一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法与流程

本发明属于再生医学生物技术领域，具体地说，涉及一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法。

背景技术：

脐带间充质干细胞(mesenchymalstemcells,mscs)是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应用前景。脐带间充质干细胞(mscs)具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。它在骨，软骨，肌肉，肌腱，韧带，神经，肝，内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。

目前从脐带中分离间充质干细胞的主要方法有组合酶消化法和组织块贴壁法。酶消化法普遍采用0.25％胰蛋白酶+0.1％胶原酶i型等体积混合对剪碎的脐带组织进行过夜消化10-24小时，经过离心分离获得间充质干细胞基质层成分，接种于内表面处理后的培养耗材中，添加适量的干细胞完全培养基，放入二氧化碳培养箱5.0％37℃培养；其缺点是脐带间充质干细胞大部分被消化酶消化裂解，脐带组织只能利用一次，间充质干细胞获得率低，由于消化残留的血管内皮和表皮组织存在导致分离出的原代间充质干细胞纯度很低同时残留酶对细胞生长也有较大的抑制作用。

传统贴壁法，采用pbs液体或0.9％生理盐水反复多次洗净脐带组织中的脐带血后，采用组织粉碎机破碎或医用组织器械剪碎，直接贴壁到表面贴壁处理后的培养耗材中，加入干细胞完全培养基铺满包围所有贴壁组织块，放入二氧化碳培养箱5.0％37℃培养，每隔3-5天换一次液直至原代细胞长满(需要10-15天)；原代长满后，将贴壁的组织块废弃处理，原代细胞传代扩增培养；其缺点是由于没有去除脐带表皮组织和脐带内血管组织，脐带分离获得原代间充质干细胞的周期较大大延长(至少10-15天，原代干细胞才能达到传代扩增水平)，同时原代间充质干细胞长出伴随着大量的表皮细胞和血管内皮成纤维细胞，从而使目的细胞纯度大大很低，传统贴壁法贴壁一次后，贴壁脐带组织被废弃掉也导致脐带组织利用率很低，难以满足未来市场化的需求。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

步骤1、脐带采集与运输；

步骤2、脐带组织的预处理；

步骤3、对脐带华通胶组织块进行贴壁培养。

可选地，所述步骤1中的脐带采集与运输具体为：按照无菌操作要求采集脐带，符合脐带供者采集标准，长度不小于15厘米，保持完整，无针眼及破损，尽量避免脐带与其他物品接触，浸入采集瓶的保存液中，密封标注，4°低温转运箱尽快送往实验室，整个过程不超过12小时。

可选地，所述步骤2中的脐带组织的预处理具体为：

步骤2.1、提前半小时将生物安全柜开机，窗口调至工作位置等待绿色led“稳定气流”亮起，将脐带用止血钳从采集瓶中无菌取出，放入生物安全柜操作台内准备好的玻璃皿中，75％酒精浸没处理2分钟；

步骤2.2、用止血钳夹出脐带转移入新的皿中，0.9％生理盐水浸没清洗一遍，并用手术剪将脐带组织剪成2cm长组织块，用敷料镊挤出组织块中残留血液；

步骤2.3、用0.9％生理盐水反复清洗组织块，2-3次，直到浸没组织的生理盐水澄清透明；

步骤2.4、用2把组织镊将组织块的表皮组织和血管内皮组织剔除干净，保留华通胶组织，放入无菌的新皿中；直至所有的组织块处理完毕，用医用手术剪，将收集的华通胶组织剪碎成2-5mm的华通胶块，以备贴壁培养。

可选地，所述步骤3中的对脐带华通胶组织块进行贴壁培养具体为：

步骤3.1、配置间充质干细胞完全培养基；

步骤3.2、准备用于步骤2.4收集待贴壁华通胶组织块的t75cm²培养瓶，将华通胶组织块按间隔1-2cm间距贴在t75cm²培养瓶底面，放入37℃5.0％co2培养箱中孵育30分钟蒸发掉组织表面水分，促使组织块贴壁不容易脱落；

步骤3.3、将贴好华通胶组织快的t75cm²培养瓶从培养箱中取出，在生物安全柜内用10ml一次性血清移液管配上电动移液器吸取步骤3.1中配置的完全培养基，加液量10ml/t75cm²培养瓶盖好瓶盖，轻轻放入37℃5.0％co2培养箱中培养；

步骤3.4、每隔2-3天，对贴壁培养的培养瓶进行一次半换液或全换液，待贴壁华通胶组织块原代间充质干细胞生长密度达到85％以上，对原代间充质干细胞进行收集传代扩增培养，轻轻拍培养瓶是贴壁的组织块脱落，将培养瓶中的培养基和悬浮组织块收集到50ml无菌离心管中备用；再培养瓶中加入适量的0.9％生理盐水清洗贴壁的原代细胞，重复2遍，加入1ml0.125％胰酶消化2分钟，加入新鲜完全培养基中和，收集于新的50ml离心管用0.9％生理盐水稀释至50ml,离心1200rpm,5min弃上清，加完全培养基重悬按比例传代扩增培养；

步骤3.5、华通胶重复贴壁培养间充质干细胞原代细胞：将步骤3.4离心管中第一次贴壁原代细胞传代处理后的组织块，加入0.9％生理盐水反复清洗2遍，将组织块残余的培养液洗净，用70um或100um细胞筛滤干水分，以备进行再次贴壁；

步骤3.6、将步骤3.5中处理后的组织块，按照步骤3.2-3.5的要求重复操作，如此使每根脐带组织贴壁培养至少3-5次，即每根脐带在不同的培养阶段收获至少3-5批次的原代间充质干细胞。

可选地，所述步骤3.1中的配置间充质干细胞完全培养基具体为：将500mllonza无血清培养基、10mlpall血清替代物和5ml100xl-谷氨酰胺充分混合均匀，100x即每100ml培养基只需加1mll-谷氨酰胺，制备得到间充质干细胞完全培养基。

可选地，所述pall血清替代物经过0.2um针孔式滤器过滤。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明通过分离方法，探索一种高效连续，能够利用宝贵而有限的脐带组织，最大限度的提高脐带组织利用率以及间充质干细胞获得率、纯化率的同时，缩短间充质干细胞获得周期的方法和路径。

2)本发明方法采用物理分离方法预处理和反复多次贴壁法相结合，最大程度剔除脐带组织的表皮组织(外膜)及血管内皮组织(1根静脉和2根动脉)，仅保留富含间充质干细胞的华通胶组织，然后进行物理处理至2-5mm组织块贴壁加完全培养培养基37℃5.0％co2培养箱中孵育至原代间质细胞长满后，重新收集贴壁华通胶组织块，用0.9％生理盐水清洗掉残留的培养基后再次贴壁培养，如此反复3-5次贴壁培养。相比传统方法组织贴壁一次就不再利用，本发明方法同数量的脐带组织，间充质干细胞的获得率提高了3-5倍。

3)由于经过物理分离方法将华通胶组织外的成分最大程度的剔除，避免了表皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等杂细胞大量生长，极大提高了间充质干细胞的纯化率，同时每重复贴壁一次，原代细胞长出达到传代密度的周期呈明显递减缩，表明本发明具有缩短间充质干细胞获得周期的优势。

4)本发明方法中脐带组织的处理，全过程不涉及任何组织消化酶的使用，在保证脐带间充质干细胞获得周期短的同时，有效的避免了消化酶对原代细胞的生长抑制作用和消化酶对原代间充质干细胞的裂解影响。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明msc-001-1p0组织贴壁3天，原代细胞从组织块中爬出；

图2是本发明msc-001-1p0组织贴壁7天，原代细胞生长密度达90％，收集冻存或传代；

图3是本发明msc-001-2p0组织二次贴壁2天，原代细胞开始爬出；

图4是本发明msc-001-2p0组织二次贴壁5天，原代细胞生长密度达95％，收集冻存或传代；

图5是本发明msc-001-3p0组织三次贴壁1天，原代细胞爬出；

图6是本发明msc-001-3p0组织三次贴壁3天，原代细胞生长密度达97％，收集冻存或传代；

图7是本发明msc-002-1p0组织贴壁5天，原代细胞从组织块中爬出；

图8是本发明msc-002-1p0组织贴壁9天，原代细胞生长密度接近85％进行收集冻存或传代；

图9是本发明msc-002-2p0组织二次贴壁4天，原代细胞从组织块中爬出；

图10是本发明msc-002-2p0组织二次贴壁7天，原代细胞生长密度接近90％进行收集冻存或传代；

图11是本发明msc-002-3p0组织贴壁3天，原代细胞从组织块中爬出；

图12是本发明msc-002-3p0组织三次贴壁5天，原代细胞生长密度接近93％进行收集冻存或传代；

图13是本发明msc-003-1p0组织贴壁4天，原代细胞从组织块中爬出；

图14是本发明msc-003-1p0组织贴壁8天，原代细胞生长密度接近88％进行收集冻存或传代；

图15是本发明msc-003-2p0组织二次贴壁3天，原代细胞从组织块中爬出；

图16是本发明msc-003-2p0组织二次贴壁6天，原代细胞生长密度接近92％进行收集冻存或传代；

图17是本发明msc-003-3p0组织三次贴壁2天，原代细胞从组织块中爬出；

图18是本发明msc-003-3p0组织三次贴壁4天，原代细胞生长密度接近94％进行收集冻存或传代。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明所用到的材料如下：

pbs无菌组织保存液、脐带采集瓶(100ml广口瓶)、采血管(母体留血样)、采集交接单、低温恒温转运箱；

0.9％生理盐水、75％医用酒精、医用手术剪、组织镊、敷料镊、止血钳、90mm玻璃皿若干(以上物品均为无菌要求)，生物安全柜；

co2培养箱、低速离心机、t75cm²培养瓶(透气表面预处理)、移液管、离心管、lonzaultraculture^tm、pallultroser^tm、l-谷氨酰胺(100x)、0.125％胰酶。

本发明公开了一种从脐带组织中分离间充质干细胞的方法，包括以下步骤：

步骤1、脐带采集与运输：严格按照无菌操作要求采集脐带(符合脐带供者采集标准)，长度不小于15厘米，保持完整，无针眼及破损，尽量避免脐带与其他物品接触，浸入采集瓶的保存液中，密封标注，4度低温转运箱在2-12小时内尽快送往实验室。

步骤2、脐带组织的预处理——gmp标准层流实验室中生物安全柜中进行：

步骤2.1、提前半小时将生物安全柜开机，窗口调至工作位置(250mm开口)等待绿色led“稳定气流”亮起，将脐带用止血钳从采集瓶中无菌取出，放入生物安全柜操作台内准备好的玻璃皿中，75％酒精浸没处理2分钟；

步骤2.2、用止血钳夹出脐带转移入新的皿中，0.9％生理盐水浸没清洗一遍，并用手术剪将脐带组织剪成1-2cm长组织块，用敷料镊挤出组织块中残留血液；

步骤2.3、用0.9％生理盐水反复清洗组织块，2-3次，直到浸没组织的生理盐水澄清透明；

步骤2.4、用2把组织镊将组织块的表皮组织(外膜)和血管内皮组织(2根动脉、1根静脉)剔除干净，保留华通胶组织，放入无菌的新皿中；直至所有的组织块处理完毕，用医用手术剪，将收集的华通胶组织剪碎成0.5cm-2cm的华通胶块，以备贴壁培养；

步骤3、脐带华通胶组织块反复多次贴壁培养：

步骤3.1、间充质干细胞培养基准备：lonza无血清培养基500ml/瓶+10mlpall血清替代物+5mll-谷氨酰胺(100x)充分混匀；100x即每100ml培养基只需加1mll-谷氨酰胺；

步骤3.2、准备用于步骤2.4收集待贴壁华通胶组织块的t75cm²培养瓶(透气表面预处理)，将组织块按间隔0.5cm-5cm间距贴在培养瓶底面，放入37℃5.0％co2培养箱中孵育10-30分钟蒸发掉组织表面水分，促使组织块贴壁不容易脱落；

步骤3.3、将贴好华通胶组织快的t75cm²培养瓶从培养箱中取出，在生物安全柜内用10ml一次性血清移液管配上电动移液器吸取步骤3.1中配置的培养基，加液量10ml/t75cm²培养瓶(加液过程中避免液体将组织块悬浮起来)盖好瓶盖，轻轻放入37℃5.0％co2培养箱中培养；

步骤3.4、每隔2-3天，对贴壁培养的培养瓶进行一次半换液或全换液，待贴壁华通胶组织块原代间充质干细胞生长密度达到85％以上，对原代间充质干细胞进行收集传代扩增培养：轻轻拍培养瓶是贴壁的组织块脱落，将培养瓶中的培养基和悬浮组织块收集到50ml无菌离心管中备用；再培养瓶中加入适量的0.9％生理盐水清洗贴壁的原代细胞，重复2遍，加入1ml0.125％胰酶(提前复温)消化2分钟，加入新鲜完全培养基中和，收集于新的50ml离心管用0.9％生理盐水稀释至50ml,离心800-1200rpm,5min弃上清，加培养基重悬按比例传代扩增培养；

步骤3.5、华通胶重复贴壁培养间充质干细胞原代细胞：将步骤3.4离心管中第一次贴壁原代细胞传代处理后的组织块，加入0.9％生理盐水反复清洗2遍，将组织块残余的培养液洗净，用70um或100um细胞筛滤干水分，以备进行再次贴壁；

步骤3.6、将步骤3.5中处理后的组织块，按照步骤3.2、3、4、5具体步骤要求重复操作，如此可使每根脐带组织贴壁培养至少3-5次，即每根脐带可在不同的培养阶段收获至少3-5批次的原代间充质干细胞。

实施例设计：采集准备一根脐带(选择输血五项(乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等均为阴性)、无遗传病史、精神疾病史等，采集过程无菌操作放入采集保存液)，均分为等长的3段，其中1段立即分离处理，剩下两段置于2-8℃冰箱保存液中分别存放10小时、4小时后再按所设计的实施例进行处理。分别用于实施例1、实施例2、实施例3的比对实验，减少脐带来源个体化差异对实验结果数据分析的影响因素)。

实施例1脐带分离编号msc-001

①脐带预处理：选择输血五项(乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等均为阴性)、无遗传病史、精神疾病史等，采集过程无菌操作放入采集保存液，2-8℃冷链运输2小时内送达实验室，将脐带等分为3段，其中1段立即分离处理。

②脐带分离处理：75％医用酒精浸泡处理后，pbs缓冲液或0.9％生理盐水洗涤2-3次，洗净脐带表面及血管中脐血，医用剪刀剪成2cm组织段，分离表皮组织及血管内皮组织，仅保留华通胶部分；

③华通胶组织用pbs缓冲液或0.9％生理盐水洗涤干净，晾干水分剪成0.5cm*0.5cm组织块，贴壁于培养瓶(内表面预处理)底面，组织块间隔2cm间距，放入37℃5.0％co2培养箱孵育30min，促使贴壁不脱落，加入完全培养基浸慢组织块为宜，标注：msc-001-1p0(msc-001脐带第1次贴壁原代培养)放入37℃5.0％co2培养箱培养；

④msc-001-1p0长满后，收集原代细胞冻存或传代，组织块进行二次贴壁msc-001-2p0(二次贴壁原代细胞)放入37℃5.0％co2培养箱培养；

⑤重复④步骤可反复贴壁3次，获得3批次的原代细胞。

实验结果见图1-图6,实施过程中的脐带组织在2小时内采集完成送达实验室分离处理，分离获得0.5cm*0.5cm华通氏胶组织块，在37℃5.0％co2培养箱孵育30min，进行3次贴壁培养，实验结果见表1，随着贴壁次数的增加，原代细胞的爬出时间、生长融合度满足传代或冻存条件的扩增时间均出现规律性的递减(缩短)，同时原代细胞生长融合度(生长密度)出现规律性的升高。

表1实施例1贴壁后原代细胞爬出时间、融合度时间及生长密度的变化

实施例2脐带分离编号msc-002

①脐带采集：脐带预处理：选择输血五项(乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等均为阴性)、无遗传病史、精神疾病史等，采集过程无菌操作放入采集保存液，2-8℃冷链运输2小时内送达实验室，将2小时采集回来的脐带组织，置于含组织保存液的无菌密封容器中在2-8℃冰箱保存10小时后取出分离处理；

②脐带分离处理：75％医用酒精浸泡处理后，pbs缓冲液或0.9％生理盐水洗涤2-3次，洗净脐带表面及血管中脐血，医用剪刀剪成2cm组织段，分离表皮组织及血管内皮组织，仅保留华通胶部分；

③华通胶组织用pbs缓冲液或0.9％生理盐水洗涤干净，晾干水分剪成2cm*0.5cm组织块，贴壁于培养瓶(内表面预处理)底面，组织块间隔5cm间距，放入37℃5.0％co2培养箱孵育10min，促使贴壁不脱落，加入完全培养基浸慢组织块为宜，标注：msc-002-1p0(msc-002脐带第1次贴壁原代培养)放入37℃5.0％co2培养箱培养；

④msc-002-1p0长满后，收集原代细胞冻存或传代，组织块进行二次贴壁msc-002-2p0(二次贴壁原代细胞)放入37℃5.0％co2培养箱培养；

⑤重复④步骤可反复贴壁3-5次，获得3-5批次的原代细胞。

实验结果见图7-图12,实施过程中的脐带组织在采集12小时后实验室分离处理，分离获得2cm*0.5cm华通氏胶组织块，间隔5cm贴壁在37℃5.0％co2培养箱孵育10min,进行3次贴壁培养过程中，出现约30％贴壁华通胶组织漂浮现象，漂浮区域原代细胞未能爬出，分析原因与贴壁处理时37℃5.0％co2培养箱孵育时间过短导致贴壁不牢以及组织块过大有很大关系，如表2所示，原代细胞从贴壁块中的爬出时间与实施例1对比，明显时间周期增加，原代细胞生长融合度也较实施例1有较大差距分析原因与脐带采集后送达实验室的时间过长和贴壁块过大、贴壁间隔较大有直接关系。对比数据间下表：

表2实施例2与实施例1第一、第二次贴壁比对

实施例3脐带分离编号msc-003

①脐带采集：选择输血五项(乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等均为阴性)、无遗传病史、精神疾病史等，采集过程无菌操作放入采集保存液，2-8℃冷链运输2小时内送达实验室，将2小时采集回来的脐带组织，置于含组织保存液的无菌密封容器中在2-8℃冰箱保存4小时后取出分离处理；

②脐带分离处理：75％医用酒精浸泡处理后，pbs缓冲液或0.9％生理盐水洗涤2-3次，洗净脐带表面及血管中脐血，医用剪刀剪成2cm组织段，分离表皮组织及血管内皮组织，仅保留华通胶部分；

③华通胶组织用pbs缓冲液或0.9％生理盐水洗涤干净，晾干水分剪成1cm*0.5cm组织块，贴壁于培养瓶(内表面预处理)底面，组织块间隔1cm间距，放入37℃5.0％co2培养箱孵育20min，促使贴壁不脱落，加入完全培养基浸慢组织块为宜，标注：msc-003-1p0(msc-003脐带第1次贴壁原代培养)放入37℃5.0％co2培养箱培养；

④msc-003-1p0长满后，收集原代细胞冻存或传代，组织块进行二次贴壁msc-003-2p0(二次贴壁原代细胞)放入37℃5.0％co2培养箱培养；

⑤重复④步骤可反复贴壁3-5次，获得3-5批次的原代细胞。

实验结果见图13-图18,实施过程中的脐带组织在采集6小时后实验室分离处理，分离获得1cm*0.5cm华通氏胶组织块，间隔1cm贴壁在37℃5.0％co2培养箱孵育20min,进行3次贴壁培养过程中，出现5％贴壁华通胶组织漂浮现象，漂浮区域原代细胞未能爬出，分析原因与贴壁处理时37℃5.0％co2培养箱孵育时间不足以及贴壁间隔过低有直接关系，原代细胞从贴壁块中的爬出时间、贴壁融合时间、细胞融合密度与实施例1、实施例2对比见表3，可得出以下结论：

第一，脐带组织从采集到分离处理的时间间隔越短(2小时内)和分离贴壁的华通氏胶直径越小(0.5*0.5cm)，对于原代细胞分离提取周期越短，所培养的原代细胞生长密度(融合度)也越高；

第二，贴壁的脐带华通氏胶之间合理的间隔距离(2cm)、贴壁孵育时间(30min)对于原代细胞的长出周期以及融合密度周期有促进作用。

表3实施例3与实施例1、实施例2，第一、第二次贴壁比对

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。