本发明属于遗传学
技术领域：
，涉及水稻白化转绿叶基因val1及其编码的蛋白和应用。
背景技术：
叶色突变是高等植物表现出的较为直观的一类突变形式，通常由光合色素组成和含量改变引起，表现出叶片颜色存在差异。叶色变异类型丰富，按照苗期叶色表现，可以将叶色突变体分为黄化、白化、浅绿、深绿、常绿、条纹和斑点等类型，而按照叶色突变后能否恢复正常可分为转绿和非转绿类型(yooetal.,2009)。迄今为止，水稻叶色突变体已得到大量的研究和应用。其中，已有170个左右的叶色突变基因定位于水稻12条染色体上，约有60个左右叶色突变体基因被成功克隆。水稻叶色突变体的挖掘和研究具有重要的理论研究和应用价值。在基础研究上，水稻叶色突变体是解析叶绿素合成、叶绿体发育等光合作用机理研究的理想材料。因此，通过利用叶色突变体克隆相关基因，研究基因突变的遗传和调控机制，是深入认识光合作用机理，服务育种实践的重要基础。如郭春爱等利用水稻低叶绿素b突变体研究了低叶绿素b对突变体光系统ii热稳定性的影响。结果表明，低叶绿素b突变体对高温更敏感，psii捕光色素蛋白复合体(lhcii)中叶绿素b减少可能降低了psii结构与功能的热稳定性(郭春爱等，2007)。jung等鉴定分离出水稻中编码镁－整合酶h亚基的基因oschlh，该基因突变后，酶活性降低，突变体表现为苗期叶片失绿发白，叶绿体的类囊体膜发育不全，且叶绿素含量很低(jungetal.,2003)。另一个关键酶是叶绿素a氧化酶，是合成叶绿素b所必需的酶，lee等研究发现，oscao1基因突变后，突变体叶绿素b合成受阻，导致叶绿素b的含量几乎为零(leeetal.,2005)。在育种应用上，水稻叶色突变体不仅可以作为形态标记，用于培育携带叶色标记的三系或两系不育系，提高杂交种子纯度，而且还可以作为高光效资源(如常绿突变体)应用于超高产育种。目前，我国已利用叶色突变体育成了多个携带叶色标记的不育系。由于叶色变异多为隐性单基因控制，极易被转育成不同遗传背景的不育系，且不会对其杂交组合的叶色和产量造成影响，因而在杂交稻遗传育种上具有重要的利用价值。目前，已培育出标1a、m2s、安农810s等淡绿叶不育系，以及玉兔s、nhr111s、白丰a、全龙a等白化转绿型不育系(李云，2007；吴伟，2006；赵海军，2004)。然而，在生产实践中，也经常发现，某些黄叶不育系在全生育期表达，影响了不育系的繁殖和制种产量；而某些白化转绿不育系因叶色转化时间过早(多在三叶期后转色)，使除杂期缩短，亦不便于后期除杂。此外，多数苗期标记性状单系本身性状不优良、常导致其它重要农艺性状显著降低，利用时都需进行一个杂交转育过程以克服不良性状的遗传累赘，实现优异性状的聚合，这个过程往往非常困难，都要通过大量长期的转育才能实现。因此，到目前为止，具有育种价值的水稻叶色变异材料仍然非常匮乏，急待挖掘和利用一些兼顾产量及叶色表达时期，中后期转绿型资源或非生理损伤型叶色基因及其突变体。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的之一在于提供水稻白化转绿叶基因val1，该基因为苗期标记性状，并且对其他主要农艺性状无显著影响，为水稻转基因研究提供有力的工具，促进杂交稻育种研究；本发明的目的之二在于提供水稻白化转绿叶基因val1编码的蛋白质；本发明的目的之三在于提供水稻白化转绿叶基因val1的应用。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：水稻白化转绿叶基因val1，核苷酸序列如seqidno.1所示。上述水稻白化转绿叶基因val1编码的蛋白质，氨基酸序列如seqidno.2所示。上述水稻白化转绿叶基因val1在水稻叶色性状的分子育种中的应用。优选的，所述水稻品种为缙恢10号。本发明利用甲基磺酸乙酯(ems)诱变自育优良恢复系缙恢10号获得一个遗传稳定的水稻“白化转绿叶”突变体，在遗传分析和基因定位的基础上，先通过基因预测、同源搜索及基因序列差异比较，确定了水稻白化转绿叶突变性状为val1隐性基因控制，val1基因编码一个磷酸核糖胺甘氨酸连接酶(loc_os08g09210)，是嘌呤核苷酸从头合成途径的第二个酶。随后，本发明以水稻白化转绿叶突变体val1为材料，克隆了水稻白化转绿叶基因val1，具有如seqidno.1所示的核苷酸序列，开放阅读框为1584bp，编码527个氨基酸，其氨基酸序列如seqidno.2所示。与野生型缙恢10号相比，突变基因val1在第3个外显子上的t碱基转换为c碱基，从而导致突变体中氨基酸由苯丙氨酸变为丝氨酸。将含有野生型基因loc_os08g09210的7198bpdna片段转化到val1突变体中进行互补验证。在转基因植株中，突变表型完全恢复(图2b)。随后，构建了rnai干涉载体并转化野生型缙恢10号。在转基因植株中，val1的转录水平显著降低(图2d)，且植株叶片出现和val1相似的白化转绿表型(图2b)。进一步确定水稻白化转绿叶突变性状由val1基因突变引起，因此，水稻白化转绿叶基因val1可用于水稻叶色性状的分子育种。本发明的有益效果在于：本发明公开了水稻白化转绿叶基因val1及其编码的蛋白和应用，水稻白化转绿叶基因val1的核苷酸序列如seqidno.1所示，氨基酸序列如seqidno.2所示，与野生型相比，水稻白化转绿叶基因val1在第3个外显子上的t碱基转换为c碱基，从而导致突变体中氨基酸由苯丙氨酸变为丝氨酸。该基因突变后，val1突变体在幼苗早期出现白化叶片；从幼苗后期至分蘖期，叶片逐渐转绿且叶片边缘白化，表现为混合表型；在抽穗期，叶片几乎呈灰绿色，只有少数叶片表现出边缘白化。通过杂交发现该性状为隐性性状，因此能够利用此性状选育新品种和种子纯度鉴定，对水稻的遗传育种具有重要意义。本发明的水稻白化转绿叶基因val1为苗期标记性状，对其他主要农艺性状无显著影响，为水稻遗传育种研究提供了有力的工具，为选育纯种不育系奠定基础。附图说明为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：图1为野生型(wt)和val1突变体的表型特征。(a-c)wt和val1在幼苗期(a)、分蘖期(b)和抽穗期(c)的表型。右上方为wt和val1叶片的放大图像。(d-f)wt和val1在幼苗期(d)、分蘖期(e)和抽穗期(f)的叶片叶绿素含量。图2为val1基因的分子鉴定。(a)val1基因的图位克隆。(b)野生型、互补植株、val1突变体和val1-rnai植物的表型。标尺为5μm。(c)分蘖阶段野生型、互补植株和val1-rnai植株的叶绿素含量。(d)val1在野生型和3个rnai株系叶片中的表达分析。(e-h)抽穗期野生型、互补植株和val1-rnai植株的净光合速率(e)，气孔导度(f)，胞间co2浓度(g)和蒸腾速率(h)。图3为val1基因的表达模式和val1蛋白的亚细胞定位。(a)实时pcr检测不同组织中val1的表达模式。(b,c)实时pcr检测叶片中val1的表达模式。(d)原位杂交检测val1的表达模式。(e)val1蛋白的亚细胞定位。标尺为50μm。sb，茎基部；l4，第四片叶子；l2，第二叶；l3l，第三叶的下半部分；l3u，第三叶的上半部分。图4为val1编码蛋白的序列比对分析。图5为val1编码蛋白的进化树分析。图6为val1参考嘌呤从头生物合成途径。(a)野生型和val1突变体中的amp和gmp含量。(b)外施不同浓度(0，1，5，或10mm)的amp，gmp，或amp和gmp后，野生型和val1突变体的叶片形态学分析。(c)b图中野生型和val1的突变体叶绿素含量。具体实施方式下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明实施例中使用的材料：野生型水稻材料缙恢10号(wt)和水稻白化转绿叶突变体val1，均由西南大学生物学创新团队培育(王峰等，核农学报，2011，25(2)：0197-0201)；本发明使用的各种限制性内切酶和t4连接酶(d2011a)均购自大连takara生物工程有限公司；各种快速限制性内切酶、dnamarker购自北京全式金生物技术有限公司；其他的化学试剂，如蔗糖、蛋白胨、酵母提取物、葡萄糖、氯化钙、ctab、tris-hcl、edta、氯化钠、丙烯酰胺、temed、琼脂粉、x-glu主要购自于美国sigma公司和上海生工生物工程股份有限公司；通用型dna纯化回收试剂盒(universaldnapurificationkit)，质粒提取试剂盒(tianprepminiplasmidkit)均购自天根生化科技(北京)有限公司，rna提取试剂盒(eastepsuper总rna提取试剂盒)和rna反转录试剂盒(goscript逆转录mix,oligo(dt))均购自美国promega公司；实时定量pcr(sybrpremixdimereraser试剂盒)购自大连takara生物工程有限公司；引物合成和dna测序由上海英俊生物技术有限公司完成；其它化学试剂购自北京鼎国生物技术有限责任公司；大肠杆菌dh5α、农杆菌lba4404均购自biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心。实施例1、水稻白化转绿叶突变体val1的获得和形态学观察利用甲基磺酸乙酯(ems)诱变自育优良恢复系缙恢10号获得一个遗传稳定的水稻叶色白化转绿叶突变体，命名为val1。在野生型(wt)中，除了成熟后期以外，植株叶片在整个生长期都呈现绿色。而在突变体val1中，在幼苗早期出现白化叶片(图1中的a)。从幼苗后期至分蘖期，叶片逐渐转绿且叶片边缘白化，表现为混合表型(图1中的b)。在抽穗期，叶片几乎呈灰绿色，只有少数叶片表现出边缘白化(图1中的c)。因此，叶片越老，白化面积越小。这些结果表明val1的表型受生育进程的调控。此外，在幼苗期和分蘖期，与野生型相比，与val1突变体的白化表型一致，其叶片叶绿素含量极显著降低(图1中的d和e)，在成熟期略有降低(图1中的f)。综上所述val1突变体是一个受生育进程调控的白化转绿叶突变体。实施例2、val1基因的分子鉴定以val1突变体为父本，籼稻品种西农1a(xinong1a)为母本杂交获得的f1代植株，叶片全部表现为正常绿色，然后通过自交获得3853株f2代群体中，依据白化转绿叶性状分离出了突变叶片和正常叶片两种表型，分离出了2885株正常单株和968株突变单株株，卡方验证结果表明，正常株与突变株符合3：1的分离比例，表明该突变性状由一对隐性单基因控制。精细定位：val1基因之前被初步定位在第8染色体m22和id27之间171kb范围内。根据已公布的籼稻品种93-11序列，在此区间内进一步筛选和开发标记，最终将val1基因精细定位至简单重复标记ssr8-1和插入/缺失标记id30(序列如表1)之间，物理距离为29.69kb。此区间有4个注释基因(http://www.gramene.org/)。表1、2对具有多态性的ssr标记序列引物正向序列(5′→3′)反向序列(5′→3′)ssr8-1attgctaaagatgatttggaacta(seqidno.3)gggacctagaaacatcatctcc(seqidno.4)id30cgccagcaatgtaggtttat(seqidno.5)catgcttgctaaacagatacagac(seqidno.6)测序分析发现loc_os08g09210基因的第三个外显子上t碱基突变为c碱基，导致突变体中氨基酸由苯丙氨酸转变为色氨酸(图2中的a)。为了证明是否loc_os08g09210突变导致突变表型，通过将含有野生型基因loc_os08g09210的7198bpdna片段转化到val1突变体中进行互补验证。具体方法为：以val1c-f：5′-gccgaattcgttgggttcaaatcccacctttct-3′(seqidno.7)和val1c-r：5′-gccggatccctcggcccagttaaggccagct-3′(seqidno.8)为引物，扩增野生型基因loc_os08g09210的7198bpdna片段，扩增产物经纯化后分别用ecorⅰ和bamhⅰ酶切，然后连入pcambia1301载体(biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)，获得互补重组表达载体，将获得的互补重组表达载体pcambia1301-loc_os08g09210转化val1突变体，获得转基因植株，然后观察转基因植株的叶片性状，结果如图2中所示。结果显示，转基因植株的叶片颜色表现为正常绿色(图2中的b)，且叶绿素、类胡萝卜素及光合速率和野生型类似(图2中的c、e-h)。此外，透射电镜显示，互补植株叶片叶绿体超微结构与野生型相似，具有发育良好的片层结构、正常的类囊体膜及堆积的基粒(图2中的b)。此外，构建了val1基因的rnai干涉载体并转化野生型缙恢10号。具体方法为：分别以val1rif1：5′-gccggatccgaatccgatctagcacaggttctgat-3′(seqidno.9)与val1rir1，5′-gccggtaccgccagtcaacaacatctactgcatcat-3′(seqidno.10)和val1rif2：5′-gccgagctcgaatccgatctagcacaggttctgat-3′(seqidno.11)和val1rir2：5′-gccactagtgccagtcaacaacatctactgcatcat-3′(seqidno.12)为引物，扩增野生型缙恢10号cdna，扩增产物经纯化后分别用kpnⅰ和bamhⅰ与sacⅰ和speⅰ酶切，然后先后连入ptck303载体(biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)，获得rnai重组表达载体，命名为ptck303-val1ri。将获得的rnai重组表达载体ptck303-val1ri转化野生型缙恢10号，获得转基因植株，然后观察转基因植株的叶片性状，结果如图2中所示。结果显示，在转基因植株中，val1的转录水平显著降低(图2中的d)，且出现和val1相似的白化转绿表型(图2中的b)。与野生型相比，转基因植株叶片叶绿素、类胡萝卜素含量及光合速率显著减少(图2中的c、e-h)。透射电镜显示，转基因植株叶片叶肉细胞几乎是中空的，缺乏完整的细胞器，叶绿体完全降解，与突变体val1相似(图2中的b)。综上所述，以上结果证明了loc_os08g09210就是val1基因。实施例3、val1的表达模式和val1蛋白的亚细胞定位为了确定val1的表达模式，利用表2的引物进行实时荧光定量分析。以actin为内参，反应体系为：在25μl的反应体系中加入2μl的cdna模板，2μl引物，12.5μlsybrgreen荧光染料和8.5μlrnase-freeh2o，在bio-rad荧光定量pcr仪上进行荧光定量扩增；扩增条件为：94℃预变性2分钟；94℃变性30秒，56℃复性30秒，72℃延伸1分钟，40个循环；最后72℃延伸10分钟，然后利用cfx-manager软件进行数据的收集与处理，结果如图3所示。由图3可知，val1在各组织均表达，包括根、茎、叶、鞘、穗，且在叶片中表达最高(图3中的a)。此外，我们详细分析了val1在叶片各部位的表达模式，结果显示val1在sb、l4、l2、l3l和l3u中均表达，且在l3l中表达水平最高(图3中的c)。为了更详细的分析val1的表达模式，通过原位杂交检测了val1的表达模式(图3中的d)。具体方法为：以val1-f：5′-cgatgccgttatcgcgttct-3′(seqidno.13)和val1sp6-r：5′-agatttaggtgacactatagcttcaaatgcctcatccaaagtc-3′(seqidno.14)为引物，扩增val1基因cds上一段保守片段，经体外转录合成原位杂交所需探针，经过杂交后，结果表明，val1在sam中强烈表达(图3中的d1)；随后在p2原基中分散表达(图3中的d2)；在p3原基中，val1集中在p3原基的边缘和原形成层细胞中表达(图3中的d2)；在p4原基中，val1主要集中在维管束表达(图3中的d3、d4)。表2、引物序列引物正向序列(5′→3′)反向序列(5′→3′)actintgctatgtacgtcgccatccag(seqidno.15)aatgagtaaccacgctccgtca(seqidno.16)val1cctgcaccaatagtgacagaagagct(seqidno.17)cgcatcataagaacctggcattct(seqidno.18)为了确定val1蛋白的定位，利用水稻原生质体瞬时表达系统来研究val1蛋白的定位。具体方法为：以val1pan-f：5′-gccactagtatggcgtctgctgctgccgct-3′(seqidno.19)和val1pan-r：5′-gccggatccgtaattggccacttgcttgtgcttcagtg-3′(seqidno.20)为引物，扩增野生型基因loc_os08g09210的cds片段，扩增产物经纯化后分别用speⅰ和bamhⅰ酶切，并连接到了35s-gfp-nos(pa7)表达载体(biovector质粒载体菌种细胞基因保藏中心购买)中，构建gfp-val1融合表达蛋白。然后将gfp和gfp-val1的质粒转入水稻原生质体中，28℃过夜孵化，用奥林巴斯激光扫描共焦显微镜来观察gfp的荧光。gfp-val1融合蛋白和单独gfp蛋白在水稻原生质体中瞬时表达后，表达gfp-val1融合蛋白的细胞在叶绿体检测到绿色荧光，表达gfp蛋白的细胞在整个细胞中均检测到绿色荧光。此结果暗示val1定位于叶绿体(图3中的e)。实施例4、val1编码蛋白的序列和生物信息学分析蛋白序列在phytozome网站通过blast获得，使用10-5阈值(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！search？show＝blast)。利用mega5.0进行进化分析。进化树的构建使用最大似然法，采用jones–taylor–thorntonmatrix-basedmodel，bootstrap值为500次重复。val1蛋白被预测为磷酸核糖胺-甘氨酸连接酶(purd)，属于atp-grasp超家族。将val1氨基酸序列和其它磷酸核糖胺-甘氨酸连接酶家族成员的氨基酸序列比对，发现val1序列高度保守。蛋白结构用psipred进行预测(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)。val1包含三个保守结构域，命名为gars_n,gars_a,gras_c，其中gars_a结构域含有atp结合位点。此外，用chlorop(http://www.cbs.dtu.dk/services/chlorop/)进行预测，val1在n末端含有叶绿体转运肽(氨基酸残基1-68)(图4)。进化树分析表明，val1广泛存在于光合生物中(图5)，包括低等藻类、陆生蕨类植物、裸子植物和被子植物，并且它表现出高度的同源性，这表明水稻中的val1可能来源于藻类。此外，水稻基因组含有一个val1的同源基因loc_os12g09540，后者也被预测为一个磷酸核糖胺-甘氨酸连接酶，但loc_os12g09540和val1不属于相同的进化谱系，这表明两者的分子功能可能存在一定程度的差异。实施例5、val1参考嘌呤从头生物合成途径为了验证val1参与参考嘌呤的从头合成途径，本研究检测了野生型和突变体幼苗中嘌呤从头合成途径产物amp和gmg的含量，具体方法为：称取约0.1g样本，放入研钵中磨碎，利用三氯乙酸萃取核苷酸，利用rigoll3000高效液相色谱仪，kromasilc18反相色谱柱(250mm*4.6mm,5μm)，检测254nm波长处的吸收峰，结果显示，相较于野生型，突变体中amp和gmg的含量均低于野生型(图6中的a)。随后，本研究分析了外施不同浓度的anp和gmp后，野生型和突变体植株的表型。具体方法为：将野生型和突变体种子表面消毒后，置于加入不同浓度的amp、gmp和amp与gmp的混合物的ms培养基中培养，待培养7-10天后，观察植株表型并检测色素含量。结果显示，外施amp、gmp和amp与gmp的混合物后，可部分恢复val1突变体叶片的绿色表型(图6中的b)。在野生型中，低浓度(1和5mm)amp、gmp和amp、gmp可促进叶片中的叶绿素积累，而高浓度(10mm)则抑制叶绿素积累，并抑制植株的生长(图6中的c)。在突变体val1中，随着amp、gmp和amp、gmp浓度升高，叶绿素含量升高(图6中的c)。因此，外源使用amp、gmp和amp、gmp可部分恢复val1突变体叶片表型。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。序列表<110>西南大学<120>水稻白化转绿叶基因val1及其编码的蛋白和应用<160>20<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>3992<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atcgctgctttactcccccatcaacgccgctcgctcactactcgcgccgccgcttccgcc60gccgctccgctccagtcgcgtcggcttcccgcctcctcgccggcgagccgtgcctcgacg120ctctccctctgttgctccgccggccagcagcatgccgcgcttctgctcccactagctccc180gccaccgccgcccctactgagcccggtgagaccgtgaggcggtggtgtgcaccagtccgg240cagttcgcccccctcctcctcccaatccggccgccgcttcatcaccgccggcgaggctcc300gcgtctcctcctaggtcgcgctgcttcgtatcacagagagaggtgagccccttgcaactt360gttgccagagttgccagaaacaaaaaagatcgatgttcttggactgaatcgattgtttct420tggtaggccagctcggtctccggataagcaagaaccatggcgtctgctgctgccgcttac480ggcgtcggggctccactcaagctcgctgcaaggcggcatggggcactcgcgctggccggt540agccatcgctgcagtggatggaagtcttcagtgtcttgccctgttcctcaggcttggatg600ggcagttgctcttctgtcgcaatgcgccgtgtcgcctccggttctcgattgattgttcag660gcttcaaacagcgggggctcaagcttgaaggcatcattggctgatgctagcctgcttact720ggtaaagtagtattagattagctcagcttattttgttctttcttcaggtggtttatgttt780atggaaaagaaaaatccaaagtcccaatgcgctatgagatgaaactttgtcgttgagtta840gtcgagagaacttgttattagatgcaaagtctggggcaatggtttaatttcctgtttcct900gtttcatttcagaagagaggataactgttttggtgattggaggtggaggaagggagcacg960ctctctgttacgccttgaatcgctctccgtcttgtgatgcggtcctatgtgcccctggga1020acgcaggtattgctcagtctggagatgcgacctgtatatcggacttagacgtctccgata1080gcgatgccgttatcgcgttctgctgcaagaggggagtgggaatggttgtagtaggtcctg1140aagctcctcttgttgccggtcttgtgaatgaccttgtgaaagctgagataccagcatttg1200gtccttcctcagaagctgcggctttagaaggatcgaaggactttatgaagaaattatgcg1260ataagtacaatattcctacagctaaggtaccttctttttacattagttttcagccctata1320agtttaatctttctgggacaatgaacatttgctccaatgagagtacggggtgcctaaatt1380tggttgatgtgatatccatgtttaagaaagaaccaaagatgcatcatttcaggcataatc1440acactgatatttcctttgtattgttacaaggttgctaaccaagttcatatttgacttgct1500tgatagtatatcagttatagacaatataagtaatcatctcagagttaatgatatatcttc1560agctttctaggtgaactgtacttaagcattgcccatatgtcctgaaatttcccttgggat1620tgcctgagttttgaaataaagtcattgtgttgtactgtaaacgttctagaaaagataggg1680aaaaacagagctcctctacataagtctatatgtataatttgagatgttaataataatggt1740aacataagtgcttatatttcttttatagtatcgcacattcacagatcctgcagaagctaa1800acaatatgtcaaagatcaaggcgcccctattgttgtcaaagctgatggattggcagctgg1860aaaaggcgtggttgttgctatgactttggatgaggcatttgaagccatagactctatgct1920ggttcaagggtcatttggttctgctggttcacgggttatcattgaagaatatctggaggg1980tgaagaagcctctttctttgcattagtggatggtgaaaatgcattgccacttgaatcggc2040acaagatcacaaaagggttggtgatggtgatgtaggcccaaatactggtggtatgggtgc2100atattcccctgcaccaatagtgacagaagagcttaagcacacaattatggatagtataat2160aatcccaacagttcaaggtatggcagctgaaggatgcaagtttgttggtgtattatatgc2220tggacttatgattgagaagaaatctggtctgcctaagcttatcgagtacaacgtacgatt2280cggtgacccagaatgccaggttagtgattctctatctataaactctaaccttcaatgatg2340cactatctattaggaaactatgtatatctattataatttagattttggtttatctgatca2400tgctttggccaaggtgttcttgttggacattatagtaaaacaaaattgcatgactatttt2460ggattctggttcctctgatcacactatggctaagatgttcttgttggacaatagaatgaa2520acaaacatgcgtgtcttatcatcagaatttttctcgttctacagttttgacaccctggtc2580tgcatctagcaggtcaaactctacagggggtctagtaagaagctgagtagatttcattcc2640tgtagtgcaatgagtggtgcatttttgtgtcattttagtgatggtcaaatttcaaatttt2700atctacttttgcatatttgttagtgatggccaaccgtttgatgtatgaaattttcgaatt2760tataccagtgcagattaaacaattctgactggctactaaaatgtttatctttgaagtaaa2820attgcttttagagtatagacttttaaaattatgcatattattggcaaataacaaaggcaa2880aatgttaaaatcatgaagattgtcaattgaaaaggtatattatatttttatggccagagg2940tagtagttgtttatctcagcctgaattgttcatccagcatctggcccaattatccaagat3000tcccttgtgggctgcattttcatgaatagattgatagtcctgtggcatattcgttctgct3060tgtctggtacgtatcccaactatagattttccagataagatcgggtttttgttcttttgc3120tgctaagcaatctagttgaactgttcactatttttaccatcaaatttcgattatactttt3180ctctactgatatatacttcttttttgcacctcaggttcttatgatgcgattagaatccga3240tctagcacaggttctgatgtctgcgtgcagaggggaactgggcgatgtttcactaacctg3300gtcacctgaaatggcaatggtggttgtgatggcaagcgaaggataccccggatcttataa3360gaaggggactgtaataagaaatctcgagaaggccgagcaggtctcgcccgcggtaaaaat3420attccatgctggaacagcactggatggggatggaaatcttgtcgctgtcggaggccgggt3480gctcgggatcacggctaagggcaaagacattgaggaagcacgggcaagagcatatgatgc3540agtagatgttgttgactggcctgaaggattcttcaggcgcgatattggttggagagcact3600gaagcacaagcaagtggccaattactgatgcggattttcctgagcacaccacaactatgg3660tgagcatgtaatgttaagagcaataaagagaaaatttgtcacttctgtggttgaggaaag3720gcaaaaccatagctcaaatttgagtttttttttttgtaccaactgttaaatttgagttgg3780gcttgcattttgaggaacagccagatgaacaatgaccgagttttgacttccacaagtaga3840gagagagcattgttcggtgcttaatatctacttccgttggttagtggtattaagggattc3900catatgtaagtcgttttagacttgtgcacaagaattaagataacaatctcaatgattttg3960ttacccttcatttaaactacatcagaaaaaga3992<210>2<211>527<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2metalaseralaalaalaalatyrglyvalglyalaproleulysleu151015alaalaargarghisglyalaleualaleualaglyserhisargcys202530serglytrplysserservalsercysprovalproglnalatrpmet354045glysercysserservalalametargargvalalaserglyserarg505560leuilevalglnalaserasnserglyglyserserleulysalaser65707580leualaaspalaserleuleuthrglugluargilethrvalleuval859095ileglyglyglyglyarggluhisalaleucystyralaleuasnarg100105110serprosercysaspalavalleucysalaproglyasnalaglyile115120125alaglnserglyaspalathrcysileseraspleuaspvalserasp130135140seraspalavalilealaphecyscyslysargglyvalglymetval145150155160valvalglyproglualaproleuvalalaglyleuvalasnaspleu165170175vallysalagluileproalapheglyproserserglualaalaala180185190leugluglyserlysaspphemetlyslysleucysasplystyrasn195200205ileprothralalystyrargthrphethraspproalaglualalys210215220glntyrvallysaspglnglyalaproilevalvallysalaaspgly225230235240leualaalaglylysglyvalvalvalalametthrleuaspgluala245250255pheglualaileaspsermetleuvalglnglyserpheglyserala260265270glyserargvalileilegluglutyrleugluglygluglualaser275280285phephealaleuvalaspglygluasnalaleuproleugluserala290295300glnasphislysargvalglyaspglyaspvalglyproasnthrgly305310315320glymetglyalatyrserproalaproilevalthrglugluleulys325330335histhrilemetaspserileileileprothrvalglnglymetala340345350alagluglycyslysphevalglyvalleutyralaglyleumetile355360365glulyslysserglyleuprolysleuileglutyrasnvalargphe370375380glyaspproglucysglnvalleumetmetargleugluseraspleu385390395400alaglnvalleumetseralacysargglygluleuglyaspvalser405410415leuthrtrpserproglumetalametvalvalvalmetalaserglu420425430glytyrproglysertyrlyslysglythrvalileargasnleuglu435440445lysalagluglnvalserproalavallysilephehisalaglythr450455460alaleuaspglyaspglyasnleuvalalavalglyglyargvalleu465470475480glyilethralalysglylysaspilegluglualaargalaargala485490495tyraspalavalaspvalvalasptr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