本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶--一种新型的海洋污染检测标记物。
技术背景
我国东海地区海域带处于海洋与陆地的过渡地带，陆地工农业生产、海洋产业开发等排放的废水多在此汇集。其中重金属、石油类(bap)等污染物易通过吸附等作用结合到悬浮颗粒物或胶体表面而被沉淀富集，会对底栖生物产生较大的影响。有研究表明，生物组织中标志物活性（含量）与环境中污染物含量呈一定相关性，因此，研究东海海域沉积物中污染物的含量变化，能够为筛选生物标志物提供基础数据，同时有利于初步掌握不同区域的污染特征和来源，对于应用生物标志物法评价周围人类活动对海域环境的生态压力有重要作用。
厚壳贻贝（mytiluscoruscus）俗称“海红”，隶属软体动物门、双壳纲、贻贝目，是一种栖息于海水中的常见双壳经济贝类，北至辽宁大连，南至福建东山均有分布，以浙江沿海资源量最大，其软体部蛋白质含量较高，鲜味氨基酸和必需氨基酸组成丰富，微量元素构成合理，属营养价值和经济价值都较高的海产贝类。但随着近年来沿海城市工业化进程的加速，厚壳贻贝繁殖的周边海域水质、环境因子持续恶化，生境污染不断加剧，作为一种典型的滤食性潮间带生物，厚壳贻贝因具有个体较大，生活史较长，活动性差，容易采集，对环境污染物（如重金属、病原微生物等）具有很强的耐受性等特征，常被作为环境指示生物来监测海区环境的变化。厚壳贻贝在解毒过程中会大量产生氧自由基，谷胱甘肽过氧化物酶（gpx）具有清除脂质过氧化物、过氧化氢，减轻有机氢过氧化物的功能，可以减少机体解毒过程中产生的活性氧自由基，防止细胞膜等生物组织受到氧化损伤。其在受到刺激后会做出相应的反应，应对环境对其产生的毒理效应。因此，可以选择厚壳贻贝的谷胱甘肽过氧化物酶作为检测海洋环境污染的指示分子。生物体在分子水平上的改变可以反应污染物对生物的早期作用，因而可作为灵敏的指标，用于检测污染对海洋生物个体、种群、生态系统的影响，从而达到预测海洋污染和保护海洋生物及生态系统的目的。同时，也可以应用到水产养殖业，用于检测水质的变化。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种通过基因克隆技术获得的厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因，其在厚壳贻贝的消化腺中的相对表达量最高，克隆用引物合适、能增大pcr反应的成功性，克隆用裂解液能够保持所得总rna的完整性、提高总rna的得率和纯度。
本发明的目的之而在于提供一种利用厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶用作新型海洋生物污染检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：
厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因，谷胱甘肽过氧化物酶基因为克隆基因，通过基因克隆技术获得。本发明通过基因克隆技术首次克隆出厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶的基因核心片段、全长及特异性引物；筛选出厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶在不同组织表达量的高低，其中消化腺相对表达量最高。
优选的，克隆方法的包括总rna提取、cdna第一链的合成、过氧化物酶基因核心片段pcr扩增、过氧化物酶基因race扩增全长、筛选、生物信息学分析，其特征在于：所述过氧化物酶基因核心片段pcr扩用引物为：gpx-real-f1:5’-gttagaggccgagctgaagc-3’；gpx-real-r1:5’-gttgtaacttttcaggtagt-3’。本发明谷胱甘肽过氧化物酶基因核心片段pcr扩用引物的长度、上下游引物长度的差对pcr反应的扩增较为合适，且上下游引物的tm值的差在5℃以内，能够有效避免引起非特异性扩増或扩增效率下降，增大pcr反应的成功性，提高鉴别结果的准确性和稳定性。
进一步优选，克隆方法具体包括如下步骤：
1）总rna提取：以厚壳贻贝作为材料，提取各组织总rna；
2）cdna第一链的合成：以步骤1获得的总rna样品作为模板，使用m-mlv反转录试剂盒进行cdna的反转录合成，获得cdna第一链；
3）基因核心片段pcr扩增：根据ncbi数据库中谷胱甘肽过氧化物酶基因的序列，分析氨基酸序列的保守区，使用primer5.0软件设计简并引物从而pcr扩增出谷胱甘肽过氧化物酶的基因核心序列，对存在目的条带的pcr产物进行纯化回收，备用；
4）race扩增全长：基于步骤3获得的基因序列，根据所得的目的序列进行了race引物的设计，利用race技术扩增得到5’端和3’端序列以及orf区的验证序列；
5）筛选：将步骤4获得的race反应产物连接至pmd18-t载体并转至dh5&感受态细胞中，涂板后挑取单克隆培养，菌液pcr验证后进行序列测定，获得谷胱甘肽过氧化物酶基因序列，由于前面测序得到的目的序列不完整以及目的pcr片段浓度较低达不到测序要求，因此需要对pcr片段进行克隆扩增；
6）生物信息学分析：将步骤5获得的基因序列，利用分子生物学expasy在线软件进行氨基酸序列的翻译，获得对应蛋白质的氨基酸序列生物信息学分析。该克隆方法能够有效得到谷胱甘肽过氧化物酶的基因序列和其编码蛋白质的氨基酸序列，同时能发现在厚壳贻贝的消化腺中谷胱甘肽过氧化物酶基因的相对表达量最高，而基因在消化腺中过量表达可以提高厚壳贻贝中p-糖蛋的表达量，从而可以提高厚壳贻贝对抗生存的水体环境中污染的能力，提高繁殖与生存能力，且可以用于检测海洋污染。
更进一步优选，总rna提取用混合裂解液，其中500ul混合裂解液含有490ultrizol、5ul4-喹啉醇和5uldl-泛醇。4-喹啉醇和dl-泛醇的特殊存在，在苯酚裂解细胞后，能够迅速和trizol液体中的苯酚、异硫氰酸胍、8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等物质发生增益作用，使细胞释放出的蛋白质迅速发生变性并抑制细胞释放出的rna酶活性，能够保持所得总rna的完整性，同时将促使核蛋白复合体的解离，使得总rna和蛋白质完全分离，并将总rna释放到溶液中，提高总rna的得率和纯度，即使组织起始量太少或者太多，也能保证trizol液体的裂解能力，得到目标总rna。
更进一步优选，pcr反应体系总体积25.0μl，其中ddh2o15.5μl、10×pcrbuffer2.5μl、20mmmgcl22.5μl、2.5mmdntp1.0μl、10μm引物各1.0μl、10μmsp-scap-f1.0μl、cdna1.0μl、rtaq酶0.5μl。
更进一步优选，pcr反应的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，获得pcr反应产物。
本发明还提供一种利用上述厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶用作新型海洋生物污染检测标记物，用厚壳贻贝作为检测海洋污染的生物样本，厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因用作海洋污染的检测标记物。本发明利用厚壳贻贝贝谷胱甘肽过氧化物酶基因用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用，同时因贝谷胱甘肽过氧化物酶基因具有灵敏性、易于检测分析，也可以用于厚壳贻贝的人工养殖，及时发现病害以及水质恶化，减少经济损失。
一种利用上述新型海洋生物污染检测标记物检测海洋生物污染的方法，通过对受到污染区域厚壳贻贝的解刨提取消化腺中的rna，反转录成dna，再利用荧光定量技术检测厚贝谷胱甘肽过氧化物酶基因在消化腺中的相对表达量，即可。厚壳贻贝贝谷胱甘肽过氧化物酶基因在消化腺中相对表达量最高，同时在重金属和lps刺激后，贝谷胱甘肽过氧化物酶基因在氧化过程中发生显著作用，其含量显著增高，利用该变化可以有效地检测海洋污染。
优选的，荧光定量技术检测的具体步骤为：根据已获得的厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因cdna全长序列，设计用于荧光定量分析所用引物，使用β-actin基因作为内参基因，配制25.0μlreal-timepcr反应体系，在荧光定量仪上设置反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，收集荧光信号，然后进行数据处理，即可得到厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶在消化腺中的相对表达量。荧光定量pcr是近年发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸技术，它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和pcr技术的有机结合，该步骤用引物与内参基因引物的退火温度相近，不能形成引物二聚体，不存在互补情况；厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶在消化腺中的相对表达量的值越大，海洋污染程度越大，反之，相对表达量的值越小，海洋污染程度越小。
进一步优选，β-actin为：actin-real-f1：cgatctgtccgaatacctccg；actin-real-r1：ccggcaagatccaacctcat。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）本发明首次通过基因克隆技术获得厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶，其生物信息学分析发现在厚壳贻贝的消化腺中谷胱甘肽过氧化物酶基因的相对表达量最高，可以用于检测海洋污染；2）本发明基因核心片段pcr扩用引物能够有效避免引起非特异性扩増或扩增效率下降，增大pcr反应的成功性，提高鉴别结果的准确性和稳定性；3）本发明总dna提取用裂解液能使细胞释放出的蛋白质迅速发生变性并抑制细胞释放出的rna酶活性，能够保持所得总rna的完整性，同时将促使核蛋白复合体的解离，提高总rna的得率和纯度；4）本发明利用厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因，谷胱甘肽过氧化物酶基因为克隆基因，通过基因克隆技术获得。通过基因克隆技术首次克隆出厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶的基因核心片段、全长及特异性引物；筛选出厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶在不同组织表达量的高低，其中消化腺相对表达量最高。
克隆方法的包括总rna提取、cdna第一链的合成、过氧化物酶基因核心片段pcr扩增、过氧化物酶基因race扩增全长、筛选、生物信息学分析，其特征在于：所述过氧化物酶基因核心片段pcr扩用引物为：gpx-real-f1:5’-gttagaggccgagctgaagc-3’；gpx-real-r1:5’-gttgtaacttttcaggtagt-3’。谷胱甘肽过氧化物酶基因核心片段pcr扩用引物的长度、上下游引物长度的差对pcr反应的扩增较为合适，且上下游引物的tm值的差在5℃以内，能够有效避免引起非特异性扩増或扩增效率下降，增大pcr反应的成功性，提高鉴别结果的准确性和稳定性。
克隆方法具体包括如下步骤：
1）总rna提取：以厚壳贻贝作为材料，提取各组织总rna，具体为：
取无rna酶的2mlep管，用的枪头加入500ul混合裂解液，用酒精泡过的镊子夹取组织样品溶于trizol液体中，电动匀浆器研磨直到组织完全溶解于液体中，补满trizol到1ml，4℃，12000rpm，10min离心，取上清液放进1.5mlep管中，不能吸到杂质，然后加入200ul的氯仿，剧烈震荡，室温静置5分钟，4℃，12000rpm，15min离心，取三层中的最上层液体到新的1.5mlep管中，加入500ul异丙醇，室温10min或-20℃过夜，然在4℃、12000rpm下离心10min，除去上清液，白色片状物即rna，再加入1ml的75%的乙醇，吹吸混匀，静置5min，然后在4℃，7500rpm下离心5min，除去上清液，干燥10min后加入20uldepc水，保存至-20℃备用；
总rna提取用500ul混合裂解液含有490ultrizol、5ul4-喹啉醇和5uldl-泛醇，4-喹啉醇和dl-泛醇的特殊存在，在苯酚裂解细胞后，能够迅速和trizol液体中的苯酚、异硫氰酸胍、8-羟基喹啉、β-巯基乙醇等物质发生增益作用，使细胞释放出的蛋白质迅速发生变性并抑制细胞释放出的rna酶活性，能够保持所得总rna的完整性，同时将促使核蛋白复合体的解离，使得总rna和蛋白质完全分离，并将总rna释放到溶液中，提高总rna的得率和纯度，即使组织起始量太少或者太多，也能保证trizol液体的裂解能力，得到目标总rna；
2）cdna第一链的合成：以步骤1获得的总rna样品作为模板，使用m-mlv反转录试剂盒进行cdna的反转录合成，获得cdna第一链，具体为：
0.2ml离心管中加入以下反应体系：总rna5.0ul、oligodt1.0ul，混匀后离心，并置于pcr仪内，设置温度为70℃，反应10min后立即取出，冰浴2min结束，然后加入rna处理物6.0ul、5×m-mlvbuffer2.0ul、depc处理水1.0ul、dntpmixture(10mm)0.5ul、rri(40u/ul)0.25ul、m-mlv(200u/ul)0.25ul，混匀后离心，于pcr仪内设定反应条件为42℃60min，70℃15min，结束后迅速取出冰浴15min，保存至-20℃备用；
3）基因核心片段pcr扩增：根据ncbi数据库中谷胱甘肽过氧化物酶基因的序列，分析氨基酸序列的保守区，使用primer5.0软件设计简并引物从而pcr扩增出谷胱甘肽过氧化物酶的基因核心序列，对存在目的条带的pcr产物进行纯化回收，备用，其中pcr反应体系总体积25.0μl，其中ddh2o15.5μl、10×pcrbuffer2.5μl、20mmmgcl22.5μl、2.5mmdntp1.0μl、10μm引物各1.0μl、10μmsp-scap-f1.0μl、cdna1.0μl、rtaq酶0.5μl，pcr反应的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，获得pcr反应产物；
4）race扩增全长：基于步骤3获得的基因序列，根据所得的目的序列进行了race引物的设计，利用race技术扩增得到5’端和3’端序列以及orf区的验证序列；
5）筛选：将步骤4获得的race反应产物连接至pmd18-t载体并转至dh5&感受态细胞中，涂板后挑取单克隆培养，菌液pcr验证后进行序列测定，获得谷胱甘肽过氧化物酶基因序列，由于前面测序得到的目的序列不完整以及目的pcr片段浓度较低达不到测序要求，因此需要对pcr片段进行克隆扩增；
6）生物信息学分析：将步骤5获得的基因序列，利用分子生物学expasy在线软件进行氨基酸序列的翻译，获得对应蛋白质的氨基酸序列生物信息学分析。该克隆方法能够有效得到谷胱甘肽过氧化物酶的基因序列和其编码蛋白质的氨基酸序列，同时能发现在厚壳贻贝的消化腺中谷胱甘肽过氧化物酶基因的相对表达量最高，而基因在消化腺中过量表达可以提高厚壳贻贝中p-糖蛋的表达量，从而可以提高厚壳贻贝对抗生存的水体环境中污染的能力，提高繁殖与生存能力，且可以用于检测海洋污染。
一种利用上述厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶用作新型海洋生物污染检测标记物，用厚壳贻贝作为检测海洋污染的生物样本，厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因用作海洋污染的检测标记物。本发明利用厚壳贻贝贝谷胱甘肽过氧化物酶基因用作海洋污染的检测标记物，该检测标记物特异性强，在分子水平上能够直接以生物体内靶细胞或靶分子为反应终点进行灵敏的生物学反应，对海洋污染物暴露和毒性效应有预警作用，同时因贝谷胱甘肽过氧化物酶基因具有灵敏性、易于检测分析，也可以用于厚壳贻贝的人工养殖，及时发现病害以及水质恶化，减少经济损失。
一种利用上述新型海洋生物污染检测标记物检测海洋生物污染的方法，通过对受到污染区域厚壳贻贝的解刨提取消化腺中的rna，反转录成dna，再利用荧光定量技术检测厚贝谷胱甘肽过氧化物酶基因在消化腺中的相对表达量，即可。厚壳贻贝贝谷胱甘肽过氧化物酶基因在消化腺中相对表达量最高，同时在重金属和lps刺激后，贝谷胱甘肽过氧化物酶基因在氧化过程中发生显著作用，其含量显著增高，利用该变化可以有效地检测海洋污染。
荧光定量技术检测的具体步骤为：根据已获得的厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因cdna全长序列，设计用于荧光定量分析所用引物，使用β-actin基因作为内参基因，其中β-actin为：actin-real-f1：cgatctgtccgaatacctccg；actin-real-r1：ccggcaagatccaacctcat，配制25.0μlreal-timepcr反应体系，在荧光定量仪上设置反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，收集荧光信号，然后进行数据处理，即可得到厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶在消化腺中的相对表达量。荧光定量pcr是近年发展起来的一种新的实时定量检测特定核酸技术，它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和pcr技术的有机结合，该步骤用引物与内参基因引物的退火温度相近，不能形成引物二聚体，不存在互补情况；厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶在消化腺中的相对表达量的值越大，海洋污染程度越大，反之，相对表达量的值越小，海洋污染程度越小。
实施例2：
厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因，谷胱甘肽过氧化物酶基因为克隆基因，通过基因克隆技术获得。
克隆方法的包括总rna提取、cdna第一链的合成、过氧化物酶基因核心片段pcr扩增、过氧化物酶基因race扩增全长、筛选、生物信息学分析，其特征在于：所述过氧化物酶基因核心片段pcr扩用引物为：gpx-real-f1:5’-gttagaggccgagctgaagc-3’；gpx-real-r1:5’-gttgtaacttttcaggtagt-3’。
克隆方法具体包括如下步骤：
1）总rna提取：以厚壳贻贝作为材料，提取各组织总rna，检测得总rna的a260/a280为1.91，说明该实施例总rna提取较为合适，除蛋白效果较好，得到的总rna纯度高；
2）cdna第一链的合成：以步骤1获得的总rna样品作为模板，使用m-mlv反转录试剂盒进行cdna的反转录合成，获得cdna第一链；
3）基因核心片段pcr扩增：根据ncbi数据库中谷胱甘肽过氧化物酶基因的序列，分析氨基酸序列的保守区，使用primer5.0软件设计简并引物从而pcr扩增出谷胱甘肽过氧化物酶的基因核心序列，对存在目的条带的pcr产物进行纯化回收，备用；
4）race扩增全长：基于步骤3获得的基因序列，根据所得的目的序列进行了race引物的设计，利用race技术扩增得到5’端和3’端序列以及orf区的验证序列，其中5’端含有156bp碱基，3’端序列含有220bp碱基，orf区的验证序列含有594bp碱基，能编码197个氨基酸；
5）筛选：将步骤4获得的race反应产物连接至pmd18-t载体并转至dh5&感受态细胞中，涂板后挑取单克隆培养，菌液pcr验证后进行序列测定，获得谷胱甘肽过氧化物酶基因序列；
6）生物信息学分析：将步骤5获得的基因序列，利用分子生物学expasy在线软件进行氨基酸序列的翻译，获得对应蛋白质的氨基酸序列生物信息学分析。
总rna提取用混合裂解液，其中500ul混合裂解液含有490ultrizol、5ul4-喹啉醇和5uldl-泛醇。
pcr反应体系总体积25.0μl，其中ddh2o15.5μl、10×pcrbuffer2.5μl、20mmmgcl22.5μl、2.5mmdntp1.0μl、10μm引物各1.0μl、10μmsp-scap-f1.0μl、cdna1.0μl、rtaq酶0.5μl。
pcr反应的程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，获得pcr反应产物。
一种利用上述厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶用作新型海洋生物污染检测标记物，用厚壳贻贝作为检测海洋污染的生物样本，厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因用作海洋污染的检测标记物。
一种利用上述新型海洋生物污染检测标记物检测海洋生物污染的方法，通过对受到污染区域厚壳贻贝的解刨提取消化腺中的rna，反转录成dna，再利用荧光定量技术检测厚贝谷胱甘肽过氧化物酶基因在消化腺中的相对表达量，即可。
荧光定量技术检测的具体步骤为：根据已获得的厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶基因cdna全长序列，设计用于荧光定量分析所用引物，使用β-actin基因作为内参基因，其中β-actin为：actin-real-f1：cgatctgtccgaatacctccg；actin-real-r1：ccggcaagatccaacctcat，配制25.0μlreal-timepcr反应体系，在荧光定量仪上设置反应程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，收集荧光信号，然后进行数据处理，即可得到厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶在消化腺中的相对表达量。厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶在消化腺中的相对表达量的值越大，海洋污染程度越大，反之，相对表达量的值越小，海洋污染程度越小。
实施例3：
采用15天龄厚壳贻贝作为监测水污染的生物样本，将厚壳贻贝分成2组，分为无污染对照组与待测水域组，将厚壳贻贝分别放入无污染水体和待测水域水体中饲养，每组3个平行进行，饲养7天后，每个平行取3个样品测定，每组测定3×3＝9个数据，将每组9个数据数理统计后得到各组厚壳贻贝的结果。
利用实施例2步骤测量厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶在消化腺中的相对表达量。检测结果：对照组在消化腺的相对表达量值分别为3.22和2.37，待测组在消化腺的相对表达量值为2.42和1.86，结果显示对照组的相对表达量值大于待测组的值，所以待测水域已经受到了污染，需及早进行水域治理，而化学的方法测试只能单一测试一种污染源，如测试镉浓度一般采用原子分光光度计法测试，原子分光光度计法先做标准曲线，然后制作样品再测试样品的吸光度后，在标准曲线上找去相应浓度，该方法误差大，并且只适合较大浓度测试，微量级浓度无法测试出；多氯联苯也是一般采用气质联用法测试，该方法成本高，误差相对本发明来说也较大。本发明所提到的空白组为所使用的试剂盒的空白对照，目的是为了减小误差。
对比例1：
厚壳贻贝谷胱甘肽过氧化物酶，克隆步骤中总rna提取用500ul裂解液为500ultrizol，其余和实施例2一致。该对比例1纯化回收得到的pcr反应产物远远低于实施例2，且检测得总rna的a260/a280为1.83，说明混合裂解液中4-喹啉醇和dl-泛醇的特殊存在，能够保持所得总rna的完整性，使得总rna和蛋白质完全分离，并将总rna释放到溶液中，提高总rna的得率和纯度。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。