本发明属于菌种保藏领域，具体涉及一种用于真姬菇菌种悬液保藏的溶液及其保藏方法领域。
背景技术：
真姬菇(hypslzygusmarmoreus)具有提高人体免疫力、预防衰老、延长寿命等多种功效，广受消费者的喜爱，也是一种极具潜力的生产品种。真姬菇含有人体所需的八种必须氨基酸，尤其是赖氨酸、精氨酸的含量高于一般菇类，有助于青少年益智增高，真姬菇味道鲜美，热量低，享有“闻则松茸，食则玉蕈”的美誉，是一种营养丰富的食用兼药用的珍稀食用菌，也是目前进入工厂化生产的重要食用菌之一。菌种作为一种重要的生物资源，为了保持其优良性状不变，应及时对其进行保藏，使真姬菇的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。特别是随着真姬菇科研及工厂化生产规模的日益加大，急需一些应用广泛、简便、有效、经济的真姬菇菌种保藏方法和保藏介质。
悬液保藏法是食用菌菌种保藏的常用方法之一，目前主要有蒸馏水保藏法和生理盐水保藏法。蒸馏水保藏法可在室温保藏食用菌菌种，可保藏1-20年，且菌株污染少，但蒸馏水中含有的营养物质较少，菌种经过长期保存后生命活动受到严重抑制，复苏缓慢。
如公开号cn1952109a的发明专利“大型真菌菌种的短期保藏方法”，公开了大型真菌菌种的短期保藏方法，包括以下步骤：(1)将需要保藏的菌种先接种到固体培养基上培养，等菌丝体将要长满平板时将固体培养基切割成若干菌种块；(2)先在容器中加入无菌蒸馏水，再放进菌种块，盖紧瓶盖，于4℃下保存。本发明的大型真菌菌种的短期保藏方法，简便且经济，菌种不易产生变异。
又如公开号为cn104762208b的发明专利“一种黑牛肝菌母种低温保藏方法”，公开了真菌低温保藏方法的具体步骤：将黑牛肝菌子实体在固体培养基上培养菌丝，制得菌丝块；将菌丝块浸泡在含有无菌蒸馏水的无菌容器中，密封容器，在10-15℃条件下，放置10-30d；然后放置于3.5-4.5℃进行低温保藏。本发明提供的黑牛肝菌母种低温保藏方法，通过逐步冷却的方式保藏黑牛肝菌母种，经测试该方法保藏的黑牛肝菌母种，其菌丝活力及菌种栽培性状与一代母种相同，保存黑牛肝菌母种活力及优良性状达3年，解决了黑牛肝菌母种中短期简便种保藏的问题，为规模化栽培提供了有力保障。
此外，生理盐水保藏法利用食盐溶液具有高的渗透压，对杂菌孢子的萌发具有较强的抑制和杀灭作用，可减少或避免保藏期间菌种的污染；同时食盐溶液的高渗透压也会造成细胞失水，对经过长期保存后的菌丝的生命活动产生明显的抑制作用，复苏也比较缓慢。
技术实现要素：
本发明所解决的技术问题是克服现有菌种保藏溶液中存在的缺陷，提供一种保持真姬菇菌种活力高、不退化、操作简便、价格低廉、设备要求低、占据空间小、易于推广的真姬菇菌种悬液保藏的溶液，及其在真姬菇菌种悬液保藏中的保藏方法，以拓宽真姬菇菌种悬液保藏法的范围。
为了实现上述目的，本发明采用技术方案如下：
本发明的内容主要包括以下两个方面:
一种用于真姬菇菌种悬液保藏的溶液，由以下成分组成：
所述溶液的溶剂为无菌水，溶质为葡萄糖或者聚乙二醇(peg)。
优选地，所述溶液中，葡萄糖的质量浓度为0.5％-1.5％。
优选地，所述溶液中，葡萄糖的质量浓度为0.6-0.8％。
更优选地，所述溶液中，葡萄糖的质量浓度为0.8％。
优选地，所述溶液中，聚乙二醇分子量为6000-20000，质量浓度为0.05％-0.2％，；
更优选地，所述溶液中，聚乙二醇分子量为6000，质量浓度为0.05％-0.2％。
更优选地，所述溶液中，聚乙二醇分子量为6000，质量浓度为0.1％。
本发明的另一目的是提供采用所述真姬菇菌种悬液保藏溶液在保藏真姬菇菌种中的方法，具体步骤如下：
(1)用无菌蒸馏水溶解葡萄糖或聚乙二醇，配置成所需浓度的保藏溶液并使用滤膜过滤。
(2)将待保藏真姬菇菌种接种于pda平板上，待菌丝长满平板时，用打孔器在长有真姬菇菌丝的平皿上打孔，得到真姬菇菌种块。
(3)用接种针将所述真姬菇菌种块转入已灭菌的冻存管中，之后向所述冻存管中加入菌种保藏液，使所述菌种保藏液浸没菌块，密封，低温保藏。
优选地，所述步骤(1)中所述无菌蒸馏水经高温灭菌，冷却待用。灭菌条件为：121℃，灭菌20min。该步骤可有效保证菌种保藏中杂菌的干扰。
优选地，所述步骤(1)中，所述滤膜孔径为0.22μm。
优选地，所述步骤(2)中，所述真姬菇菌种的菌块直径为6mm-10mm。
更优选地，所述步骤(2)中，所述真姬菇菌种的菌块直径为9mm。
优选地，所述步骤(3)中，所述冻存管中转入真姬菇菌种块的数目为3-7块。
更优选地，所述步骤(3)中，所述冻存管中转入真姬菇菌种块的数目为5块。
优选地，所述步骤(3)中，所述冻存管中菌种保藏液的体积占所述冻存管体积的65％-95％。
更优选地，所述步骤(3)中，所述冻存管中菌种保藏液的体积占所述冻存管体积的80％。
优选地，所述步骤(3)中，所述低温保藏的温度为2℃-10℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果为:
本发明提供的真姬菇菌种保藏液及保藏方法，方法简便，设备简单，保藏效果优于现有的生理盐水保藏法和蒸馏水保藏法，保藏后菌丝活力与一代母种相同，为真姬菇菌种的简便保藏和规模化栽培提供了有力保障，具有较高的应用价值、经济意义及社会意义。
本发明的保藏液在菌种保藏中均获得显著的技术效果。经测定，其中，在选择葡萄糖作为菌种保藏液中，其在菌丝生长速率v、脱氢酶活性以及脱色率dr上均获得了显著的技术效果，而且在保藏至6月、9月中，更表现出葡萄糖溶液对于真菌活性的长久保护性，特别在保藏9个月时，其菌丝最高生长率可达到0.45，较同一保藏时期的0.9％nacl以及蒸馏水分别高出0.225以及0.075；其中，最高脱氢酶活性可达到0.7820，较同一保藏时期的0.9％nacl以及蒸馏水分别高出0.4685以及0.155。
同样，在选择利用聚乙二醇作为菌种保藏液中，其在菌丝生长速率v、脱氢酶活性以及脱色率dr上也获得了显著的技术效果。同样在菌种的长期保存中，可以有效保持菌种的活性，在保藏9个月时，其菌丝最高生长率可达到0.5750，较同一保藏时期的0.9％nacl以及蒸馏水分别高出0.35以及0.2；其中，最高脱氢酶活性可达到0.7820，较同一保藏时期的0.9％nacl以及蒸馏水分别高出0.4685以及0.155。
此外，本发明中针对于保藏的菌种的规格进行了具体限定，真姬菇菌种块的直径为6mm-10mm，冻存管中转入真姬菇菌种块的数目为3-7块，该步骤可有效保持菌种活力及栽培性状，可达到菌种有效保藏的效果和节约资源的目的。
同时对于冻存管中菌种保藏液的体积占冻存管体积比进行限定，该步骤可使菌丝体保持更久的活力。
具体实施方式：
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1：葡萄糖水溶液在真姬菇菌种悬液保藏中的保藏方法
(1)蒸馏水经高温灭菌，冷却待用。灭菌条件为：121℃，灭菌20min得到无菌蒸馏水，用无菌蒸馏水溶解葡萄糖，配置成质量浓度为0.6％的保藏溶液。在超净工作台中经0.22μm滤膜过滤。
(2)将待保藏真姬菇菌种接种于pda平板上，待菌丝快要长满平板时，用打孔器在长有真姬菇菌丝的平皿上打孔，得到真姬菇菌种块，真姬菇菌种块的直径为9mm，菌块数目为5块。
(3)在无菌条件下用接种针将所述真姬菇菌种块转入已灭菌的冻存管，之后移入菌种保藏液，使所述菌种保藏液浸没菌块，密封，低温4℃保藏。
其中冻存管中菌种保藏液的体积占所述冻存管体积的80％。
实施例2:葡萄糖水溶液在真姬菇菌种悬液保藏中的保藏方法
(1)蒸馏水经高温灭菌，冷却待用。灭菌条件为：121℃，灭菌20min得到无菌蒸馏水，用无菌蒸馏水溶解葡萄糖，配置成质量浓度为0.8％的葡萄糖溶液。在超净工作台中经0.22μm滤膜过滤。
(2)将待保藏真姬菇菌种接种于pda平板上，待菌丝快要长满平板时，用打孔器在长有真姬菇菌丝的平皿上打孔，得到真姬菇菌种块，真姬菇菌种块的直径为10mm，菌块数目为4块。
(3)在无菌条件下用接种针将所述真姬菇菌种块转入已灭菌的冻存管，之后移入菌种保藏液，使所述菌种保藏液浸没菌块，密封，低温4℃保藏。
其中冻存管中菌种保藏液的体积占所述冻存管体积的65％。
实施例3：葡萄糖水溶液在真姬菇菌种悬液保藏中的保藏方法
(1)蒸馏水经高温灭菌，冷却待用。灭菌条件为：121℃，灭菌20min得到无菌蒸馏水，用无菌蒸馏水溶解葡萄糖，配置成质量浓度为1.0％的葡萄糖溶液。在超净工作台中经0.22μm滤膜过滤。
(2)将待保藏真姬菇菌种接种于pda平板上，待菌丝快要长满平板时，用打孔器在长有真姬菇菌丝的平皿上打孔，得到真姬菇菌种块，真姬菇菌种块的直径为6mm，菌块数目为6块。
(3)在无菌条件下用接种针将所述真姬菇菌种块转入已灭菌的冻存管，之后移入菌种保藏液，使所述菌种保藏液浸没菌块，密封，低温10℃保藏。
其中冻存管中菌种保藏液的体积占所述冻存管体积的70％。
实施例4：葡萄糖水溶液在真姬菇菌种悬液保藏中的保藏方法
(1)蒸馏水经高温灭菌，冷却待用。灭菌条件为：121℃，灭菌20min得到无菌蒸馏水，用无菌蒸馏水溶解葡萄糖，配置成质量浓度为1.2％的葡萄糖溶液。在超净工作台中经0.22μm滤膜过滤。
(2)将待保藏真姬菇菌种接种于pda平板上，待菌丝快要长满平板时，用打孔器在长有真姬菇菌丝的平皿上打孔，得到真姬菇菌种块，真姬菇菌种块的直径为8mm，菌块数目为4块。
(3)在无菌条件下用接种针将所述真姬菇菌种块转入已灭菌的冻存管，之后移入菌种保藏液，使所述菌种保藏液浸没菌块，密封，低温5℃保藏。其中冻存管中菌种保藏液的体积占所述冻存管体积的80％。
实施例5：葡萄糖水溶液在真姬菇菌种悬液保藏中的保藏方法
按照实施例1制备的方法制备保藏液，保藏真姬菇菌种，唯一不同的是菌种保藏液成分为葡萄糖，质量浓度为0.8％。
实施例6：葡萄糖水溶液在真姬菇菌种悬液保藏中的保藏方法
按照实施例1制备的方法制备保藏液，保藏真姬菇菌种，唯一不同的是菌种保藏液成分为葡萄糖，质量浓度为1.0％。
实施例7：葡萄糖水溶液在真姬菇菌种悬液保藏中的保藏方法
按照实施例1制备的方法制备保藏液，保藏真姬菇菌种，唯一不同的是菌种保藏液成分为葡萄糖，质量浓度为1.2％。
实施例8：聚乙二醇水溶液在真姬菇菌种悬液保藏中的保藏方法
(1)蒸馏水经高温灭菌，冷却待用。灭菌条件为：121℃，灭菌20min得到无菌蒸馏水，用无菌蒸馏水溶解聚乙二醇，配置成质量浓度为0.1％的聚乙二醇溶液。在超净工作台中经0.22μm滤膜过滤，其中聚乙二醇的分子量为6000。
(2)将待保藏真姬菇菌种接种于pda平板上，待菌丝快要长满平板时，用打孔器在长有真姬菇菌丝的平皿上打孔，得到真姬菇菌种块，真姬菇菌种块的直径为7mm，菌块数目为4块。
(3)在无菌条件下用接种针将所述真姬菇菌种块转入已灭菌的冻存管，之后移入菌种保藏液，使所述菌种保藏液浸没菌块，密封，低温5℃保藏。
其中冻存管中菌种保藏液的体积占所述冻存管体积的80％。
实施例9：聚乙二醇水溶液在真姬菇菌种悬液保藏中的保藏方法
(1)蒸馏水经高温灭菌，冷却待用。灭菌条件为：121℃，灭菌20min得到无菌蒸馏水，用无菌蒸馏水溶解聚乙二醇，配置成质量浓度为0.05％的聚乙二醇溶液。在超净工作台中经0.22μm滤膜过滤，其中聚乙二醇的分子量为6000。
(2)将待保藏真姬菇菌种接种于pda平板上，待菌丝快要长满平板时，用打孔器在长有真姬菇菌丝的平皿上打孔，得到真姬菇菌种块，真姬菇菌种块的直径为6mm，菌块数目为5块。
(3)在无菌条件下用接种针将所述真姬菇菌种块转入已灭菌的冻存管，之后移入菌种保藏液，使所述菌种保藏液浸没菌块，密封，低温5℃保藏。
其中冻存管中菌种保藏液的体积占所述冻存管体积的70％。
实施例10：聚乙二醇水溶液在真姬菇菌种悬液保藏中的保藏方法
(1)蒸馏水经高温灭菌，冷却待用。灭菌条件为：121℃，灭菌20min得到无菌蒸馏水，用无菌蒸馏水溶解聚乙二醇，配置成质量浓度为0.2％的聚乙二醇溶液。在超净工作台中经0.22μm滤膜过滤，其中聚乙二醇的分子量为6000。
(2)将待保藏真姬菇菌种接种于pda平板上，待菌丝快要长满平板时，用打孔器在长有真姬菇菌丝的平皿上打孔，得到真姬菇菌种块，真姬菇菌种块的直径为7mm，菌块数目为4块。
(3)在无菌条件下用接种针将所述真姬菇菌种块转入已灭菌的冻存管，之后移入菌种保藏液，使所述菌种保藏液浸没菌块，密封，低温5℃保藏。
其中冻存管中菌种保藏液的体积占所述冻存管体积的85％。
实施例11：聚乙二醇水溶液在真姬菇菌种悬液保藏中的保藏方法
(1)蒸馏水经高温灭菌，冷却待用。灭菌条件为：121℃，灭菌20min得到无菌蒸馏水，用无菌蒸馏水溶解聚乙二醇，配置成质量浓度为0.15％的聚乙二醇溶液。在超净工作台中经0.22μm滤膜过滤，其中聚乙二醇的分子量为6000。
(2)将待保藏真姬菇菌种接种于pda平板上，待菌丝快要长满平板时，用打孔器在长有真姬菇菌丝的平皿上打孔，得到真姬菇菌种块，真姬菇菌种块的直径为8mm，菌块数目为4块。
(3)在无菌条件下用接种针将所述真姬菇菌种块转入已灭菌的冻存管，之后移入菌种保藏液，使所述菌种保藏液浸没菌块，密封，低温5℃保藏。
其中冻存管中菌种保藏液的体积占所述冻存管体积的80％。
实施例12：聚乙二醇水溶液在真姬菇菌种悬液保藏中的保藏方法
按照实施例8制备的方法制备保藏液，保藏真姬菇菌种，唯一不同的是菌种保藏液成分为聚乙二醇，质量浓度为0.1％，分子量为10000。
实施例13：聚乙二醇水溶液在真姬菇菌种悬液保藏中的保藏方法
按照实施例8制备的方法制备保藏液，保藏真姬菇菌种，唯一不同的是菌种保藏液成分为聚乙二醇，质量浓度为0.05％，分子量为20000。
实施例14：聚乙二醇水溶液在真姬菇菌种悬液保藏中的保藏方法
按照实施例8制备的方法制备保藏液，保藏真姬菇菌种，唯一不同的是菌种保藏液成分为聚乙二醇，质量浓度为0.1％，分子量为20000。
实施例15：聚乙二醇水溶液在真姬菇菌种悬液保藏中的保藏方法
按照实施例8制备的方法制备保藏液，保藏真姬菇菌种，唯一不同的是菌种保藏液成分为聚乙二醇，质量浓度为0.2％，分子量为20000。
实施例17菌种保藏性能的测定
对于不同实施例制备获得的真姬菇菌种保藏样品，分别测定其经3、6、9个月保存后的菌种保藏性能测试，即菌丝生长速率、菌丝脱氢酶活力、lbl培养基脱色率测试。
其中：
对照组1：菌种保藏溶液为质量浓度为0.9％的nacl溶液，其他制备方法同实施例1；
对照组2：菌种保藏溶液为蒸馏水，其他制备方法同实施例1；
实验组1、2、3、4分别对应本发明实施例1、5、6、7；
实验组5、6、7、8、9分别对应本发明实施例8、12、13、14、15。
测定方法如下：
菌种保藏效果检测1：菌丝生长速率v
取一支经过3个月，6个月及9个月保藏的有菌种的冻存管在25℃下复苏培养3天，然后取一块的菌种块接种到pda平皿上，菌丝萌发后48h测量菌落直径，通过以下公式计算：
菌丝生长速率v(cm/d)＝(菌落直径2-菌落直径1)/时间(d)
菌种保藏效果检测2：菌丝脱氢酶活力
从平皿中取菌丝体0.1g装入15ml离心管中，加入2ml蒸馏水，再加入0.2ml，5mg/ml的mtt溶液，避光35℃水浴，静置3小时。去上清，加入2mldmso，避光35℃水浴，静置4小时。取上层液体100μl在490nm波长处测量吸光值od，dmso作空白。
菌种保藏效果检测3：lbl培养基脱色率
按照表1的配比制作lbl培养基。配体方法与pda培养基相同。
表1lbl培养基配方
从平皿中接取2个直径9mm的菌丝块转入一个5ml冻存管中，匀浆30s后接入含35mllbl培养基的50ml离心管中，于25℃条件下进行静置培养。液体培养16d后取培养液500μl，5000r/min，4℃下离心15min，移取100μl上清液加入酶标板，使用酶标仪测定615nm处吸光度值，导入脱色率公式计算脱色率：
dr＝[1-(a615nmofstrain/a615nmofblank)]×100％
(dr以百分数表示，a615nmofstrain为接种菌株培养后的吸光值，a615nmofblank为空白培养液的吸光值)。
保藏效果如表2所示，结果表明参与测试的几种葡萄糖溶液对真姬菇菌种悬液保藏的结果均为有效，其中0.8％葡萄糖溶液保藏效果较好。保藏初期葡萄糖溶液的保藏效果弱于生理盐水和蒸馏水，但随着保藏时间的增长，葡萄糖溶液的保藏效果呈现出逐渐优于生理盐水和蒸馏水的趋势，说明葡萄糖保藏液适于中长期保藏。
表2葡萄糖溶液对真姬菇菌种的保藏效果
从表2中可以看出，在选择葡萄糖作为菌种保藏液中，其在菌丝生长速率v、脱氢酶活性以及脱色率dr上均获得了显著的技术效果，特别在保藏至6月、9月中，更表现出葡萄糖溶液对于真菌活性的长久保护性显著优于生理盐水以及蒸馏水，特别在保藏9个月时，其菌丝最高生长率可达到0.45，较同一保藏时期的0.9％nacl以及蒸馏水分别高出0.225以及0.075；其中，最高脱氢酶活性可达到0.7820，较同一保藏时期的0.9％nacl以及蒸馏水分别高出0.4685以及0.155。
此外，需要说明的是，在脱色率的测定过程中，脱色率作为测定菌丝生长性能的协同性参考指标，其菌种的脱色率越大，表明液体培养中培养基的ph变化显著，这与菌丝的呼吸作用有关，而一般情况下，随着菌丝生长速率的提高，菌丝生长越旺盛，则菌丝呼吸作用越强，脱色率高，但脱色率高的菌丝生长不一定高，因为脱色率还与膜的通透性有关，而膜的通透性又与溶液的渗透压有关。而从本申请菌种在葡萄糖溶液中保藏9个月的过程中，可以看出，其生长速率显著高于蒸馏水组以及0.9％nacl，而其脱色率相较于0.9％nacl同样也有不同程度的升高趋势。
同样，在选择利用聚乙二醇作为菌种保藏液中，其在菌丝生长速率v、脱氢酶活性以及脱色率dr上也获得了显著的技术效果。同样在菌种的长期保存中，可以有效保持菌种的活性，在保藏9个月时，其菌丝最高生长率可达到0.5750，较同一保藏时期的0.9％nacl以及蒸馏水分别高出0.35以及0.2；其中，最高脱氢酶活性可达到0.7820，较同一保藏时期的0.9％nacl以及蒸馏水分别高出0.4685以及0.155。
在脱色率的测定过程中，而从本申请菌种在聚乙二醇溶液中保藏9个月的过程中，可以看出，其生长速率显著高于蒸馏水组以及0.9％nacl，而其脱色率相较于0.9％nacl同样也有不同程度的升高趋势。
需要说明的是本发明实施例2-4的技术效果与实施例5-7对应相同浓度的葡萄糖溶液具有相近的技术效果。
本发明实施例9、10、11制备得到的菌种在菌丝生长速率v、脱氢酶活性以及脱色率dr上的技术效果具有与实施例8(实验组5)相近的显著的技术效果，其中菌种在菌丝生长速率中，保藏3个月均能达到0.9以上，保藏6个月均能达到0.82以上，保藏9个月均达到0.5以上。而在脱氢酶活性中，保藏3个月均能达到1.2以上，保藏6个月均能达到1.1以上，保藏9个月均达到0.7以上。