一株青霉菌株及其应用的制作方法

文档序号：16270077发布日期：2018-12-14 22:11阅读：218来源：国知局

本发明涉及微生物应用技术领域，具体涉及一株能够拮抗真菌的青霉属菌株及其应用。

背景技术

植物病害是农业生产的大敌，据联合国粮农组织(fao)统计，谷物生产因病害损失10％，棉花生产因病害损失12％，全世界因有害生物所造成的经济损失高达1200亿美元，相当于中国农业总产值的一半。植物病害的发生不仅直接影响到我国农民的收入，还会影响到其他相关产业的发展，特别是农产品加工业。1880年，法国波尔多地区葡萄种植业因遭受霜霉病的危害而导致酿酒业濒临破产停业。最为严重的是不利于农业及其相关产业的长远和可持续发展。

目前，防治植物病害的主要手段为化学农药。由于采用化学农药进行植物病害防治见效快，杀菌谱广，成本低，使用简便等优点，使其在农业防治中迅速发展，成为防病丰产的有效手段之一。但是长期、反复和大量的使用化学农药存在着潜在的危害。不仅带来了环境污染和对人类健康的潜在危害，而且还带来了对非靶标生物的影响及植物病原菌抗药性的发展等问题，使得化学农药的发展受到了来自各不同方面的限制。寻找广谱、高效、低毒的生物农药已成为科研人员及农药使用者的共识。

镰刀菌属(fusariumlink.)为真菌中较大的一属。它广泛分布于自然界中，兼寄生或腐生生活。它是人类发现的最重要的植物病原菌之一。它可侵染多种植物(粮食作物、油料作物、经济作物，药用植物及观赏植物)，它们是植物维管束系统的寄生菌，在适宜的环境条件下，不但破坏作物的输导组织维管束，而且在菌体生长发育代谢过程中产生毒素危害作物，造成作物萎蔫死亡，影响产量和品质，严重时可导致产量显著下降。植物枯萎病是由镰刀菌寄生引起的一种世界性的真菌土传病害，在棉花、甘蔗、香蕉、番茄、黄瓜、冬瓜、西瓜、南瓜、西葫芦、甜瓜、丝瓜、白瓜等经济作物上发生较为严重(gordonetal，1991；ben-yephetetal，1994；schnerretal，2001)。导致这一病害的病原菌尖孢镰刀菌是一类既可侵染植物也可在土壤中生存的兼性寄生真菌。有些镰刀菌还可以产生真菌毒素，人畜食用后会造成食物中毒甚至死亡；有些菌株可直接侵染人和动物，造成严重的疾病；有的镰刀菌在自然界中可分解纤维素、降解有机物，对自然界的物质循环起着一定的作用；有些菌株可寄生在昆虫或其他真菌上，作为生防菌而被利用；有的菌株在一定培养条件下可产生激素，用于刺激动植物的生长发育。

炭疽病是由炭疽菌引起的一类植物病害的统称，该病害主要的危害是能够引起叶斑、枝枯、果实腐烂甚至死苗等。近年来，炭疽病的发生愈演愈烈，尤其是在一些高温湿热的地区，如热带和亚热带地区，病害的发生给许多蔬菜、果树、园林植物以及农作物等造成了极为严重的损失，己在世界范围内引起了普遍关注。炭疽菌属(colletorichum)内有约有590种，可危害许多种类的寄主，导致炭疽病害的发生，给世界各国的农业生产带来了很大的威胁。炭疽病是水果特别是热带水果的主要病害之一，在世界各水果产区广泛发生。病菌以分生孢子侵染植物的叶、梢、花穗、果，导致梢枯、叶斑、落叶和落果。炭疽菌具有潜伏侵染的特性，透过皮孔侵入进果实的附着孢，埋藏在表皮或角质层中，可进行长达数月的休眠。炭疽病菌于水果采前在田间潜伏侵染果实，采后很难控制，因而易导致贮运期间果实腐烂，缩短水果的商品货架期。目前控制水果炭疽病的方法主要是采前的品种抗性、果园的栽培管理条件、降雨量、气温其他因素，采后的气调贮藏、热处理，化学杀菌剂处理和生物防治等。

对炭疽病和镰刀菌的生物防治目前还没有成型的产品面市。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株青霉及其应用。本发明提供的青霉既能拮抗炭疽菌又能拮抗镰刀菌，所述青霉的培养物对炭疽菌和镰刀菌的拮抗率为70～94％。

本发明提供了一株青霉penicilliumsp.菌株，保藏编号为cgmccno.14141。

本发明还提供了上述技术方案所述青霉菌株在拮抗炭疽菌和镰刀菌中的应用。

本发明还提供了上述技术方案所述青霉菌株的培养物，所述培养物由上述技术方案所述青霉菌株经液体发酵培养获得；所述液体发酵培养包括以下步骤：

将所述青霉菌株接种于液体发酵培养基中，在溶氧47～65％的条件下发酵培养，得到青霉菌株培养物；

所述液体发酵培养基以不加琼脂的pda培养基为基准，还包括质量百分比为0.8～2％的麦芽提取粉。

优选的是，所述发酵培养的接种量为2～5％。

优选的是，所述发酵培养的时间4～7d。

优选的是，所述发酵培养在1～2d内，溶氧为50％～65％培养，之后溶氧为47％～65％培养。

优选的是，所述发酵培养的温度为26～31℃。

优选的是，所述发酵培养包括振荡培养，所述振荡培养的转速为110～145rpm/min。

本发明还提供了上述技术方案所述培养物的液体发酵培养方法，包括以下步骤：

将所述青霉菌株接种于液体发酵培养基中，在溶氧47～65％的条件下发酵培养，得到青霉菌株培养物；

所述液体发酵培养基以不加琼脂的pda培养基为基准，还包括质量百分比为0.8～2％的麦芽提取粉。

本发明还提供了上述技术方案所述培养物或上述技术方案所述培养方法得到的培养物在拮抗炭疽菌和镰刀菌中的应用。

本发明提供了一株青霉菌株，所述青霉菌株既能拮抗炭疽菌又能拮抗镰刀菌，且所述青霉菌株的有效拮抗培养物的获得可以通过液体发酵得到，拮抗效果好；且所得到的培养物对炭疽菌和镰刀菌的拮抗作用可以不依赖菌体的存在，对炭疽菌和镰刀菌的拮抗率高达70～94％。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的yanti45-2青霉菌株在genbank上进行blast基因比对结果图；

图2为本发明实施例1提供的yanti45-2青霉菌株nj系统树；

图3为本发明实施例7提供的青霉菌对峙炭疽菌和对峙镰刀菌平板试验结果图；

图4为本发明实施例7提供的青霉菌除去菌体培养物对镰刀菌的抑菌试验结果图。

具体实施方式

本发明提供了一株青霉penicilliumsp.菌株，保藏编号为cgmccno.14141。

本发明的青霉penicilliumsp.菌株命名为yanti45-2，该菌株于2017年7月24日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明所述青霉penicilliumsp.菌株的形态特征为：在pda上生长速度较慢(1mm/天)，产生橄榄绿色的分生孢子覆盖在生长后期的菌落表面；分生孢子梗在菌落上单独产生且分支不对称，有一些瓶梗(通常6-10)；分生孢子梗和分生孢子(4.7±1.3×3.5±0.6μm)从瓶梗处萌芽；分生孢子在瓶梗上呈链状排列，当一些孢子链聚集在一起形成一个柱状结构。

本发明提供的青霉penicilliumsp.菌株分离自森林的空气环境中，命名为yanti45-2，是首次发现的在空气中既能拮抗炭疽菌又能拮抗镰刀菌的青霉属菌株，它与之前报道的能拮抗炭疽菌的其它青霉属菌株不同，是分类意义上不同的新菌株，同时能在液体培养条件下产生有效拮抗炭疽菌和镰刀菌的物质，其拮抗作用在菌体存在以及不存在的情况下，对炭疽菌和镰刀菌都有拮抗作用。

通过分子鉴定，yanti45-2菌株是新的青霉属菌株。本发明对所述分子鉴定的方法和过程没有特殊的限定，采用常规新菌种鉴定方法即可。在本发明中，所述分子鉴定过程优选如下：

1.菌丝的培养、收集：

将pda固体培养基上生长的yanti45-2菌株菌丝接入pdb培养基中，28℃培养3-5d(视菌丝生长情况)离心收集菌体，分别称重后于-20℃保存；

2.ctab法提取菌株dna：

1)取1克菌丝放入研钵，加入液氮迅速研磨成粉末，转入7ml的离心管，加65℃预热的抽提液[2％(m/v)ctab，100mmol/ltris-hclph8.0，20mmol/edtaph8.0，1.4mo1/lnacl]2.5ml中，加疏基乙醇50μl，上下震荡，使蛋白质变性沉淀；

2)65℃水浴1h，每隔10min振荡1次，加入2.5ml的氯仿/异戊醇(24/1)混匀，除去蛋白质；

3)8000rpm，4℃离心10min，取上清到7ml管；

4)加1/5体积65℃预热的ctab/nacl混匀，加入2.5ml的氯仿:异戊醇(24:1)混匀；

5)10000rpm，4℃离心10min，取上清，加入2.5ml的ctab沉淀液，颠倒混匀。65℃水浴1.5h至沉淀可见；

6)12000rpm，4℃离心10min后，小心去除上清液；用0.5ml无菌水溶解沉淀10min；

7)加入0.25ml饱和酚和0.25ml氯仿:异戊醇(24:1)，混匀；

8)12000r/min，4℃离心10min，取上清，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀，-20℃冰箱放置30min；

9)12000r/min，4℃离心10min；弃上清，70％乙醇洗涤沉淀2次，自然风干，再用100μl无菌水溶解，加入0.5μlrnase，-20℃保存备用。

3.itspcr扩增

its1-5.8srdna-its2片段用通用引物its4和its5(whiteetal.，1990)扩增。其中用18srdna3'端引物作上游引物its5:5'-ggaaggtaaaagtcaagg-3'(seqidno.1)，用28srdna5'端引物作下游引物its4:5'-tcctccgcttattgatatgc-3'(seqidno.2)。反应体系为100μ1，含1×pcr反应缓冲液、1.5mmol/lmgcl2，0.2mmol/ldntps，0.5μmol/l的1对引物、100ng模板dna和5utaqdna聚合酶。扩增反应在pcr仪上进行，反应参数为:94℃变性3min然后为30轮循环，每个循环在94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30轮循环后，在72℃延伸7min，最后在4℃停止反应。

pcr产物用qiaquickpcr纯化试剂盒进行纯化。吸取pcr反应液置于1.5mleppendorf管中；加5倍体积的pb缓冲液，涡旋混匀；将上述混合液加入至qiaquick微型柱中，13000r/min离心30-60s；倒掉收集管中的废液，将微型柱重新放入收集管中；加0.75mlpe缓冲液至微型柱中，13000r/min离心30-60s；倒掉收集管中的废液，将微型柱重新放入收集管中，14000r/min离心1min；将微型柱放在一个新的eppendorf管中，加30μleb缓冲液或水，静止1min后13000r/min离心1min。纯化后的pcr产物，20℃保存备用。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统仪上观察并记录结果。

4.pcr产物琼脂糖凝胶电泳检测、序列测定及系统发育树建立

取琼脂糖0.24g，5％的tbe缓冲液30ml，在微波炉中加热，使琼脂糖充分溶解，倒胶，制成0.8％琼脂糖凝胶。pcr产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，溟化乙锭(eb)溶液(10mg/ml)染色后的dna在紫外灯下显示清晰的条带，在紫外灯下检测出its序列片段大小为1000bp-700bp左右。未纯化pcr产物交测序公司测序。

测得的its序列用软件dnaman将测得的反向序列编辑成反向互补的正向序列，再用软件mafft进行多重序列比对校正，最后运用软件mega5构建系统发育树。按照系统发育树中分支关系较近的菌种在genbank数据库中进行blast分析，将菌株的its序列和genbank中的相似序列进行比对，并下载相似性较高的菌株序列和外类群序列，将该菌株测得的的its序列和genbank中下载的相似性序列集成一组数据，再次用软件mega5.1将所有its序列clastalx1.83version进行多重序列比对校正，并用mega5建立系统发育树。

在本发明中，所述青霉penicilliumsp.菌株yanti45-2的its序列如seqidno.3所示。

本发明所述青霉yanti45-2的培养物能同时拮抗炭疽菌和镰刀菌；青霉yanti45-2的有效拮抗培养物的获得可以通过液体发酵得到，且拮抗效果好；相比于大部分现有青霉菌株，即能够解决现有青霉菌株通过液体发酵后培养物对炭疽菌的拮抗效果较差的问题，又能够解决现有青霉菌株通过固体培养获得，固体培养的效率较液体培养低的问题。本发明所述青霉yanti45-2能在液体培养条件下产生有效拮抗炭疽菌和镰刀菌的物质，这些物质存在于液体中，对炭疽菌和镰刀菌的拮抗作用可以不依赖菌体的存在；能够解决现有青霉菌株通过液体发酵后培养物对炭疽菌的拮抗效果较差或需要菌体同时存在才表现出拮抗能力的问题。

本发明还提供了上述技术方案所述青霉在拮抗炭疽菌和镰刀菌中的应用。

将所述青霉菌株接种于液体发酵培养基中，在溶氧47～65％的条件下发酵培养，得到青霉培养物；

所述液体发酵培养基以不加琼脂的pda培养基为基准，还包括质量百分比为0.8～2％的麦芽提取粉。

本发明将所述青霉菌株接种于液体发酵培养基中，在溶氧47～65％的条件下发酵培养，得到青霉菌株培养物；所述液体发酵培养基以不加琼脂的pda培养基为基准，还包括质量百分比为0.8～2％的麦芽提取粉，更优选为1％。在本发明中，所述液体发酵培养基和溶氧条件的设置能够保证青霉培养物具有较高的拮抗能力。在本发明中，所述发酵培养的接种量为2～5％，更优选为2％。在本发明中，所述发酵条件溶氧为47％～65％，所述发酵在1～2d内，优选溶氧为50％～65％培养，之后溶氧为47％～65％培养。在本发明中，所述发酵培养的时间4～7d。在本发明中，所述发酵培养的温度优选为26～31℃，更优选为28～30℃。在本发明中，用于接种的青霉种子液在制备过程中，优选在种子液体培养基中添加玻璃珠，所述种子液体培养基优选为液体pda培养基。本发明所述青霉菌株培养物包括含有菌体的青霉菌株培养物和不包括菌体的青霉菌株培养物，所述包括含有菌体的青霉菌株培养物和不包括菌体的青霉菌株培养物对炭疽菌和镰刀菌的拮抗作用均有效，当所述青霉菌株培养物为不包括菌体的青霉菌株培养物，本发明对所述菌体的过滤方法没有特殊的限定，采用常规滤菌方法即可。在本发明中，所述青霉菌株培养物对炭疽菌和镰刀菌的拮抗率为70～94％。本发明所述青霉菌株培养物的发酵过程优选在所述青霉菌株培养物对炭疽菌和镰刀菌的拮抗率超过70％时停止发酵。本发明对拮抗率的测定方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的体外平皿拮抗测定法即可。在本发明中，所述发酵培养优选包括振荡培养，所述振荡培养的转速为110～145rpm/min，当采用振荡培养方式进行发酵时，本发明优选在1～2d内，转速为110～145rpm/min培养，之后转速为105～145rpm/min培养。

本发明还提供了上述技术方案所述培养物的液体发酵培养方法，包括以下步骤：

将所述青霉菌株接种于液体发酵培养基中，在溶氧47～65％的条件下发酵，得到青霉菌株培养物；

所述液体发酵培养基以不加琼脂的pda培养基为基准，还包括质量百分比为0.8～2％的麦芽提取粉。

本发明对所述培养物的液体发酵培养方法的具体限定如上文所述。

本发明还提供了上述技术方案所述培养方法得到的青霉培养物在拮抗炭疽菌和镰刀菌中的应用。

下面结合具体实施例对本发明所述的一株青霉及其应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

菌株的获得：

本发明的菌株按空气微生物分离的常规普通方法进行分离、纯化培养获得，采用的分离用培养基为虎红培养基，经真菌its鉴定为penicilliumsp.，定名为yanti45-2。图1为yanti45-2青霉菌株在genbank上进行blast基因比对结果，图2为yanti45-2青霉菌株nj系统树，从图中可以看出yanti45-2菌株属青霉属菌株，yanti45-2青霉菌株与其它菌株存在明显的差异。

形态：在pda上生长速度较慢(1mm/天)，产生橄榄绿色的分生孢子覆盖在生长后期的菌落表面。分生孢子梗在菌落上单独产生且分支不对称，有一些瓶梗(通常6-10)。分生孢子梗和分生孢子(4.7±1.3×3.5±0.6μm)从瓶梗处萌芽。分生孢子在瓶梗上呈链状排列，当一些孢子链聚集在一起形成一个柱状结构。

yanti45-2菌株的培养：

液体发酵培养基：不加琼脂的pda+0.8～2％重量百分比麦芽提取粉：20％煮沸过滤的马铃薯汁1000升，葡萄糖20克，麦芽提取粉8～20克。

关键控制培养条件：液体培养时的溶氧控制在47～65％。

首先，无菌收集平板上培养的yanti45-2菌株孢子，将孢子接种到预先灭菌并含有玻璃珠的液体pda培养基中，28℃145rpm/min培养2～3天，视培养基中长满细小的菌丝球为止备用，此为青霉种子液。然后，将种子液无菌接入预先灭菌的液体培养基中，接入量为2～5％。26～31℃溶氧为47～65％培养或转速为105～145rpm/min振荡培养4～7天，溶氧为50％～65％或转速为110～145rpm/min培养1～2天，随后溶氧为47％～65％或转速为105～145rpm/min培养，测定培养液对炭疽菌和镰刀菌的拮抗率超过70％终止发酵。

实施例2