本发明涉及一种获得对兰科植物幼苗阶段的菌根真菌的方法，具体来说涉及一种获得铁皮石斛(dendrobiumofficinale)幼苗阶段菌根真菌的方法，把无菌苗移栽在原生境，诱导幼苗产生菌根真菌，再从该幼苗中分离、培养铁皮石斛幼苗阶段的菌根真菌的方法。
背景技术：
铁皮石斛为珍贵的兰科药用植物，由于长期掠夺性采挖，野生资源遭到严重破坏，现已经被列为国家重点保护珍稀濒危物种。由于兰科植物种子细小，萌发困难，同时无性繁殖系数低，加上其生长发育需特殊的生态环境，给此类药材大面积栽种造成很大困难。我国已陆续报道铁皮石斛人工试管繁殖方面的研究，但试管苗出瓶问题一直没有得到很好解决，幼苗移植到自然环境中存活率较低，并且由于无法与自然界中的真菌建立共生关系从而导致后续生长严重受限。有效真菌的获得目前多采用从成年野生铁皮石斛植株的根中分离，但由于成年铁皮石斛根中存在着大量作用未知的内生真菌，这使得促进铁皮石斛幼苗生长的有效真菌的筛选和分离变得复杂而繁琐，同时，铁皮石斛不同生活史阶段的有效真菌与成年铁皮石斛根中的有效共生真菌是否相同目前仍不确定。由于野外铁皮石斛野生铁皮石斛石斛极为稀少，得到自然生长的铁皮石斛幼苗更为困难。因此，通过该方法，可以获得幼苗阶段的菌根真菌，这为开展珍稀濒危兰科植物回归和发展石斛产业中所需的有效共生真菌奠定了基础。
技术实现要素：
本发明的目的在于发展出一种获得铁皮石斛幼苗阶段菌根真菌的方法。
将铁皮石斛的种子进行非共生萌发，得到无菌苗，将无菌苗栽种在铁皮石斛的原生地，定期采集新长出来的根进行镜检，如果发现根中形成菌丝团，将根表面用2%次氯酸钠消毒，挑取菌丝团，在无菌条件下用人工培养基培养，诱导幼苗根中的内生真菌生长，待长出菌丝时，进行真菌的纯化，获得纯菌落，并进行真菌的分子鉴定和保存。本发明的获得对铁石斛幼苗阶段有效共生真菌的方法，其特征包括以下的步骤：
（1）采铁皮石斛成熟但果荚尚未裂的果实，将种子干燥后用2%次氯酸钠溶液消毒3分钟，无菌水漂洗3次后播种在制作好的ms培养基上，在光照强度为2000lx-3000lx,温度25℃±2℃，光周期12h/12hl/d的条件进行非共生萌发，得到无菌苗；
（2）选择铁皮石斛原生境，目的是保证该环境中有利于铁皮石斛幼苗阶段的真菌。将获得的无菌苗移栽到该原生境树木的树干上或者是石头上，这样做的原因是铁皮石斛是附生植物，多生长在树木的枝干和石头上。并用尼龙绳固定，用该地苔藓覆盖铁皮石斛幼苗的根，以起到保湿的作用；
（3）每个月定期从栽种的铁皮石斛苗中取根样，通过显微镜的观察，当发现根中有菌丝团时，就可以进行菌丝团的分离；
（4）菌丝团的分离是将采回来的根依次用自来水冲洗，次氯酸钠溶液消毒，无菌水漂洗3次，用解剖针刮取菌丝团，用移液枪将菌丝团接种在马铃薯葡萄糖培养基（pda）上进行培养；
（5）当接种的菌丝团生长出菌丝时，用无菌接种针不断地挑取真菌菌落边缘处的菌丝到新的pda培养基上，转移3-5次后，得到纯菌落；
（6）进行分子鉴定与保藏。本发明分离出铁皮石斛幼苗阶段菌根真菌，分子鉴定其与美国国立生物技术信息中心数据库(ncbi,http://www.ncbi.nlm.nih.gov）进行blast比对，获得的菌根真菌都采用斜面保存法；
上述步骤中，步骤（1）所述的把铁皮石斛的种子在无菌操作台上用2%次氯酸钠溶液消毒3分钟，无菌水漂洗3次后播种在制作好的ms培养基上进行非共生萌发，目的是得到无菌苗；
步骤（2）选择有铁皮石斛植株自然生长的地点，将组培幼苗栽种在该自然生长点的树木的树干上或者是石头上，用尼龙线固定，并且用该地苔藓覆盖无菌苗的根，选择原生境，保证该地有对铁皮石斛有用的内生真菌；
步骤（3）每个月定期从栽种的铁皮石斛苗取根，通过显微镜的观察，当发现根中有菌丝团时，进行菌丝团的分离，这样可以及时得到内生真菌的侵入情况，这样保证分离的内生真菌来自幼苗阶段；
步骤（4）无菌苗比喻为“陷阱”，把其栽种在自然环境中，为了“捕捉”对铁皮石斛幼苗阶段阶段菌根真菌，该步骤就是把“猎物”分离出来，也就是用铁皮石斛无菌苗诱导菌根真菌侵入后分离与鉴定；
步骤（6）所述的分子鉴定中，采用ctab法提取真菌dna，pcr扩增所用引物为its1和its4；pcr扩增产物为上海生工生物工程有限公司进行测序；
虽然国内外都有专利和文献报道有关兰科植物有效菌根真菌的分离方法，但这些方法多采用从兰科植物野生植株的根中分离真菌。由于兰科植物根中存在着大量作用未知的内生真菌，这使得对铁皮石斛幼苗阶段生长有促进作用的有效共生真菌的筛选和分离工作异常复杂和繁琐。同时，不同兰科植物成年植株根中的真菌和幼苗阶段的菌根真菌是否相同并不确定，要获得该阶段的菌根真菌共生真菌非常困难。对铁皮石斛幼苗生长有促进作用的菌根真菌的分离都是来自野生铁皮石斛的成年植株。本发明的方法直接在铁皮石斛的原生地，利用无菌苗的诱导产生菌根真菌，从幼苗根中分离真菌，操作简单，获得的真菌种类较为单一，不需要大量繁琐的筛选过程，分离到的铁皮石斛幼苗阶段的菌根真菌，为筛选促进铁皮石斛幼苗生长的有效共生真菌通过了新的方法，获得能促进幼苗生长的有效共生真菌可以缩短人工栽培铁皮石斛的生长周期，这也为铁皮石斛的生态栽培和保育提供了技术支撑。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制；
实施例：
在贵州省兴义市首草公司基地，当铁皮石斛开花时（2016年4月）选取健壮的植株进行人工异交授粉，授粉后约180天（2016年10月）果实成熟，采收已成熟但果荚尚未裂开的果实，表面用75%的酒精消毒并用无菌水清洗后用无菌刀片切开果实，将种子置于盛有硅胶的干燥器内干燥48小时后，于无菌的密闭塑料小瓶内保存于-20℃中；
把铁皮石斛的种子在无菌操作台上用2%次氯酸钠溶液消毒3分钟，无菌水漂洗3次后播种在制作好的ms培养基上，在光照强度为2000lx-3000lx,温度25℃±2℃，光周期12h/12hl/d的条件进行非共生萌发。当出现原球茎时，转移到加炭的ms培养基上进行培养，待铁皮石斛株高有5厘米左右时，进行出瓶、炼苗；
据考察贵州省兴义市冷洞村有野生铁皮石斛，我们选取生长好的树木和石头上，把铁皮石斛的无菌苗移栽到树上，用该地的苔藓包裹根并用尼龙绳固定在树上，栽种在石头上的用苔藓把铁皮石斛无菌苗固定在石头小缝隙中，使用苔藓的目的是起到保湿的作用记录栽种时间，整个过程称作仿生态栽培。无菌苗栽种时间为2017年6月28日；
铁皮石斛幼苗各生长30天后，有新根长出时取根镜检，发现有菌丝团后，每隔7天采根进行内生真菌的分离。具体步骤是：根据整个生态栽培基地的环境异质性，我们把其划分为4个区域，分别采集4个区域石头和树上栽种的幼苗的根，把根用自来水轻轻冲洗掉泥土，带回实验室。把根用手术刀轻轻刮除根表面的附属物，先用75%酒精消毒2分钟，用无菌水冲洗三次，再用2%的次氯酸钠消毒3分钟，用无菌水冲洗三次。用大头针把根刮得很小，用移液枪把其转移到pda培养基中进行培养或者用镊子把其直接转接到培养基中。培养皿用封口膜封好后放入人工气候箱内，25±2℃黑暗培养；
当培养皿中长出菌丝时，用无菌接种针不断地挑取真菌菌落边缘处的菌丝到新的pda培养基上，转移3-5次后，得纯菌落。分离得到的菌根真菌如下表，试管斜面法保存于云南大学；
本发明的为获得促进铁皮石斛幼苗生长的共生真菌奠定了基础，之后接上真菌，培养30天后，进行数据的统计，接了分离得到菌根真菌与对照组都有明显变化，进一步筛选出对铁皮石斛幼苗生长的共生真菌。该方法为之后获得对铁皮石斛幼苗阶段的有促进作用的共生真菌的工作节省了大量的人力和物力，这是一种新颖获得幼苗阶段菌根真菌的方法。