一株吉氏库特菌及其在拆分1-苯基-1，2-乙二醇中的应用的制作方法

本发明属于生物化工领域，特别涉及一株吉氏库特菌及其在拆分1-苯基-1，2-乙二醇中的应用。

背景技术：

手性邻位二醇是有机合成中极为重要的手性合成子，可进一步转化为许多具有生物活性的化合物，因而在医药、农药、化妆品等行业具有非常广阔的应用前景。(r)-1,2-苯基乙二醇是光学活性药物β-肾上腺素阻断剂(r-硝基心定，抗心律失常药)等的重要合成子；(r)-4-氯苯基乙二醇是合成神经保护药物eliprodil(依利罗地)的关键性手性合成子；(s)-苯乙二醇可以作为液晶材料的手性添加剂，用于缩短液晶面板的响应时间。

用于制备手性1,2-苯基乙二醇的生物法主要包括：环氧化物水解酶水解环氧化物，羰基还原酶还原相应的酮和醇脱氢酶或脂肪酶拆分外消旋的对映体。

在上述主要方法中，应用全细胞动力学拆分外消旋的1-苯基-1，2-乙二醇已经被报道。然而普遍存在反应底物的浓度底的缺点。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株吉氏库特菌。

本发明的另一目的在于提供所述吉氏库特菌在拆分1-苯基-1，2-乙二醇中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一株吉氏库特菌，名称为吉氏库特菌(kurthiagibsonii)sc0312，保藏号为cctccno：m2017157，该菌株于2017年3月31日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(cctcc)。

所述的吉氏库特菌的16srdna序列如下(seqidno.1)所示：

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一种培养所述的吉氏库特菌的方法，具体步骤为：将吉氏库特菌接种于种子培养基中进行培养，再转接到发酵培养基中进行扩增培养。

所述的种子培养基的组成如下：蛋白胨5～10g，酵母粉3～10g，氯化钠5～10g，加蒸馏水至1l，ph6.0～7.0。

所述的发酵培养基的组成如下：蛋白胨5～10g，酵母粉3～10g，氯化钠5～10g，加蒸馏水至1l，ph6.0～7.0。

所述的种子培养基中培养的条件为：在30～37℃条件下培养10～12h；优选为：在转速150～180rpm、30～37℃条件下培养10～12h。

所述的扩增培养的条件为：在30～37℃条件下培养12～16h；优选为：在转速150～180rpm、30～37℃条件下培养12～16h。

所述的吉氏库特菌在催化合成光学手性化合物中的应用。

所述的吉氏库特菌在拆分1-苯基-1，2-乙二醇中的应用，该菌株可用于拆分外消旋的1-苯基-1，2-乙二醇制备对映体(s)-1,2-苯基乙二醇。

所述的吉氏库特菌在拆分1-苯基-1，2-乙二醇中的应用，通过如下步骤实现：

(1)将吉氏库特菌进行扩增培养，然后在4℃条件下离心，得到静息细胞；

(2)将静息细胞悬浮于磷酸盐缓冲液中，然后加入底物1-苯基-1，2-乙二醇进行催化反应，得到(s)-1,2-苯基乙二醇。

步骤(1)中所述的扩增培养优选为通过如下步骤实现：将吉氏库特菌接种于种子培养基中进行培养，然后将其转接到发酵培养基中进行扩增培养。

所述的种子培养基或发酵培养基的组成如下：蛋白胨5～10g，酵母粉3～10g，氯化钠5～10g，加蒸馏水至1l，ph6.0～7.0。

所述的种子培养基中培养的条件为：在30～37℃条件下培养10～12h；优选为：在转速150～180rpm、30～37℃条件下培养10～12h。

所述的扩增培养的条件为：在30～37℃条件下培养12～16h；优选为：在转速150～180rpm、30～37℃条件下培养12～16h。

步骤(2)中所述的反应体系中1-苯基-1，2-乙二醇的终浓度为20～80mm，吉氏库特菌添加量以湿重计为15～30mg/ml。

步骤(2)中所述的磷酸盐缓冲液为ph5.0～8.5的磷酸缓冲液；优选为ph6.0～7.0的磷酸缓冲液(100mm)。

所述的吉氏库特菌在拆分1-苯基-1，2-乙二醇中的应用，还包括在步骤(2)中的反应体系中加入丙酮的步骤。

所述的丙酮的添加量按其在反应体系中终浓度为20～90mm添加；优选为按其在反应体系中终浓度为20～30mm添加。

步骤(2)中所述的催化反应的条件为：在25～45℃条件下催化5～22h；优选为：在转速150～180rpm、25～45℃条件下催化11～22h。

所述的吉氏库特菌在医药、农药、化妆品、液晶材料等领域中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的吉氏库特菌(kurthiagibsoniisc0312)催化选择性高，产物产率高，转化操作简单，安全，成本低廉，环境友好。

(2)采用本发明的吉氏库特氏菌拆分外消旋的1-苯基-1，2-乙二醇制备s型的1,2-苯基乙二醇，(s)-1,2-苯基乙二醇的得率为44～49％，光学纯度为93～100％。

(3)采用本发明的吉氏库特氏菌菌株催化合成光学纯手性化合物，不仅具有较好的催化效果，所生成的产物光学纯度较高，而且催化剂容易制备、反应条件温和，具有较好的应用开发前景。

附图说明

图1是本发明吉氏库特菌(kurthiagibsonii)sc0312的系统发育树图。

图2是本发明实施例2中吉氏库特菌(kurthiagibsonii)sc0312的生长过程中的od值的变化，以及其在12h，16h，20h，24h氧化生成2-羟基苯乙酮的结果图(图中“v”表示单位菌体催化剂催化生成2-羟基苯乙酮的速率)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。以下实施例中除特别说明外，均为本领域内的常规实验方法和操作步骤。

本发明中涉及的种子培养基和发酵培养基组成均如下：蛋白胨5～10g，酵母粉3～10g，氯化钠5～10g，加蒸馏水至1l，ph6.0～7.0。121℃灭菌20min。

实施例1吉氏库特菌(kurthiagibsonii)sc0312的分子生物学水平的鉴定

本发明的吉氏库特菌(kurthiagibsonii)sc0312是从广州本地长期被油浸泡的土壤中筛选而得。其中，菌株系统发育树如图1所示，其16srdna基因序列测定结果如下：

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将16srrna基因序列进行blast结果分析，得到与kurthiagibsonii同源性达到99％。根据分子生物学鉴定结果，将菌株鉴定为吉氏库特菌(kurthiagibsonii，简称k.gibsonii)，并命名为吉氏库特菌(kurthiagibsonii)sc0312。该菌株已保存于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctccno：m2017157，保藏日期为2017年3月31日，保藏地址为中国武汉武汉大学。

实施例2吉氏库特菌(k.gibsonii)sc0312培养过程曲线及催化活力变化

(1)将保存在甘油管中的菌种按0.1％(v/v)接种于50ml的种子培养基中，180rpm、37℃培养12h后，按0.1％(v/v)的比例接种于100ml的发酵培养基中，180rpm、37℃培养0～32h。监测菌种生长过程中的od(600nm)的变化(每隔4个小时测量一次)。结果如图2所示。

(2)分别将步骤(1)中在发酵培养基中培养了12h，16h，20h，24h的菌在4℃条件下离心，收集菌体得到静息细胞，然后将收获的静息细胞分别重新悬浮于磷酸盐缓冲液(100mm，ph6.5)中，加入外消旋的1-苯基-1，2-乙二醇(底物1-苯基-1，2-乙二醇终浓度为20mm)，其中湿菌体终浓度为30mg/ml，催化条件为温度为35℃，摇床培养箱转速为180rpm。催化30min取样，监测其氧化生成2-羟基苯乙酮的活力。催化活力的定义为单位菌体(mg)每分钟生成2-羟基苯乙酮的量(umol)。其中2-羟基苯乙酮为是拆分1-苯基-1，2-乙二醇时产生的一个产物，用它的生成速度来评价活性的大小。结果如图2所示，培养12～16h的菌的催化活力最佳。

(3)催化30min取样，分析(s)-1,2-苯基乙二醇(ped)的得率。使用反相高效液相色谱分析2-羟基苯乙酮的浓度，流动相为乙腈与水(含0.1％(v/v)三氟乙酸)＝2：3(体积比)，流速为0.5ml/min，色谱柱：watersxbridgec18,4.6mm×250mm，波长245nm。

实施例3吉氏库特菌(k.gibsonii)sc0312制备(s)-ped

(1)将保存在甘油管中的菌种按0.1％(v/v)接种于50ml的种子培养基中，180rpm、37℃培养12h后，按0.1％(v/v)的比例接种于100ml的发酵培养基中，180rpm、37℃培养16h。

(2)4℃下离心收集菌体，再重新悬浮于磷酸盐缓冲液中，加入1-苯基-1，2-乙二醇进行催化反应，其催化体系反应介质为磷酸盐缓冲液(100mm，ph5)，底物1-苯基-1，2-乙二醇终浓度为20mm，湿菌体终浓度为30mg/ml，丙酮终浓度30mm。催化条件为温度为45℃，摇床培养箱转速为180rpm。催化11h后取样，分析(s)-1,2-苯基乙二醇(ped)的得率和对映体过量率。

(3)使用反相高效液相色谱分析(s)-ped的浓度，流动相为乙腈：水(含0.1％(v/v)三氟乙酸)＝2：3(体积比)，流速为0.5ml/min，色谱柱：watersxbridgec18,4.6mm×250mm，波长215nm。使用正相高效液相色谱分析(s)-ped的过量率，流动相为正己烷：异丙醇＝9：1(体积比)，流速为0.7ml/min，色谱柱为：ob-h,4.6mm×150mm，波长215nm。

催化结束后，(s)-ped的产率为44％，对映体过量率为100％。

实施例4吉氏库特菌(k.gibsonii)sc0312制备(s)-ped

(1)将保存在甘油管中的菌种按0.1％(v/v)接种于50ml的种子培养基中，180rpm、35℃培养10h后，按0.1％(v/v)的比例接种于100ml的发酵培养基中，180rpm、35℃培养14h。

(2)4℃下离心收集菌体，再重新悬浮于磷酸盐缓冲液中，加入1-苯基-1，2-乙二醇进行催化反应，其催化体系反应介质磷酸盐缓冲液(100mm，ph6)，底物1-苯基-1，2-乙二醇终浓度为50mm，湿菌体终浓度为30mg/ml，丙酮终浓度20mm。催化条件为温度为25℃，摇床培养箱转速为180rpm。催化22h后取样，分析(s)-1,2-苯基乙二醇的得率和对映体过量率。

(3)使用反相高效液相色谱分析(s)-ped的浓度，流动相为乙腈：水(含0.1％(v/v)三氟乙酸)＝2：3(体积比)，流速为0.5ml/min，色谱柱：watersxbridgec18,4.6mm×250mm，波长215nm。使用正相高效液相色谱分析(s)-ped的过量率，流动相为正己烷：异丙醇＝9：1(体积比)，流速为0.7ml/min，色谱柱为：ob-h,4.6mm×150mm，波长215nm。

催化结束后，(s)-ped的产率为47％，对映体过量率为93％。

实施例5不同吉氏库特菌(k.gibsonii)sc0312菌体添加量制备(s)-ped

(1)将保存在甘油管中的菌种按0.1％(v/v)接种于50ml的种子培养基中，160rpm、30℃培养12h后，按0.1％(v/v)的比例接种于100ml的发酵培养基中，160rpm、30℃培养12h。

(2)4℃下离心收集菌体。催化体系反应介质磷酸盐缓冲液(100mm，ph8.5)，底物1-苯基-1，2-乙二醇终浓度为20mm，湿菌体终浓度为15mg/ml，丙酮终浓度90mm。催化条件为温度为30℃，摇床培养箱转速为160rpm。催化5h后取样，分析(s)-1,2-苯基乙二醇(ped)的得率和对映体过量率。

(3)使用反相高效液相色谱分析(s)-ped的浓度，流动相为乙腈：水(含0.1％(v/v)三氟乙酸)＝2：3(体积比)，流速为0.5ml/min，色谱柱：watersxbridgec18,4.6mm×250mm，波长215nm。使用正相高效液相色谱分析(s)-ped的过量率，流动相为正己烷：异丙醇＝9：1(体积比)，流速为0.7ml/min，色谱柱为：ob-h,4.6mm×150mm，波长215nm。

催化结束后，(s)-ped的产率为49％，对映体过量率为98％。

实施例6吉氏库特菌(k.gibsonii)sc0312在不同底物浓度下制备(s)-ped

(1)将保存在甘油管中的菌种按0.1％(v/v)接种于50ml的种子培养基中，180rpm、35℃培养10h后，按0.1％(v/v)的比例接种于100ml的发酵培养基中，180rpm、35℃培养15h。

(2)4℃下离心收集菌体。催化体系反应介质磷酸盐缓冲液(100mm，ph8)，底物1-苯基-1，2-乙二醇终浓度为80mm，湿菌体终浓度为20mg/ml，丙酮终浓度60mm。催化条件为温度为37℃，摇床培养箱转速为180rpm。催化15h后取样，分析(s)-1,2-苯基乙二醇(ped)的得率和对映体过量率。

(3)使用反相高效液相色谱分析(s)-ped的浓度，流动相为乙腈：水(含0.1％(v/v)三氟乙酸)＝2：3(体积比)，流速为0.5ml/min，色谱柱：watersxbridgec18,4.6mm×250mm，波长215nm。使用正相高效液相色谱分析(s)-ped的过量率，流动相为正己烷：异丙醇＝9：1(体积比)，流速为0.7ml/min，色谱柱为：ob-h,4.6mm×150mm，波长215nm。

催化结束后，(s)-ped的产率为47％，对映体过量率为94％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>华南理工大学

<120>一株吉氏库特菌及其在拆分1-苯基-1，2-乙二醇中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1028

<212>dna

<213>kurthiagibsonii

<220>

<223>吉氏库特菌（kurthiagibsonii）sc0312

<400>1

gaaatgcggcagctataatgcaagtcgagcgaatgacgagaagcttgcttctctgattta60

gcggcggacgggtgagtaacacgtgggcaacctgccctacagatcgggataactcaggga120

aacctgggctaataccggataatccttcgaatcacatgttttgaagttgaaaggcgcttc180

ggcgtcactgtaggatgggcccgcggtgcattagctagttggtggggtaacggcctacca240

aggcaacgatgcatagccgacctgagagggtgatcggccacattgggactgagacacggc300

ccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatgga360

gcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaaactctgttgtaagggaagaac420

aagtacgttaggaaatgaacgtaccttgacggtaccttattagaaagccacggctaacta480

cgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaa540

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aaatgcgtagagatttggaggaacaccagtggcgaaggcgactgtctggtctgtaactga720

cactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgt780

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