本发明涉及医学检验技术领域，属于聚合酶链式反应(pcr)技术领域核糖核酸(rna)类生物制品范畴，具体涉及一种传染类病毒rna类核酸定值质控物及其制备方法。
发明背景
以荧光定量pcr技术为代表的核酸扩增技术以其高灵敏度、强特异性在医学个分子诊断领域得到广泛应用。然而，出于没有建立生物核酸相应的生物含量、活性和特性测定的计量标准和溯源体系，各生产单位采用不同的标准品、对照品、试剂等进行产品的生产、研发和检测，使得这些产品的测定、评价结果没有计量特性，难以保证检测结果准确、有效；使得不同的实验室使用nat检测时，在量值、灵敏度和特异性方面差异很大。为减少检测的差异，并使不同实验室、不同方法检测的结果具有可比性，用于nat的定值质控物是实现体外诊断数据和结果准确一致、生物制品标准化及实验室质量控制的重要工具。
目前，英国国家生物制品检定所作为who指定的国际标准品实验室，是目前全世界最主要的国际标准品和参考品生产者和分发者，生产超过95％的国际标准品。而我国的质控物数量虽然较多，但品种不全、门类欠缺、结构不合理。品种主要集中在钢铁、地矿和建材等领域，在生物工程、食品成分、临床化学以及新材料、新能源等一些重要发展领域内的质控物则相对比较缺乏。相关质控物的研制相对滞后，使得不少产品的检测无法实现，不得不靠国外进口来满足实验室检测要求。由于这些进口质控物的生产者执行的管理体系不同，量值准确性和溯源性也不同，难以确保我国测量结果的有效性和一致性。随着国家对体外诊断试剂监督管理力度的加大和对检验技术要求的不断提高，对体外诊断试剂质控物的需求和依赖也越来越强烈。因此，加强体外诊断试剂质控物建设，不仅有利于诊断结果的准确一致，使各医院的检测结果具有可比性，而且也是做好体外诊断试剂技术监督的有力保证。
研制一经济而质量稳定、量值可靠的质控物，其稳定性考察是必不可少的过程，也是研制质控物的重要环节，也是本发明的重要部分。总之，为确保质控物有良好的稳定性，所考查及评价的稳定性能真正反映出该质控物稳定性能，使质控物能在有效期内发挥其作用。
技术实现要素：
本发明的目的是提供具有较高的使用价值的rna类核酸定值质控物，具体品种包括：人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)rna，丙型肝炎病毒(hcv)rna，风疹病毒(rv)rna，肠道病毒71型(ev71)rna，柯萨奇病毒a16(ca16)rna，乙型流感病毒(ivb)rna，甲型流感病毒(iva)rna，副流感病毒(piv)rna，a组轮状病毒(rta)rna。本发明的质控物具有靶值准确，具有可溯源性、稳定性和均匀性良好的特点。
为实现上述目的，以上所述质控物采用以下方法制备：
a)灭活处理：将临床阳性样本或微生物培养物放置60℃恒温水浴锅中，浸泡30分钟；
b)稀释液的配制：具体由10mmol/l～15mmol/l的β-巯基乙醇、0.05mol/l～0.1mol/l的8-羟基喹啉、2mol/l～5mol/l的醋酸钠、5％～10％[w/v]十二烷基肌氨酸钠、10％～15％[w/v]异硫氰酸胍，0.01mol/l～0.05mol/l的tris-hcl，0.01mol/l～0.05mol/l的乙二胺四乙酸，0.1％～0.5％[v/v]的triton-100，3％～8％[v/v]的丙三醇，0.08％～0.1％[w/v]叠氮钠组成；
c)初步定值：将已灭活处理的临床阳性样本或病毒培养物，采用实时荧光定量pcr法对待测质控物进行初步定值；
d)质控物的配制：利用rna保护剂稀释液将临床阳性样本/病毒培养物稀释成所需的浓度水平；其中，临床阳性样本/病毒培养物与rna保护剂稀释液的比例要大于1∶4；
e)分装：在万级洁净区内的ii级生物安全柜内进行分装，分装量每管0.5ml，分装完毕(-20±5)℃环境中保存；取样检验合格后方可进入下道工序；
f)分析性能评估：①均匀性评估；②稳定性评估：长期稳定性评估(-20℃)。
g)定值：利用已知标准物质进行比较定值，采用市场上应用比较广泛、试剂性能比较优良的3～5家核酸定量检测试剂盒对已知标准物质和待测质控物进行标准pcr检测，确定待测量值；
h)不确定度的评估：①不均匀性引入的不确定度评定；②稳定性引入的不确定度评定；③定值过程引入的不确定度评定(包括不确定度的a类评定和不确定度的b类评定)。
本发明的创新点在于：本发明得到的质控物为真实病毒样本，并非假病毒或质粒片段。临床检验上要获得可靠的测定结果就必须进行严格的室内质量控制，其中合格稳定的质控物是质量控制的重要前提，而rna病毒离体后容易受到外界环境的影响而降解，因此造成rna类质控物的不稳定性。本发明制备的rna类质控物无需冻干并能在室温环境下稳定8天或者在2～8℃环境下稳定32天，并在-20℃条件下保存12个月以上，可用于实验室的室内/室间质量控制，有效监控仪器状态、人员操作、试剂盒有效性等，保证检测结果的准确性和可靠性。
下面结合具体实施例方式对本发明进行说明，以使公众更好地理解本发明内容及应用。
具体实施方式
以下仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可很容易进行的改变或变化都涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。
实施例1
本实施例提供rna保护剂稀释液的配制方案(以100ml为例)
(1)用量筒量取40mldepc·h2o加入灭菌烧杯中；
(2)吸取0.1mlβ-巯基乙醇加入烧杯中，并搅拌均匀；
(3)吸取2.5ml8-羟基喹啉(2mol/l)加入烧杯中，并搅拌均匀；
(4)称取16.4g的醋酸钠加入烧杯中，并搅拌溶解；
(5)称取10g的十二烷基肌氨酸钠加入烧杯中，并搅拌溶解；
(6)称取15g的异硫氰酸胍加入烧杯中，并搅拌溶解；
(7)称取0.12g的tris-hcl加入烧杯中，并搅拌溶解；
(8)吸取10mlenda(0.5mol/l)加入烧杯中，并搅拌均匀；
(9)吸取0.5mltriton-100加入烧杯中，并搅拌均匀；
(10)吸取5ml丙三醇加入烧杯中，并搅拌均匀：
(11)称取0.1g的叠氮钠加入烧杯中，并搅拌溶解；
(12)用浓盐酸调ph值至4.8～5.2；
(13)把已经调好ph的溶液转移到100ml的容量瓶中，用depc.h2o定容到100ml；
(14)把配制好的溶液置于试剂瓶中，密封后高压灭菌，室温备用。
实施例2
本实施例提供rna类核酸定值质控物阴阳性样本制备方案。
(1)阴性血浆(血清)样本
筛选出外观性状外观包装完整，无破损，无渗漏。有明确标识，标明供血单位、供血者信息、制备时间、效期、体积、贮存条件等。融化后应呈淡黄色均一液体，无明显絮状沉淀物或大块沉淀的样本，而且污染性的测定(pcr法)结果为阴性。
将合格的阴性血浆经56℃60分钟灭活处理后，在一万级工作区内的ii级生物安全柜内用灭菌医用纱布过滤除去纤维蛋白，于-20±5℃环境中保存备用。
(2)阳性血浆(血清)样本
用pcr-荧光定量检测试剂盒筛选出阳性血浆(血清)，筛选出特性量值高的阳性血浆(血清)，进行合并，混合均匀。再用pcr-荧光定量检测试剂盒对混合后的阳性血浆(血清)定值，-80℃环境中冷冻保存备用。
(3)微生物阳性样本
将收获的病毒(细菌)液合并后，于60℃水浴放置30min作灭活处理。取1ml灭活处理后的病毒液进行培养观察，3-4天后，无明显生长现象，经pcr定量检测，培养后的病毒量没有增加，可认为病毒已灭活。
实施例3
本实施例提供hiv-1rna定值质控物的配制方案(以500ml为例)：
(1)吸取定值的hiv-1rna阳性血浆(均值约为：5.0e+04iu/ml)：100ml
(2)加入rna保护剂稀释液：400ml
(3)充分混匀，2～8℃暂存。
实施例4
本实施例提供hiv-1rna定值质控物的基质效应与互通性实验评估。
(1)实验样本
20份不同类型新鲜临床病人样本：选浓度值涵盖制备样品的高、中、低浓度范围、无已知稳定剂与防腐剂干扰物的样本，包含了血浆、血清不同类型临床样本；
制备物：人类免疫缺陷病毒1型核糖核酸(hiv-irna)血清(液体)质控物；
溯源性标准物质：whointernationalstandard3rdhiv-1internationalstandardnibsccode：10/152
(2)比对试剂盒：中山大学达安基因股份有限公司的人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)核酸定量检测试剂盒(pcr-荧光探针法)；
(3)评估试剂盒(目前使用量较大，特异性、精密度、灵敏度较好的试剂盒)
中山大学达安基因股份有限公司的人类免疫缺陷病毒1型核酸定量检测试剂盒(巢式pcr-荧光法)
凯杰生物工程(深圳)有限公司人类免疫缺陷病毒(hiv-1)核酸定量检测试剂盒(rt-pcr-荧光探针法)
(4)实验仪器：abi-7500荧光定量检测仪等。
(5)实验方法
①实验样品的处理
将待测制备物、溯源性标准物质和20份新鲜临床病人样本按相应的试剂盒说明书进行操作，重复测定3次，进行标准pcr扩增检测。
②数据分析
利用新鲜临床样品重复测定结果的均值做散点图，y轴为评估试剂盒结果，x轴为比对试剂盒结果。
线性回归分析方法如下：
-目视，评估试剂盒和比对试剂盒测定结果呈线性关系，无明显弯曲；在实验浓度范围内，临床样本的评估试剂盒测定值呈均匀分布。
-检查数据是否适合回归分析(参照最新版clsi/nccls文件ep6-定量测定方法的线性评估：统计方法)。
-将评估试剂盒测定临床样品结果的均值作为y值，达安试剂盒测定临床样品的均值作为x值，进行线性回归分析。
给定x值下(重复测量均值)，新鲜临床样品评估试剂盒测定均值y的双侧95％置信区间。
式中：
n-新鲜患者样本数量
g-常数项，线性回归时为2，二次回归时为3；
sy，x-回归标准误，计算公式为
利用以上方程，将比对试剂盒测定均值作为x轴，计算每个制备样本的y值的95％置信区间，如果评估试剂盒的测定均值落在该区间内，说明该制备样本对评估试剂盒无基质效应，表明该物质在比对试剂盒和评估试剂盒间具有互通性。
(6)实验结果
表1评估试剂盒的厂家为深圳凯杰
表2评估试剂盒的厂家为达安巢式试剂盒
实施例5
本实施例提供hiv-1rna定值质控物的均匀性初检实验。
1)仪器、试剂和样品
主要仪器：abi7500pcr检测仪；
主要试剂：中山大学达安基因股份有限公司的人类免疫缺陷病毒1型核酸定量检测试剂盒(巢式pcr-荧光法)；
样品：待分装质控物；
(2)检验方法
对分装前的hiv-1rna质控物，分别在瓶子的上中下层依次吸取3管样本用hiv-1核酸定量检测试剂盒(pcr-荧光法)进行检测，计算样本的均值和变异系数。根据方差分析方法判断是否均匀。
(3)均匀性检验结果
表3均匀性检验结果
实施例6
本实施例提供hiv-1rna定值质控物的均匀性试验。
随机抽取30管样本，每管样本检测3次，取样量为100μl，用人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)核酸定量检测试剂盒(pcr-荧光探针法)进行检测，采用方差分析方法对质控物进行均匀性分析。
采用的是随机顺序重复测量的方法，先将样品顺序编码，采用随机数表决定抽取样品的号码，作3次重复测定，测量方案如下：
重复测定1：
160-67-20-170-09-118-159-22-175-25-135-59-39-171-62-127-97-130-41-151-10-107-131-194-96-04-144-133-32-110
重复测定2：
97-144-10-59-170-171-96-130-25-22-159-110-32-20-09-39-107-133-67-41-131-04-160-127-118-62-151-175-194-135
重复测定3：
25-107-127-32-175-194-144-20-22-97-159-04-10-135-160-62-131-67-171-133-110-118-130-96-09-41-39-170-59-151
表4
表5方差分析
由f分布临界值表查的f0.05(30,60)＝1.65，而在均匀性实验中求得hiv-1rna定值质控物的f值小于f0.05(30，60)，所以可认为组内和组问无统计学差异。因此该质控物的样品是均匀的，符合要求。
实施例7
本实施例提供hiv-1rna定值质控物的长期稳定性试验。
长期稳定性实验关注的是在特定贮存条件下hiv-1rna定值质控物的稳定性状况。本研究贮存条件为-20±5℃，样品放置数量应足够检测至第14个月或更长时间，检测时间为第1、2、5、8、12、14......个月，每次抽取5管质控物，每管样品重复检测2次，计算均值，采用直线拟合法，进行稳定性监测。
从第三次稳定性检测开始，每次稳定性实验后进行统计学分析，用x代表时间，以y代表标准物质的特性值(浓度对数值均值)，拟合成一条直线，计算其斜率b1和截距b0。
其中自由度为n-2，显著水平p＝0.95(95％置信水平)的t因子数值：
表6
表7稳定性实验结果(-20±5℃环境)
结果与分析：对hiv-1rna定值质控物的-20±5℃贮存条件下稳定性结果进行分析，结果均小于对应的t0.05n-2因子的分位数，故认为斜率无显著差异，未观测到不稳定性，能满足实际测量的需要。考虑到运输条件等因素对质控物稳定性的影响，因此本质控物在-20±5℃下保存，可稳定12个月。
实施例8
本实施例提供hiv-1rna定值质控物的短期稳定性评估。
短期稳定性实验关注的是在特定运输条件下标准物质的稳定性。根据目前我国的运输条件，使用快递运输，货物2天内可以运送到我国主要城市。抽取合适量的标准物质样品，做好标记，分别放入指定环境中，按指定周期进行检验，具体如下：①2-8℃环境中，每2天或每3天检测一次，样品放置数量应足够检测至第32天或更长时间，每次抽取5管样品，每管样品重复检测2次；②室温(20～25℃)环境中，每天检测一次，样品放置数量应足够检测至第8天或更长时间，每次抽取5管样品，每管样品重复检测2次；③37℃环境中，每隔3小时抽取5管样品，放置-20℃下保存，样品放置数量应足够检测至第27个小时或更长时间。按试验计划要求，用人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)核酸定量检测试剂盒(pcr-荧光探针法)对产品进行检验。
(1)仪器、试剂和样品
主要仪器：abi7500pcr检测仪；
主要试剂：人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)核酸定量检测试剂盒(pcr-荧光探针法)；
样品：hiv-1rna质控物；
(2)实验结果
表8短期稳定性评估结果
结果与分析，本标准物质在-20±5℃环境中保存，可稳定12个月；在2～8℃保存，可稳定32天；在室温下保存，可稳定8天；在37℃下保存，可稳定27小时。
实施例9
本实施例提供hiv-1rna质控物的反复冻融实验。
(1)主要仪器、试剂和样品
主要仪器：abi7500pcr检测仪、tgl-18r高速冷冻离心机、tdl-5-a台式离心机、bsc-1500iia2-x生物安全柜、移液器等；
主要试剂：人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)核酸定量检测试剂盒；
样品：hiv-1rna质控物。
(2)实验方法
将-20℃保存的hiv-1rna质控物反复冻融10次后，用人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)核酸定量检测试剂盒进行检测，分析反复冻融10次对病毒载量的影响。
对照组：本质控物(5管)，于-20℃环境中保存。
实验组：本质控物(5管)于-20℃下放置，待质控物为冻结状态后取出，于室温放置，待质控物完全融化后又于-20℃下放置，重复上述反复冻融操作10次。
取以上对照组样本和实验组样本进行检测；按照试剂盒说明书进行标准pcr扩增检测，计算均值和标准差，对数据进行t检验分析。
(3)实验结果
表9反复冻融实验结果
由t检验结果可知，p＞0.05，反复冻融10次后的质控物的检测值与-20℃保存的质控物的检测值没有统计学差异，可认为本质控物能经受10次的反复冻融操作。
实施例10
本实施例提供hiv-1rna质控物的模拟运输实验。
(1)主要仪器、试剂和样品
主要仪器：abi7500pcr检测仪、tgl-18r高速冷冻离心机、tdl-5-a台式离心机、bsc-1500iia2-x生物安全柜、移液器等；
主要试剂：人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)核酸定量检测试剂盒；
样品：从配制好的质控物中分别随机抽取一定量的样品。
(2)实验方法
①样品运输方案
运输方式：同一个地区分为干冰运输和冰皇运输。
运输地区：四川、黑龙江、江苏。
运输：每个地区分别寄干冰和冰皇保存的质控物各1箱，每箱质控物5管。
要求各地区收到质控物后(不开箱)24小时内直接寄回公司总部。记录质控物从寄出到寄回公司本部的往返天数，寄回后的质控物应检查外观并及时测量箱内温度，测完温度后于-20℃保存。
②测定方法
对照组：于公司本部-20℃冰箱保存的质控物(没有经过运输)；
取对照组和三个地区寄回的质控物进行检测，每管检测一次，按照试剂盒说明书进行标准pcr检测。
③数据分析
分别计算出对照组和三个地区(两种保存方式)的质控物检测值的均值和标准差，将三个地区(两种保存方式)的质控物的均值与对照组均值进行t检验分析。
(3)实验结果
表10模拟运输实验结果
根据t检验结果可知，三个地区的两种保存方式的质控物检测均值分别与对照组比较，无统计学差异，可认为质控物经过常规时间运输后，质控物的稳定性无明显变化，说明质控物的稳定性良好，能满足市场的需求。
实施例11
本实施例提供hiv-1rna质控物的开瓶稳定性实验。
(1)主要仪器、试剂和样品
主要仪器：abi7500pcr检测仪、tgl-18r高速冷冻离心机、tdl-5-a台式离心机、bsc-1500iia2-x生物安全柜、移液器等；
主要试剂：人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)核酸定量检测试剂盒；
样品：从配制好的质控物中分别随机抽取一定量的样品。
(2)实验方法
抽取本质控物5管，分别于开瓶后0天、1周、2周、3周后进行检测，共检测4次，每次检测后质控物需盖紧管盖于-20℃保存，以开瓶后0天的检测数据为对照组，分析本质控物开瓶后的稳定性。
(3)实验结果
表11开瓶稳定性实验结果
由t检验结果可知，本质控物开瓶1周、2周、3周后的检测值与对照组比较，无统计学差异，可认为质控物稳定性没有变化。
实施例12
本实施例提供hiv-1rna定值质控物的定值试验以及不确定度评定试验。
(1)实验材料
①标本：国际标准物质whointernationalstandard3rdhiv-1internationalstandardnibsccode：10/152
待测人类免疫缺陷病毒1型核糖核酸(hiv-1rna)血清(液体)质控物
②主要仪器：abi-7500荧光定量pcr检测仪
③试剂：
中山大学达安基因股份有限公司的人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)核酸定量检测试剂盒(pcr-荧光探针法)
中山大学达安基因股份有限公司的人类免疫缺陷病毒1型核酸定量检测试剂盒(巢式pcr-荧光法)
凯杰生物工程(深圳)有限公司人类免疫缺陷病毒(hiv-1)核酸定量检测试剂盒(rt-pcr-荧光探针法)
(2)实验方法
抽取hiv-1rna定值质控物5管，结合国际标准物质whointernationalstandard3rdhiv-1internationalstandardnibsccode：10/152进行溯源比对，用市场上应用比较广泛、试剂性能比较优良的3种人类免疫缺陷病毒1型(hiv-1)核酸定量检测试剂盒(pcr-荧光探针法)对国际标准物质和现配制的质控物进行标准pcr检测。
表12三种试剂盒的检测均值(单位：iu/ml)
结果：将上面3种试剂盒的定值结果求均值，作为本质控物的标准值。由以上表格能够看出，这3种试剂盒的检测值的线性与相关性较好，计算出的待测样本浓度差别较小，所以该计算结果符合要求。
(3)最终不确定度的确定
总结上述构成质控物的不确定度u的各个部分，由下式列出：
表13
最终定值和不确定度：
表14