本发明属于神经生物学技术领域，具体涉及一种表达il-4的重组腺相关病毒及其制备方法和应用。
背景技术
抑郁症是一种精神障碍性疾病，它具有高发病率、高致残率、高自杀率以及低知晓率和低治愈率等特点。严重影响着患者的生活质量，同时给社会带来较大的经济负担，但是目前对抑郁症的发病机制还不清楚。
当前的抗抑郁药物具有一定的局限性，大多数抗抑郁药物对大约有三分之一的抑郁症患者无效，而且需要很长的治疗时间，停药后容易复发，同时还带有很强的副作用。
il-4是一种活化t细胞产生的抗炎性细胞因子，在免疫调节过程中起着重要作用，在抗抑郁药物研究中发现，il-4具有一定的抗抑郁作用，但是目前的il-4蛋白主要以重组蛋白存在，如有文献记载的，重组fil-4融合蛋白在大肠杆菌中的表达采用pcr技术扩增后获得含有编码factorxa识别位点的fil-4基因，克隆入pmd18-t载体后测序正确。将fil-4基因亚克隆入pet28a质粒，构建重组质粒pet28a-fil-4，然后转入大肠杆菌bl21(de3)中进行诱导表达，sds-聚丙烯酰氨凝胶电泳显示19kda处出现了一条明显的蛋白质条带。重组fil-4融合蛋白在大肠杆菌中的表达量较高，但同其它外源真核蛋白一样，重组fil-4融合蛋白在大肠杆菌中主要以包含体的形式表达(许艳.重组il-4融合蛋白的构建、表达及纯化.吉林大学.2004年硕士学位论文)，可见在il-4蛋白的制备存在着成本较高的问题，同时还需要多次注射，而且用量较大，在体内缺乏特异性。将il-4蛋白应用于抑郁症的治疗仍面临较大的困难。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种表达il-4的重组腺相关病毒，该病毒成本低、效率高，在中枢神经系统中特异表达，抗抑郁效果良好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种表达il-4的重组腺相关病毒，所述病毒包含ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒。
本发明提供了一种上述表达il-4的重组腺相关病毒的制备方法，包括以下步骤：
1)克隆il-4基因；
2)分别双酶切步骤1)得到的所述il-4基因和ef1α-eyfp-wpre-pa质粒，得到酶切il-4基因和酶切ef1α-eyfp-wpre-pa质粒；
3)将所述步骤2)得到的酶切il-4基因和酶切ef1α-eyfp-wpre-pa质粒进行连接，得到ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒；
4)将所述步骤3)得到的ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒转化入感受态细胞，进行扩增培养，得到扩增后的重组ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒；
5)将所述步骤4)得到的扩增后的重组ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒转染宿主细胞，转染后培养，构建得到重组腺相关病毒。
优选的，步骤1)所述克隆使用的引物序列如seqidno.1和seqidno.2所示。
优选的，步骤2)所述双酶切使用的酶为bamhi和xhoi。
优选的，步骤3)所述酶切il-4基因的浓度为30～50ng/μl；所述酶切ef1α-eyfp-wpre-pa质粒的浓度为80～120ng/μl。
优选的，步骤3)所述连接的体系包括：5μl的buffer，0.5μl酶切ef1α-eyfp-wpre-pa质粒，2.5μl酶切il-4基因，1μl的t4dna连接酶和1μl的ddh2o。
优选的，步骤5)所述宿主细胞包括hek293细胞。
优选的，步骤5)转染后培养的条件为：培养温度35～40℃、体积浓度2～7％的co2。
本发明还提供了一种所述表达il-4的重组腺相关病毒或上述制备方法得到的表达il-4的重组腺相关病毒在制备治疗抗抑郁药物中的应用。
本发明提供了一种表达il-4的重组腺相关病毒，该重组腺相关病毒可在大脑内特异表达il-4蛋白，具有一定的脑区特异性，在转染小鼠4周后，提取小鼠大脑的rna进行实时定量pcr的结果，结果显示，病毒注射组与对照相比，il-4以及il-4受体的蛋白质浓度都显著提高，il-4的过表达能改善抑郁小鼠的行为绝望、快感缺乏以及情绪低落，且il-4的过表达不会影响小鼠的体重，证明了重组腺相关病毒安全无毒。
附图说明
图1为从小鼠脾脏提取的rna经反转录后，进行pcr扩增所得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定结果图；
图2为琼脂糖凝胶电泳所得的符合要求的pcr产物经切胶回收，分离纯化后进行基因测序的测序结果图；
图3为il-4基因与质粒载体连接后被转入大肠杆菌，进行蓝白斑筛选结果图；
图4为il-4基因与质粒载体连接后被转入大肠杆菌，进行蓝白斑筛选，进一步扩增后提纯质粒，进行琼脂糖凝胶电泳分析结果图；
图5为提纯后回收的质粒的基因测序结果图；
图6为基因测序后进行碱基的表达峰值检测图；
图7为包装好的病毒在体外转染hek293细胞的结果图；
图8为包装好的raav-ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa在体外转染原代培养的星形胶质细胞的结果图；
图9为包装好的raav-ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa在小鼠体内的转染结果图；
图10为raav-ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa在转染小鼠4周后，在小鼠大脑内的基因表达结果图；
图11为raav-ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa在转染小鼠4周后，在小鼠大脑内的蛋白质浓度检测图；
图12为raav-ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa在转染小鼠4周后，小鼠做强迫游泳测试的结果图；
图13为raav-ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa在转染小鼠4周后，小鼠做强悬尾测试的结果图；
图14为raav-ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa在转染小鼠4周后，小鼠做糖水偏好测试的结果图；
图15为raav-ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa在转染小鼠4周后，小鼠做糖水毛色评分测试的结果图；
图16为raav-ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa在转染小鼠4周后，小鼠做自主活动测试的结果图；
图17为raav-ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa在转染小鼠4周后，小鼠做体重测试的结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种表达il-4的重组腺相关病毒，所述病毒包含ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒。
本发明还提供了一种上述重组腺相关病毒的制备方法，包括以下步骤：
1)克隆il-4基因；
2)分别双酶切步骤1)得到的所述il-4基因和ef1α-eyfp-wpre-pa质粒，得到酶切il-4基因和酶切ef1α-eyfp-wpre-pa质粒；
3)将所述步骤2)得到的酶切il-4基因和酶切ef1α-eyfp-wpre-pa质粒进行连接，得到ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒；
4)将所述步骤3)得到的ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒转化入感受态细胞，进行扩增培养，得到扩增后的重组ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒；
5)将所述步骤4)得到的扩增后的重组ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒转染宿主细胞，转染后培养，构建得到重组腺相关病毒。
在本发明中，克隆il-4基因，所述克隆优选的利用rna反转录得到的cdna进行克隆，所述rna优选的提取自小鼠内脏，更优选的为小鼠脾脏。本发明对所述rna的提取方法并没有特别限定，优选的为trizol法提取。
本发明提取rna后，利用反转录试剂盒合成第一链cdna，本发明对所述反转录试剂盒的种类及来源没有特别限定，优选的将合成的所述第一链cdna稀释为100ng/μl。
本发明以反转录得到的所述第一链cdna为模板克隆所述il-4基因，所述克隆的引物优选的包含有酶切位点，所述酶切位点优选的为bamhi和xhoi双酶切位点。在本发明中，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列优选的如seqidno.1所示，所述下游引物的序列优选如seqidno.2所示，所述引物的浓度优选的为200mmol。在本发明中，所述克隆的体系优选的为30μl体系，所述30μl体系优选包括：2μl的cdna模板，2μl的上游引物，2μl的下游引物，15μl的2xtranstaqhifipcrsupermix和9μl的ddh2o；在本发明中，所述克隆的程序优选为：95℃酶激活3min；95℃变性10s；72℃延伸10s，39个循环。
所述克隆得到pcr产物后，本发明将所述克隆得到的产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，在430bp处的克隆产物为il-4基因。本发明优选将得到的所述il-4基因再利用琼脂糖凝胶dna回收试剂盒进行分离纯化，本发明对琼脂糖凝胶dna回收试剂盒的种类和来源都没有特别限定。
克隆得到il-4基因后，分别双酶切所述il-4基因和ef1α-eyfp-wpre-pa质粒，得到酶切后的il-4基因和酶切后的ef1α-eyfp-wpre-pa质粒。本发明对所述ef1α-eyfp-wpre-pa质粒的来源没有特殊的限定，优选的来源于市售商品。在所述双酶切前，优选的还包括ef1α-eyfp-wpre-pa质粒扩增的过程，所述扩增过程优选为将ef1α-eyfp-wpre-pa质粒侵染大肠杆菌培养；由所述培养得到的目标菌液提取得到目标质粒。在本发明中，所述侵染优选的以ef1α-eyfp-wpre-pa质粒载体与感受态大肠杆菌混合，更优选的为ef1α-eyfp-wpre-pa质粒载体与感受态大肠杆菌的浓度以10:1的比例混合；所述混合后优选在水浴20min后热激30s，加入soc培养基中，摇床培养0.5～1.5h，得目标菌液。在本发明中，所述水浴的温度优选的为35～40℃，更优选的为37℃；所述热激优选的在40～45℃水浴环境中进行，更优选的在42℃水浴环境中进行；在本发明中，所述摇床培养的温度优选的为35～40℃，更优选的为37℃；在本发明中，所述摇床的转速优选的为180～220rpm，更优选的为200rpm；在本发明中，所述摇床培养的时间优选的0.5～1.5h，更优选的为1h。
本发明在得到目标菌液后，取200μl所述目标菌液涂布在lb固体培养基上固体培养，挑取单菌落接种到lb液体培养基中，摇床培养过夜，离心，弃上清，提取目标质粒。在本发明中，所述固体培养的温度优选的为30℃，所述固体培养的时间优选的为24h；在本发明中，所述lb液体培养基中含有抗生素，所述抗生素优选为x-gal，所述抗生素的终浓度为20mg/ml；在本发明中，所述摇床培养的温度优选的为30℃；所述离心优选的为在40℃下离心，所述离心的离心力优选的为12000g，所述离心的时间优选的为30s；
所述离心后，本发明优选的利用质粒提取试剂盒提取ef1α-eyfp-wpre-pa质粒。本发明对所述质粒提取试剂盒并没有特殊限定。在本发明中，将提取得到的所述ef1α-eyfp-wpre-pa质粒浓度稀释到1μg/μl，双酶切所述ef1α-eyfp-wpre-pa质粒和il-4基因，所述双酶切使用的酶优选的为bamhi和xhoi，本发明对所述双酶切使用的酶的来源没有特殊限定，优选的来源于市售产品，所述双酶切的体系为同步双酶切，所述双酶切的程序为将1μlbamhi和1μlxhoi加入到2μl10×kbuffer制备成混合液，加入4μl浓度为1μg/μlef1α-eyfp-wpre-pa质粒和2μl浓度为1μg/μlil-4基因，并加入10μlddh2o构成20μl体系，充分混匀后在37℃条件下反应12小时。
得到酶切后的il-4基因和酶切后的ef1α-eyfp-wpre-pa质粒后，本发明将所述酶切il-4基因和酶切ef1α-eyfp-wpre-pa质粒进行连接，得到ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒。在本发明中，对得到的所述酶切后的il-4基因和酶切后的ef1α-eyfp-wpre-pa质粒优选的进行稀释，所述稀释优选的为利用ddh20进行，将所述酶切后的il-4基因优选的稀释到30～50ng/μl，更优选的为35～45ng/μl，最优选的为40ng/μl；将所述酶切后的ef1α-eyfp-wpre-pa质粒优选的稀释到80～120ng/μl，更优选的为90～110ng/μl，最优选的为100ng/μl。在本发明中所述连接优选的为利用连接酶进行连接，本发明中对所述连接酶没有特殊限定，优选的为t4连接酶。在本发明中，所述连接体系优选的为：5μlbuffer，0.5μl酶切ef1α-eyfp-wpre-pa质粒，2.5μl酶切il-4基因，1μl的t4连接酶和1μlddh2o；本发明将所述连接体系离心后连接，所述离心的离心力优选的为2000g，所述离心的时间优选的为30s，待所述连接体系充分混匀后连接，所述连接优选的在pcr仪上进行，所述pcr仪的温度优选的设定为16℃，所述连接的时间优选的为8～16h，更优选的为12～14h，得到ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒。
得到ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒后，本发明将所述ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒转化入感受态细胞，进行扩增培养，得到扩增后的重组ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒。在本发明中，所述ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒与感受态细胞的浓度比优选的为(8～12)：1，更优选的为(9～11)：1，最优选的为10:1。
在本发明中，所述转化优选的包括以下步骤：在水浴20min后热激30s，加入soc培养基中，摇床培养0.5～1.5h，得目标重组菌液。在本发明中，所述水浴的温度优选的为35～40℃，更优选的为37℃；所述热激优选的在40～45℃水浴环境中进行，更优选的在42℃水浴环境中进行；所述摇床培养的温度优选的为35～40℃，更优选的为37℃，所述摇床的转速优选的为180～220rpm，更优选的为200rpm，所述摇床培养的时间优选的0.5～1.5h，更优选的为1h，得到目标菌液。
本发明在得到目标菌液后，取200μl所述目标菌液涂布在lb固体培养基上固体培养，挑取单菌落接种到lb液体培养基中，摇床培养过夜，离心，弃上清，提取扩增后的重组ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒。所述固体培养的温度优选的为30℃，所述固体培养的时间优选的为24h，所述lb液体培养基中含有抗生素，所述抗生素为x-gal，所述抗生素的终浓度优选的20mg/ml，所述摇床培养的温度优选的为30℃；所述离心优选的为在40℃下离心，所述离心的离心力优选的为12000g，所述离心的时间优选的为30s，所述离心后优选的利用质粒提取试剂盒提取重组ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒，在本发明中，对所述质粒提取试剂盒并没有特殊限定。
得到扩增后的重组ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒后，本发明利用扩增后的重组ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒转染宿主细胞，转染后培养，构建得到重组腺相关病毒。在本发明中，所述宿主细胞用于包装重组病毒，所述宿主细胞优选的为hek293细胞，本发明对hek293细胞的来源没有特殊限定，优选的来源于市售产品，如购买的市售hek293细胞为冻存细胞，优选的将所述冻存细胞复苏后传代。在本发明中，所述复苏的步骤优选的包括：将所述冻存细胞水浴解冻后离心弃上清，洗涤后进行基础培养。在本发明中，所述水浴的温度优选的为35～40℃，更优选的为36～38℃，最优选的为37℃，所述水浴优选的在解冻完成，细胞呈悬液时结束，得到解冻好的细胞悬液。
将所述解冻好的细胞悬液离心，所述离心的离心力优选的为1000～1500g，更优选的为1050～1400g，最优选的为1200g，所述离心的时间优选的为6～15min，更优选的为8～12min，最优选的为10min；
本发明在所述离心后弃上清，得到细胞沉淀，洗涤所述细胞沉淀。在本发明中，所述洗涤优选的洗涤2～3次，更优选的为用pbs洗涤1～2次，再用dmem洗涤1次；所述pbs洗涤时，每次pbs的用量优选的为0.8～1.5ml，更优选的为1ml；所述dmem洗涤时，每次dmem的用量优选的为4～6ml，更优选的为5ml，洗涤后得细胞重悬液。
本发明将所述细胞重悬液进行基础培养，所述基础培养前优选的还包括离心，所述离心的离心力优选的为1000～1500g，更优选的为1100～1250g，最优选的为1200g，所述离心的时间优选的为6～15min，更优选的为8～12min，最优选的为10min，离心后弃上清，得到细胞沉淀后进行基础培养。在本发明中，所述基础培养的培养基优选的为dmem基础培养基，所述dmem基础培养基优选的还包括胎牛血清和双抗，所述胎牛血清的质量百分数为10％，所述双抗为青链霉素混合液，其中青霉素的含量为10000u/ml，链霉素的含量为10mg/ml，所述双抗的摩尔浓度为100μmol。所述基础培养优选的在培养箱中进行，所述培养箱优选的为co2培养箱，所述co2的体积浓度优选的为2～7％，更优选的为3～6％，最优选的为5％；所述培养箱的温度优选的为35～40℃，更优选的为36～38℃，最优选的为37℃。本发明所述基础培养，优选的每隔一段时间更换一次培养基，更优选的每隔24h更换一次培养基；
本发明待培养至细胞长满培养瓶底部时进行传代，所述传代优选的包括：弃去培养基，洗涤细胞，胰蛋白酶消化，停止消化后离心再洗涤，培养传代。在本发明中，所述洗涤的次数优选的为1～2次，更优选的为2次，所述洗涤优选的为用pbs洗涤。洗涤完成后进行胰蛋白酶消化，所述胰蛋白酶的质量浓度优选的为0.1～0.5％，更优选的为0.2～0.4％，最优选的为0.25％；所述消化的温度优选的为35～40℃，更优选的为36～38℃，最优选的为37℃；所述消化的时间优选的为6～10min，更优选的为7～8.5min，最优选的为8min。
消化结束后优选的加入dmem培养基使消化细胞悬浮，所述dmem培养基的用量为5ml，得到悬浮的消化细胞。在本发明中将所述悬浮的消化细胞离心后再洗涤，所述离心的离心力优选的为1000～1500g，更优选的为1100～1250g，最优选的为1200g；所述离心的时间优选的为6～15min，更优选的为8～12min，最优选的为10min；离心后弃上清，所述再洗涤优选的为再洗涤2次，所述再洗涤优选的为利用pbs进行洗涤；
洗涤后培养传代，所述培养传代用培养基优选的为dmem基础培养基，所述dmem基础培养基优选的还包括胎牛血清和双抗，所述胎牛血清的质量百分数为10％，所述双抗为青链霉素混合液，青霉素的含量为10000u/ml，链霉素的含量为10mg/ml，所述双抗的摩尔浓度为100μmol，所述基础培养优选的在培养箱中进行，所述培养箱优选的为co2培养箱，所述co2的体积浓度优选的为2～7％，更优选的为3～6％，最优选的为5％；所述培养的时间优选的为20～30h，更优选的为22～28h，最优选的为24h，培养完成后即完成一次传代；
在本发明中，所述传代的次数优选的为4次，得到t4代细胞。
本发明将所述t4代细胞接种于dmem培养基上，待细胞生长至对数生长期时，更换培养基为opti-mem培养基，培养0.8～1.5h后，得转染用t4代细胞。在本发明中，所述接种优选的为t4代细胞以60～80％的比例接种，更优选的为65～75％，最优选的为70％；所述dmem培养基优选的还包括胎牛血清和双抗，所述胎牛血清的质量百分数为10％，所述双抗为青链霉素混合液，青霉素的含量为10000u/ml，链霉素的含量为10mg/ml，所述双抗的摩尔浓度为100μmol；所述培养优选的在培养箱中进行，所述培养箱优选的为co2培养箱，所述co2的体积浓度优选的为2～7％，更优选的为3～6％，最优选的为5％。
培养得到的对数生长期细胞挑选细胞形态较均一，细胞边界清晰的细胞，更换培养基为opti-mem培养基进行培养，所述培养优选的在培养箱中进行，所述培养箱优选的为co2培养箱，所述co2的体积浓度优选的为2～7％，更优选的为3～6％，最优选的为5％；所述培养的时间优选的为0.8～1.5h，更优选的为1h，培养完成后，得到转染用t4代细胞；
在本发明中，将所述转染用t4代细胞与扩增后的重组ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa质粒，转染宿主细胞。在本发明中，所述质粒优选的进行稀释，所述稀释优选的为利用转染试剂稀释，更优选的用powerfect293转染试剂进行稀释；所述稀释优选的稀释至0.8～1.5μg/μl，更优选的为0.9～1.2μg/μl，最优选的为1μg/μl，将稀释后的质粒室温下放置20min后用于转染。
在本发明中，所述转染优选的为将所述稀释后的质粒与转染试剂加入到转染用t4代细胞中。在本发明中，所述稀释后的质粒与转染试剂的比例优选的为1μg：2μl。转染后培养8～12天，出现病毒空斑后进行病毒的纯化，构建完成重组腺相关病毒。在本发明中，所述培养的条件优选的为：培养温度35～40℃、体积浓度2～7％的co2；所述培养温度更优选的为37℃，所述co2的体积浓度更优选的为5％；所述培养时间优选的为5～8h，更优选的为6h。所述转染后培养的过程中，培养6h后吸取三分之一的培养基并补充等量的opti-mem新鲜培养基，往后每隔24h吸出二分之一的培养基，并补充等量的opti-mem新鲜培养基，换液前避免剧烈摇晃培养的细胞。在37℃，5％co2的条件下连续培养10天后，出现病毒空斑即完成构建重组腺相关病毒。
在本发明中，所述纯化前优选的还包括病毒颗粒富集的步骤，所述富集优选的为将上述得到的病毒空斑刮下，重悬后速冻，溶解后震荡。在本发明中，所述富集优选的富集于锥形管中。所述重悬前优选的还包括离心步骤，所述离心的离心力优选的为1000～1500g，更优选的为1100～1250g，最优选的为1200g，所述离心的时间优选的为6～15min，更优选的为8～12min，最优选的为10min，离心后弃上清，得到病毒沉淀；
本发明将所述病毒沉淀重悬，所述重悬优选的为利用全培液进行，所述全培液的用量为5ml，得到重悬的病毒；
本发明将所述重悬的病毒速冻，所述速冻优选的为利用液氮冻结，所述冻结的时间优选的为5min。本发明在冻结后再溶解收集，所述溶解优选的为37℃水浴溶解，所述溶解后优选的剧烈震荡。
在本发明中，将所述富集步骤重复4次后即可得到富集的病毒颗粒。
在本发明中，对所述富集的病毒颗粒进行纯化，所述纯化优选的利用cscl梯度浓度法，具体包括：将质量浓度为15％cscl和40％cscl加入beckman离心管中制备cscl梯度浓度溶液；将最终富集病毒颗粒的病毒上清滴加于cscl梯度溶液上；超速离心，30000rpm，4℃离心16个小时；离心后，收集位置较低，颜色较亮的条带中的活病毒颗粒。
在本发明中，优选的将纯化的病毒转入透析袋中进行透析，得到表达il-4的重组腺相关病毒。在本发明中，所述透析在4℃条件下，用600倍体积的10mmtris-hcl，ph8.0透析36小时。在本发明中，所述透析袋的参数优选的为3000～25000道尔顿，更优选的为8000～12000道尔顿，最优选的为10000道尔顿，透析后的病毒保存于-80℃冰箱。
下面结合实施例对本发明提供的表达il-4的重组腺相关病毒、制备方法及应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
il-4基因的克隆
(1)无菌条件下取出c57bl/6小鼠脾脏，用trizol法提取总rna；
(2)参照反转录试剂盒说明书的程序将提取的总rna反转录合成第一链cdna模板；
(3)根据小鼠il-4基因序列和的bamhi和xhoi双酶切克隆位点，设计il-4的pcr的引物：
上游引物：cgcggatccatgggtctcaacccccag(seqidno.1)
下游引物：ccgctcgagctacgagtaatccatttgcat(seqidno.2)
(4)在200μl的ep管中分别加入2μl的cdna模板，2μl的上游引物，2μl的下游引物，15μl的2xtranstaqhifipcrsupermix和9μl的ddh2o，按照以下循环条件进行pcr反应扩增il-4基因：95℃酶激活3min；95℃变性10s；72℃延伸10s，39个循环；
(5)上一步所得的pcr产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，并在凝胶分析系统上分析结果，结果如图1所示；
(6)在紫外灯下切出含有目的的琼脂糖凝胶，分离纯化出琼脂糖凝胶dna；
(7)对得到的dna进行测序，测序结果如图2所示。
实施例2
il-4基因与载体paav质粒连接与转化扩增
(1)将分离纯化出的il-4基因用分光光度计测定浓度，并用ddh2o将il-4基因稀释成40ng/μl；
(2)从汉恒公司购买携带有ef1α-eyfp-wpre-pa的质粒，将该质粒载体与感受态大肠杆菌以10:1的比例混合，37℃水浴20min，再42℃水浴热激30s，加入250μl的soc培养基，摇床200rpm、37℃培养1h。取200μl的菌液涂布在lb固体培养基上培养，30℃培养24h后，挑取单菌落接种到15ml含有2ml抗生素的lb液体培养基中，30℃摇床培养过夜，得到的培养物加入到1.5ml离心管中，在4℃下以12000g离心30s，弃上清，所得沉淀物按照小质粒提取试剂盒说明提取目标质粒；
(3)将40ng/μl的il-4目标基因及100ng/μl的所得质粒同时进行双酶切反应，取一个1.5ml的离心管依次加入5μlbuffer，0.5μl酶切好的ef1α-eyfp-wpre-pa质粒，2.5μl酶切好的il-4基因，1μl的t4连接酶和1μlddh2o，2000g离心30s，待充分混匀后在pcr仪上16℃过夜，将il-4基因连接到质粒载体上；
(4)将连接好的质粒载体与大肠杆菌在感受态大肠杆菌以10:1的比例混合，37℃水浴20min，再42℃水浴热激30s，加入250μl的soc培养基，摇床200rpm、37℃培养1h；
(5)取200μl的菌液涂布在含x-gal的平板培养基中，在37℃的培养箱中培养12h后，结果如图3所示，挑选出白色菌落接种到15ml含有2ml抗生素的lb液体培养基中，30℃摇床培养过夜，得到的培养物加入到1.5ml离心管中，在4℃下以12000g离心30s，弃上清，所得沉淀提取目标质粒；
(6)将上一步骤所得的质粒进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示，在紫外灯下切出含有目的质粒的琼脂糖凝胶，参照琼脂糖凝胶质粒回收试剂盒说明书回收目的质粒；
(7)以重组质粒dna为模板进行双向测序，测序结果如图5所示，测序后对其进行碱基表达峰值检测，结果如图6所示。
实施例3
aav病毒的包装
(1)用于包装病毒的hek293细胞由汉恒公司提供，将冻存的hek293细胞放入37℃水浴解冻，解冻好的细胞悬液以1200g离心10min，弃上清，并加入1ml的pbs洗涤细胞两次，将细胞转入10ml的离心管中，加入5mldmem基础培养基洗涤细胞，所得的细胞悬液以1200g离心10min，弃上清后加入5ml含有10％胎牛血清和100μmol双抗的dmem基础培养基。将细胞悬液转入75ml的培养瓶中，并补充10ml含有10％胎牛血清和100μmol双抗的dmem基础培养基，将细胞放入细胞培养箱中，在37℃，5％co2的条件下培养，每24h更换一次培养基。
(2)培养的细胞定期镜检观察，待细胞长满整个培养瓶底部时进行细胞传代，传代时先弃去培养基，并用pbs洗涤细胞两次，加入0.25％的胰蛋白酶在37℃孵育8min，加入dmem培养基终止消化，得到的细胞悬液以1200g离心10min，弃上清，并加入5ml的pbs洗涤细胞两次，并将细胞培养在含有10％胎牛血清和100μmol双抗的dmem基础培养基中。细胞在37℃，5％co2的条件下培养24h后，按上述步骤传代4次。
(3)上一步得到的细胞以70％的比例种植到含有10％胎牛血清和100μmol双抗的dmem基础培养基中。，待细胞处于对数生长期时，选择细胞形态较均一，细胞边界清晰的细胞，将基础培养基更换成opti-mem培养基，在37℃，5％co2的条件下培养，一小时后，将纯化好的质粒用powerfect293转染试剂稀释成1μg/μl的浓度，充分混匀，室温放置20min，将质粒-转染试剂混合液(质粒：转染试剂＝1μg:2ul)加入到opti-mem培养基中培养的细胞中。在37℃，5％co2的条件下培养6h后，吸出三分之一的培养基，并补充等量的opti-mem新鲜培养基。往后每隔24h吸出二分之一的培养基，并补充等量的opti-mem新鲜培养基，换液前避免剧烈摇晃培养的细胞。在37℃，5％co2的条件下连续培养10天后，出现病毒空斑即可用于病毒纯化。
(3)将上一步所得的细胞用细胞刮将细胞从瓶中刮下并移入50ml锥形管。离心后将细胞重悬于2ml全培液中，在液氮中冻结细胞5分钟，37℃水浴中溶解，剧烈振荡。此步骤共进行4次可得到富集的病毒颗粒。将15％cscl和40％cscl加入beckman离心管中制备cscl梯度溶液；将最终富集病毒颗粒的病毒上清滴加于cscl梯度溶液上；超速离心，30000rpm，4℃离心16个小时；离心后，用16号针收集位置较低，颜色较亮的条带中的活病毒颗粒。
(4)将纯化的病毒转入透析袋中，在4℃条件下，用600倍体积的10mmtris-hcl，ph8.0透析36小时。透析后的病毒保存于-80℃冰箱。
利用上述得到的重组腺相关病毒表达载体进行试验
实验例1
raav-ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa病毒体外转染hek293细胞试验：
将纯化好的病毒在hek293细胞中进行转染，hek293细胞由汉恒公司提供，按照实施例3的方法复苏hek293细胞，在细胞对数生长期时将纯化好的病毒以1.00e+10vg/ml的滴度加入到培养基中，转染12h、24h及48h后检测转染效率，转染结果如图7所示，在转染12h后有30％的细胞被转染，转染24h后有67％的hek293细胞被转染，转染48h后有73％的细胞被转染，表明纯化的病毒具有较高的转染效率。
实验例2
raav-ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa病毒转染原代培养的星形胶质细胞试验：
从出生后1天的c57bl/6小鼠中分离出大脑半球，在pbs环境中剥去大脑半球的脑膜组织，并用镊子将脑半球加成直径小于1mm的组织小块，将组织悬液用移液器转移至10ml无菌离心管中，600g离心5分钟，弃上清，并加入pbs洗涤细胞两次；加入0.25％的胰蛋白酶在37℃孵育8min，加入dmem培养基终止消化，得到的细胞悬液用70μm的滤膜过滤，所得滤液以1200g离心10min，弃上清，并加入5ml的pbs洗涤细胞两次，并将细胞培养在含有10％胎牛血清和100μmol双抗的dmem基础培养基中。待细胞在37℃，5％co2的条件下培养7天后，将纯化好的病毒以1.00e+10vg/ml的滴度加入到培养基中，转染12h、24h及48h后检测转染效率，转染结果如图8所示，表明病毒能够高效转染星形胶质细胞。
实验例3
raav-ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa病毒注射试验：
将纯化好的病毒以1.00e+11vg/ml尾静脉注射到c57bl/6小鼠体内，注射量为每只鼠1μl；
分别在病毒注射3、4周后用pfa灌注取脑，并将脑组织切成35μm厚的冠状切面，并将脑组织切片放在载玻片上用于荧光成像，检测病毒的表达效率，包装好的raav-ef1α-il-4-eyfp-wpre-pa在小鼠体内的转染结果如图9所示，该病毒能在小鼠的海马区有较高的转染率，包括齿状回(dg)和ca3区；
在冰上分离小鼠的大脑，将脑组织匀浆，用trizol法提取总rna，并进行反转录合成cdna,进行荧光定量实时pcr检测il-4基因及il-4受体基因的表达量变化，il-4基因的表达结果如图10所示，病毒注射组与对照相比，il-4在小鼠大脑中的表达量提高了12.5倍，il-4受体的基因表达量提高了2.45倍。
在冰上分离小鼠大脑，用组织蛋白裂解液提取脑组织的蛋白，用il-4及il-4r的elisa试剂盒做蛋白质水平的检测，il-4以及il-4受体蛋白质浓度检测如图11所示，病毒注射组与对照相比，il-4以及il-4受体的蛋白质浓度都显著提高。
实验例4
动物在实验环境一周后，采用慢性温和应激建立抑郁模型动物，从应激的第一天起，小鼠每天要遭受2～3种不同的温和应激，这些应激包括空瓶子(2小时)、斜笼子(24小时)、行为束缚(2小时)、食物剥夺(12小时)、水剥夺(12小时)、湿笼子(24小时)、空笼子(24小时)、昼夜颠倒(48小时)、全黑(24小时)、全白昼(24小时)、脏笼子(24小时)、频闪(12小时)、夹尾(10分钟)、电击(5次)；持续应激4周后进行行为学检测。
糖水偏好测试：
在慢性温和应激后4周后进行糖水偏好测试，实验前48小时，先让小鼠适应于1％的糖水，然后在开始测试前剥夺食物12小时，剥夺水6小时，在100ml的水壶里分别装入普通的水或1％的糖水，检查水壶是否有漏水情况，若有就及时更换，在鼠笼的一侧放入水，另一侧放入糖水，在两小时内分别记录每一只鼠的水和糖水的消耗量。然用以下公式：糖水摄取量/(糖水摄取量+水摄取量)×100％计算出每只鼠的糖水偏好。水和糖水的位置每周更换一次以避免小鼠的记忆惯性，实验结果如图14所示，结果表明il-4的过表达能够显著增加小鼠的糖水偏好。表明il-4的过表达能改善抑郁小鼠的快感缺乏。
自主活动测试：
在慢性温和应激3周后，将小鼠放入zz-6小鼠自主活动测试仪中适应1分钟，然后开启自动记录模式，记录10分钟内小鼠的运动次数以及站立次数，测试结果如图16所示，结果表明il-4的过表达不会影响小鼠的活动次数，该病毒是安全有效的。
悬尾实验：
在自主活动测试结束后1h进行悬尾实验，将小鼠的尾巴用胶带固定在30cm高的架子上，使小鼠保持倒立状态，小鼠除了尾巴外，其他部位不与任何物体相接触，保持小鼠头部离地面20厘米高，该过程持续6分钟，其间用高清摄像机记录，保存的视频通过双盲统计小鼠第一次放弃挣扎的时间以及在6分钟内一动不动的时间，测试结果如图13所示，结果表明il-4的过表达能够显著减少小鼠在悬尾测试中的一动不动时间，同时能够延长小鼠在悬尾测试中的潜伏期，进一步表明il-4的过表达能改善抑郁小鼠的行为绝望。
强迫游泳实验
在悬尾测试完成后12h进行强迫游泳实验，实验前24小时先将小鼠放到装有800毫升水的烧杯中，强迫小鼠游泳10分钟，让小鼠对水产生恐惧心理，24小时后再将小鼠放到同样的烧杯中，强迫游泳6分钟，在小鼠游泳过程中，全程用高清摄影机记录，保存的视频通过双盲统计小鼠第一次放弃挣扎的时间以及在最后4分钟内一动不动的时间，测试结果如图12所示，结果表明，il-4的过表达能够显著减少小鼠在强迫游泳测试中的一动不动时间，同时能够延长小鼠在强迫游泳测试中的潜伏期。表明il-4的过表达能改善抑郁小鼠的行为绝望。
毛色评价试验
在慢性温和应激4周后，对小鼠的头部、前颈、后颈、背部、腹部、前足、后足的毛色进行评分，评分标准为整齐和凌乱，每个部位的毛发整齐各得一分，所有部位毛发整齐共得7分。实验结果如图15所示，结果表明il-4的过表达能够显著增加小鼠的毛色评分，说明il-4的过表达能改善抑郁小鼠的情绪低落。
小鼠体重测试
在小鼠注射病毒前，对每只小鼠体重分别进行称量，按体重将小鼠分成四组，处理前保证各个组之间体重没有差异，在小鼠在慢性温和应激四周后，再次称量小鼠的体重，并统计和分析结果，实验结果如图17所示，结果表明il-4的过表达不会影响小鼠的体重。
由以上实施例可知，本发明提供的一种表达il-4的重组腺相关病毒，可在脑区内特异表达il-4蛋白，显著提高脑内il-4及il-4受体表达量，且对抑郁小鼠进行试验，发现本发明提供的表达il-4的重组腺相关病毒对抑郁小鼠有明显的治疗作用，且安全无毒，特异性强。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。