一株酿酒酵母及其与产酯酵母共培养提高传统发酵食品品质的方法与流程

文档序号：16775406发布日期：2019-02-01 18:41阅读：544来源：国知局

本发明属于微生物技术领域，具体地说涉及一株新分离高产乙醇的酿酒酵母菌株及其与产酯酵母共培养的培养方法与应用。

背景技术：

乙酸乙酯对传统酿造食品品质方面具有重要的影响，其含量是决定白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品品质好坏的重要因素。研究表明，在这些传统发酵食品中，乙酸乙酯主要来源于微生物发酵，可见，充分利用高产乙酸乙酯的微生物的发酵作用对于提升白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品的品质具有预见的可观效果。通过前期研究发现，在这些产乙酸乙酯微生物中，产酯酵母是传统发酵食品中酯类物质主要产生菌株。从白酒、黄酒和酱油等酿造体系或环境中获得能高产乙酸乙酯的功能微生物，并将其强化反补应用到酿造体系中，有利于提高白酒、黄酒和酱油等传统酿造中乙酸乙酯含量，对于提升这些传统酿造食品品质具有重要意义。

前期，已获得一株高产乙酸乙酯的异常威克汉姆酵母yf1503，该菌株所产乙酸乙酯含量能够达到17.35g/l，属于目前已报道产乙酸乙酯最高菌株（专利名称为：一株高产乙酸乙酯异常威克汉姆酵母及其培养方法与应用，专利号为：cn2017080700675400）。但该菌株需要在有合适浓度的乙醇前体条件下，才能获得高含量的乙酸乙酯，换言之，在没有乙醇前体条件下，该酵母所产乙酸乙酯含量较低，这在实际生产中会降低其应用效果。本专利正是基于之前方法存在的不足，通过共培养体系解决产酯酵母所缺少的乙醇前体物质，从而利用共发酵方式促使产酯酵母即使在无人为添加乙醇前体的条件下也能达到高产乙酸乙酯的目的。事实上，我国白酒、黄酒和酱油等多数传统发酵食品酿造过程中，大多是多种微生物共同发酵。在这些食品酿造过程中存在产生乙醇的酿酒酵母，通过筛选获得一株高产乙醇的酿酒酵母，利用该酵母协同产乙酸乙酯的异常威克汉姆酵母共培养即有可能提高后者产乙酸乙酯的水平，从而为应用于白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品中而提升这些食品品质奠定基础，这一问题的解决具有重要的现实意义和应用价值。

技术实现要素：

针对利用功能微生物提高白酒、黄酒和酱油等传统酿造食品中乙酸乙酯含量，提升其品质的实际应用，本发明目的在于提供一种从白酒大曲中新分离的高产乙醇的菌株，命名为yf1914，并提供yf1914协同高产乙酸乙酯的异常威克汉姆酵母yf1503共培养产乙酸乙酯的培养方法与应用。

本发明涉及的酵母是通过梯度稀释法结合平板涂布法从白酒大曲中筛选获得，为酿酒酵母（saccharomycescerevisiae），该菌株已于申请日前保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.14827。

上述所述菌株yf1914菌落特征和生化特性如下：该菌株在固体wl培养基上菌落呈乳白色，表面光滑，边缘规则，中央突起，湿润易挑起；细胞为椭圆形，出芽生殖；所述的酿酒酵母yf1914主要用于微生物发酵制备乙醇，在乙醇发酵培养基中培养3d，乙醇产量达到68g/l，可以作为协同产酯酵母yf1503共同提高白酒、黄酒和酱油等传统发酵食品中乙酸乙酯含量的功能微生物菌株应用到实际生产中。

上述酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914菌株的26srdnad1/d2序列与其它多株酿酒酵母的26srdnad1/d2序列有99%的相似性。

上述酿酒酵母菌株yf1914协同异常威克汉姆酵母yf1503共培养在提高白酒、黄酒和酱油等传统酿造食品中乙酸乙酯含量的潜在应用。

上述应用，具体方法如下：

（1）从斜面上各挑取1环酿酒酵母菌株yf1914和异常威克汉姆酵母yf1503分别接入液体种子培养基中，在30^oc、180r/min条件下，活化12h，获得两者的种子活化液；

（2）将（1）获得的酿酒酵母yf1914和异常威克汉姆酵母yf1503种子液分别按照合适的接种比例以及合适的接种量和接种方式接种于高粱酶解液培养基中，采用合理的培养方式于合适的温度下进行液体培养适当的时间；

（3）将（2）中所获得的产香发酵液采用高效液相方法对其含量进行检测。

根据本发明优选的，上述所述方法步骤（2）中，活化好的酿酒酵母yf1914和异常威克汉姆酵母yf1503接种比例按照1:1，接种量均按照1×10⁶cfu/ml，采用先接种yf1503于28°c静置培养24h，然后接种yf1914于28°c摇动培养60h，转速为180r/min时所产的乙酸乙酯含量高。

本发明的有益效果：

（1）本发明筛选出的菌株酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914来源于白酒酿造环境中，具有乙醇产量高的特点，经检测，该菌株乙醇产量可达到68g/l；

（2）本发明通过对酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）yf1503共培养发酵特性的研究，优化了双菌共培养的培养条件，提高了双菌共培养发酵乙酸乙酯的产量。

（3）本发明中的双菌共培养方法有利于其在白酒、黄酒和酱油等传统酿造食品中的应用。

附图说明

图1是酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914菌株在wl培养基上的菌落形态照片；

图2是酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914菌株的细胞形态照片（10×100）；

图3是酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914菌株系统进化发育树；

图4是高粱酶解液培养基中，酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）yf1503菌株以不同接种比例培养产乙酸乙酯情况；

图5是高粱酶解液培养基中，酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）yf1503菌株以不同接种量培养产乙酸乙酯情况；

图6是高粱酶解液培养基中，酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）yf1503菌株以不同培养方法培养产乙酸乙酯情况；

图7是高粱酶解液培养基中，酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）yf1503菌株以不同的静置温度培养产乙酸乙酯情况；

图8是高粱酶解液培养基中，酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）yf1503菌株以不同的摇动温度培养产乙酸乙酯情况；

图9是高粱酶解液培养基中，酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）yf1503菌株以不同摇床转速培养产乙酸乙酯情况；

图10是在不同的糖度高粱酶解液培养基中，酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）yf1503菌株共培养产乙酸乙酯情况；

图11是在不同的初始ph高粱酶解液培养基中，酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）yf1503菌株共培养产乙酸乙酯情况；

图12是高粱酶解液培养基中，异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）yf1503静置培养不同时间后，再与酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914菌株共培养产乙酸乙酯情况；

图13是高粱酶解液培养基中，酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）yf1503菌株共培养不同时间产乙酸乙酯情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

下述实施例所用培养基如下：

ypd培养基：酵母膏10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，琼脂粉20g/l，蒸馏水定容。

wl培养基：酵母浸粉5g/l，胰蛋白胨5g/l，葡萄糖50g/l，琼脂20g/l，磷酸二氢钾0.55g/l，氯化钾0.425g/l，氯化钙0.125g/l，氯化铁0.0025g/l，硫酸镁0.125g/l，硫酸锰0.0025g/l，溴甲酚绿0.022g/l，ph值为6.5，蒸馏水定容。

乙醇发酵培养基：葡萄糖200g，酵母浸粉10g，蛋白胨20g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁1g，蒸馏水定容至1l。配制好后于115℃灭菌20min。

高粱酶解液培养基：称取250g高粱粉碎，将粉末与水1:4混合，待煮沸后，保持90℃条件下加入耐高温α-淀粉酶于液化1h，再加入糖化酶于60℃下糖化2h。糖化后，离心取上清，通过4层纱布将其过滤，得到滤液，将浸出液的糖度调至8°bx，ph为6.0，分装于三角瓶中，灭菌备用。

实施例中所述酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914，2017年10月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14827。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例中所述乙酸乙酯和2-辛醇标准品购自美国sigma公司。

实施例1酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914的分离

将大曲粉碎并混合均匀后，称取25g，加入225ml无菌水，充分振荡后浸泡15min，制成悬液。在无菌操作条件下，取0.1ml悬液用无菌水逐级稀释至10^-3、10^-4、10^-5、10^-6。取各梯度悬液0.1ml于ypd平板上，每个稀释梯度做三个平行，由低浓度至高浓度依次涂布。将培养基平板置于30^oc的恒温培养箱中培养2d，观察菌落生长情况。挑起平板上为球形、表面突起、乳白色、不透明的单菌落，多次划线接种于ypd平板上，直至在显微镜下观察菌体形态一致。将单菌落接种于50ml乙醇发酵培养基中，30^oc、静置培养3d。发酵液中乙醇含量测定采用生物传感分析仪进行。采用标配的乙醇标准液进行标定，重复三次，待系统稳定后进行样品的测定。将发酵液稀释100倍，取25μl进行测定，重复三次并记录。最终获得一株高产乙醇的菌株，即酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914。

实施例2酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914的保存

上述所获得的酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914通过以下方法进行保存：

（1）斜面保存：将纯化后的菌种接种至ypd斜面，放置培养箱中培养48-72h后，在4^oc冰箱中保存。

（2）甘油管保存：取6ml20%甘油于已纯化的菌种平板中，将菌落刮净并与20%甘油混合，将混合液分装于1.5ml无菌pe管中，于-80^oc下保存。

实施例3酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914的鉴定

上述所涉及的酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914的鉴定包括以下步骤：

步骤1：形态学特征

为鉴定上述所涉及酵母菌株，对其进行以下形态学特征观察：

（1）菌落形态和细胞形态：将实施例1中所获得的菌株纯培养体接种于wl培养基上，于3d后观察其形态特征。结果如图1，菌落呈乳白色，表面光滑湿润，边缘规则，中央微突起。将其在光学显微镜下放大1000倍后观察，结果如图2，细胞多为椭圆形或者梭形，出芽生殖。

步骤2：分子生物学鉴定

为鉴定上述所涉及酵母菌株，对其进行的分子生物学测定包括以下步骤：

（1）菌体培养

上述涉及酵母是按照以下步骤进行培养：将实施例1中酵母菌株在ypd固体培养基中进行活化，在30^oc条件下培养48h后接种于ypd液体培养基中，置于28^oc、160r/min摇床中，培养48h。

（2）pcr扩增

上述涉及的酵母菌株基因组dna提取方法按照真菌dna提取试剂盒方法。

本发明为鉴定所用的扩增引物为酵母26srdna基因d1/d2区序列扩增引物，由以下引物组成：正向引物，nl1：5´-gcatatcaataagcggaggaaaag-3´；反向引物，nl4：5´-ggtccgtgtttcaagacgg-3´。

上述所涉及酵母菌株鉴定的pcr条件包括以下：pcr反应体系：lapcrbuffer2.5μl、正反引物各1μl、dntp2μl、lataq酶0.2μl、dna2μl、ddh2o补至25μl；pcr扩增程序：94^oc预变性5min，94^oc变性30s，58^oc退火30s，72^oc延伸1min，共30次循环，最后72^oc延伸10min；pcr扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检验。

（3）序列测定及系统发育树的构建

将（2）中的pcr扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司测序，得到菌株pcr扩增片段的原始序列。采用序列图谱软件bioedit，参照正向序列图谱，对序列人工校对。用校对后的26srdnad1/d2区序列，在genbank核酸序列数据库中进行同源序列搜索（blastsearch），与其它多株酿酒酵母的26srdnad1/d2区序列有99%的相似性；为进一步显示供试菌株与已知酵母菌的亲缘关系及系统地位，根据同源性搜索结果，使用mega6.0生物学软件对测试菌株和相关菌株的多个序列进行比对分析及neighbour-joining方法构建系统发育树；所构建的系统进化发育树如图3所示，将该菌鉴定为酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）。

该菌株已于2017年10月20日送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：cgmccno.14827。

实施例4酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）yf1503双菌液态共培养发酵提高乙酸乙酯的培养方法

本发明所涉及酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母yf1503双菌液态共培养发酵提高乙酸乙酯的培养方法，其特征在于，具体方法如下：

（3）将（2）中所获得的产香发酵液采用高效液相方法对其所产乙酸乙酯含量进行检测。

高效液相色谱法测定乙酸乙酯含量具体步骤如下：

（1）高效液相色谱（agilent1260infinity）仪器参数为：c-18反相色谱柱（zorbaxeclipseplusc-18，4.6×250mm，5μm），流动相为甲醇：kh2po4=1：1（v/v），流速1ml/min，检测波长210nm，柱温35^oc，进样量10μl。

（2）乙酸乙酯标准曲线的绘制

准确称取0.8472g乙酸乙酯，用60%（v/v）乙醇水溶液定容至10ml，即得84.72mg/ml的标准贮备液。分别移取100μl、200μl、300μl、400μl、500μl和600μl的标准贮备液，用60%（v/v）乙醇水溶液定容至10ml，经0.45μm微孔滤膜过滤后得0.8472-5.0832mg/ml6个浓度水平的乙酸乙酯标准溶液。

将上述不同浓度梯度的乙酸乙酯标准溶液在上述条件下进行测定，以浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y作标准曲线。乙酸乙酯标准品出峰时间在4.9-5.0min之间，每一浓度重复测定3次，求均值，绘制乙酸乙酯标准曲线，根据该曲线获得的方程式为y=360.06x+13.425（r²=0.9997）。

（3）样品的制备及含量检测

取8ml发酵液于10ml离心管中，经8000r/min离心5min，取上清液1ml，用60%的乙醇稀释到适当浓度，经0.22μm有机系滤膜过滤得到样品。

采用上述（1）中高效液相色谱参数进行测定样品中乙酸乙酯出峰面积，依据（2）中所绘制的标准曲线计算出样品中乙酸乙酯含量。

实施例5：酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）yf1503双菌液态共培养发酵不同接种比例的优选

本发明所涉及酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母yf1503双菌共培养发酵提高乙酸乙酯的培养方法，其特征在于，以高粱酶解液培养基为发酵产乙酸乙酯培养基，活化好的酿酒酵母yf1914和异常威克汉姆酵母yf1503分别按照1:0、1:1、1:2、1:5、2:1、5:1和10:1（其中“1”代表的接种量为1×10⁶cfu/ml）接种比例，同时接入到高粱酶解液培养基中进行液体产香培养，接种后在30^oc，180r/min培养48h，发酵结束后检测发酵液中乙酸乙酯含量；采用实施例4中所述的高效液相方法检测上述培养条件下酿酒酵母yf1914和异常威克汉姆酵母yf1503双菌共培养发酵产乙酸乙酯情况，具体如图4，相较与yf1503单菌发酵，合适比例的yf1914的接入，有利于提高乙酸乙酯产量；根据结果，优选接种比例为1:1时进行双菌共培养发酵的培养方法，乙酸乙酯产量达到1.54g/l。

实施例6：酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）yf1503双菌液态共培养发酵不同接种量的优选

本发明所涉及酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母yf1503双菌共培养发酵提高乙酸乙酯的培养方法，其特征在于，在实施例5的基础上，以高粱酶解液培养基为发酵产乙酸乙酯培养基，活化好的酿酒酵母yf1914和异常威克汉姆酵母yf1503按照接种比例为1：1，接种量为1×10³、1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶和1×10⁷cfu/ml等不同的接种量，同时接种的方式接入到高粱酶解液培养基中进行液体产香培养，接种后在30℃，180r/min培养48h，发酵结束后检测发酵液中乙酸乙酯含量；采用实施例4中所述高效液相方法检测到的酿酒酵母yf1914和异常威克汉姆酵母yf1503双菌共生发酵产乙酸乙酯具体情况如图5，可以看出，接种量的多少会影响乙酸乙酯产量；根据结果，优选酿酒酵母yf1914和异常威克汉姆酵母yf1503接种量均为1×10⁶cfu/ml，同时接入进行双菌共培养发酵的培养方法，乙酸乙酯产量达到1.48g/l。

实施例7：酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）yf1503双菌液态共培养发酵不同培养方法的优选

本发明所涉及酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母yf1503双菌共培养发酵提高乙酸乙酯的培养方法，其特征在于，在实施例6的基础上，以高粱酶解液培养基为发酵产乙酸乙酯培养基，活化好的酿酒酵母yf1914和异常威克汉姆酵母yf1503均按照1×10⁶cfu/ml接种量，1:1的接种比例，分别采用表1的培养方式进行，发酵结束后检测发酵液中乙酸乙酯含量。

在上述培养条件下，酿酒酵母yf1914和异常威克汉姆酵母yf1503双菌共生发酵产乙酸乙酯具体情况如图6，可以看出，接种顺序和培养方式会同时影响乙酸乙酯产量。根据结果，优选提前接种异常威克汉姆酵母yf1503，静置培养24h，然后接入酿酒酵母yf1914，摇动培养进行双菌共培养发酵的培养方法，乙酸乙酯产量达到1.88g/l。

表1酿酒酵母yf1914和异常威克汉姆酵母yf1503双菌共生发酵的不同培养方法

实施例8：酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母（wickerhamomycesanomalus）yf1503双菌液态共培养发酵不同培养温度的优选

本发明所涉及酿酒酵母（saccharomycescerevisiae）yf1914和异常威克汉姆酵母yf1503双菌共培养发酵提高乙酸乙酯的培养方法，其特征在于，在实施例7的基础上，以高粱酶解液培养基为发酵产乙酸乙酯培养基，活化好的酿酒酵母yf1914和异常威克汉姆酵母yf1503均按照1×10⁶cfu/ml接种量，分两段进行温度的优化，静置和摇动两阶段分别按照培养温度为18、22、26、28、30和34℃进行，发酵结束后检测发酵液中乙酸乙酯含量。