n/i77l/m150c/m280c(第77位的氨基酸由异亮氨酸突变为亮氨酸、第150位的氨基酸由甲硫氨酸突变为半胱氨酸、第210位的氨基酸由组氨酸突变为天冬酰胺以及第280为的氨基酸由甲硫氨酸突变为半胱氨酸)。
6.突变酶活力的测定
以(r)-(+)-α-甲基苄胺和丙酮酸为底物，底物溶液用磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)配制，200μl的反应体系中包括180μl底物溶(0.25％dmso，2.5mm(r)-(+)-α甲基苄胺，2.5mm丙酮酸，0.1mmplp)，20μl纯酶液(约0.3mg/ml)。利用酶标仪检测波长245nm处od值随时间的变化曲线。
酶活计算方法如下：
ε为12,000m-1·cm-1，md190酶标仪测定的数据是mabs/min。
结果如表2所示。
7.突变酶热稳定性考察
分别将纯化后的野生酶和突变酶在25-55℃水浴中孵育10min，随后迅速放置在冰上冷却10min。底物溶液用磷酸盐缓冲液(50mmol/l，ph8.0)配制，200μl的反应体系中包括180μl的底物溶液(0.25％dmso、2.5mmol/l(r)-(+)-α-甲基苄胺((r)-α-mba)、2.5mmol/l丙酮酸以及0.1mmol/lplp)，20μl纯酶液(约0.3mg/ml)，采用md190酶标仪检测波长在245nm处相应的酶活力(purmonenm,valjakkaj,takkinenk,etal.moleculardynamicsstudiesonthethermostabilityoffamily11xylanases[j].proteinengineeringdesignandselection,2007,20(11):551-559.)。
以温度为横坐标，以热处理后与处理前酶活力的比值为纵坐标作图，采用origin8.0软件进行boltzmanns型函数拟合，计算半失活温度(t5010)。
将野生酶和突变酶在40℃下分别孵育2-50min，孵育结束后迅速放置在冰上冷却10min，采用上述方法测定酶活力。以时间为横坐标，以热处理后与处理前的比活力的比值为纵坐标作图，通过origin8.0软件拟合非线性方程y＝exp(-kd·t)，一阶速率常数(kd)经非线性回归确定，并计算酶活力降低为50％时所对应的半衰期(t1/2)。
实验结果如表2和图4、5所示。
表2ω-转氨酶及其突变体的热稳定性结果
8.最适温度
以(r)-(+)-α甲基苄胺和丙酮酸为底物，底物溶液用磷酸盐缓冲液(50mm，ph8.0)配制，200μl的反应体系中包括180μl底物溶(0.25％dmso，2.5mm(r)-(+)-α甲基苄胺，2.5mm丙酮酸，0.1mmplp)，加入20μl纯酶液(约0.3mg/ml)后(并做三组平行对照)，放入不同温度(25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃)的恒温混匀仪中进行反应(400r/min)，3min后放入100℃的水浴中煮沸10min，最后在冰上放置10min后，利用酶标仪检测波长245nm处的od值。
实验结果如表2所示。
结果表明，突变体酶h210n、突变体酶i77l和突变体酶m150c-m280c的最适反应温度均为45℃；突变体酶h210n/i77l的最适反应温度为55℃，与野生酶相比提高了10℃；突变体酶h210n/i77l/m150c-m280c的最适反应温度为55℃，与野生酶相比提高了10℃；但是，突变体酶在较高温条件下具有较好的热力学稳定性。
序列表
<110>浙江科技学院
<120>一种ω-转氨酶突变体及其应用
<160>18
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
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