一种丹参提取液的近红外在线检测方法与流程

本发明涉及医药检测领域，具体涉及一种心可舒片生产过程中丹参提取液中的有效成分含量的近红外在线检测方法。

背景技术：

丹参提取液是中药复方药剂中常用的成分，传统的提取过程质量控制主要凭借操作人员的经验或密度计等物理指标判别方法，耗时费力，难以测定有效成分浓度变化对产品均一的影响，易造成不同批次提取液质量的不稳定。而且实际生产中提取时间往往是固定的，基本不考虑原料药材质量差异和工况波动导致的提取终点提前或滞后，易造成不同批次提取液质量的不稳定，导致中药药品批次间的质量差异，以及能源、时间的浪费，药材利用率的降低等。心可舒片为山东沃华医药科技股份有限公司独家产品，由丹参、三七、山楂、葛根、木香5味中药组成，其中丹参具有活血化瘀、理气止痛的功效，是心可舒片的主要成分，属于“君药”，其提取过程是心可舒片生产过程的关键工艺环节，直接关系到心可舒片的产品质量与临床疗效。

近红外(nearinfrared，nir)光谱分析是近年迅速发展起来的一种快速检测方法，它无需对样品做复杂的预处理即可直接对多种成分含量同时进行测定，可以快速、无损、准确的特征实现了样品含量的快速、及时测定，能够及时发现生产过程的异常情况，以便生产人员及时采取措施，避免更大的损失。在中药质量控制及生产应用领域，近红外光谱作为一种在线检测技术应用于丹参相关指标成分的测定已有相关专利文献，如专利：一种脑心通胶囊近红外光谱的检测方法(cn201310323419.6)，一种丹红注射液双效浓缩过程在线检测方法(cn201410135322.7)等。但是这些专利均针对复方药材的提取过程,基于生产规模的单味丹参药材的水提液中主要有效成分的近红外在线检测技术的研究还未见报道，不能用于实际生产的在线监测，从而也不能解决中药复方药剂关键工艺环节的质量控制问题。

技术实现要素：

本发明的发明目的之一是，针对上述问题，提供一种丹参提取液的近红外在线检测方法，建立水提过程中丹参素钠、丹酚酸b的含量检测模型，实现生产过程的全程实时质量监控，为含丹参提取液的中药复方药剂的生产过程质量控制与检测提供科学依据。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种丹参提取液的近红外在线检测方法，包括以下步骤：

s1.近红外光谱和提取液样本在线采集：

采集设定数量的丹参提取液样本的近红外光谱和有效成分含量。

s2.建立监测模型：

根据所述近红外光谱和有效成分含量通过偏最小二乘法建立检测模型。

s3.有效成分含量测定：

在线采集待检测丹参提取液样本的近红外光谱，并输入所述检测模型得到所述待检测样本的有效成分含量，实现丹参提取液中的有效成分含量的在线检测。

优选的，步骤s1中，所述提取液指的是丹参水提过程中的丹参水提液。

优选的，步骤s1中，对于设定数量的丹参提取液样本，即在多个批次(比如5批)的丹参获得所述提取液的过程中，按设定的时间间隔采样；并测量丹参提取液样本的近红外光谱，同时通过高效液相色谱测定丹参提取液样本的有效成分含量。

优选的，设定的时间间隔为10～20min。

优选的，步骤s1和s3中，采集近红外光谱的扫描范围为10000～4000cm^-1，扫描次数为32次，分辨率为8cm^-1。

优选的，步骤s2中，对采集得到的近红外光谱作预处理然后再建立监测模型，所述预处理方法为多元散射校正、标准正交变换、一阶微分、二阶微分或s-g平滑。也可不作预处理。在本发明中，选取何种预处理方式通过步骤s2建立的检测模型的交叉验证均方差这一指标值作为判断标准，该指标值越小，则其对应的预处理方法越好。由于模型的交叉验证均方差的计算是以模型的相关系数和均方差为基础的，因此交叉验证均方差的最优化能够保证相关系数和均方差最优，从而保证模型最优。类似地，步骤s2建立检测模型时采用的主因子数也以这一指标值作为判断标准。

优选的，用于丹参提取液中丹参素钠定量分析时，通过sg15+1d法对近红外光谱进行预处理，建立检测模型时，采用7作为主因子数。

优选的，用于丹参提取液中丹酚酸b定量分析时，通过msc法对采集的近红外光谱作预处理，建立检测模型时，采用4作为主因子数。

优选的，用于丹参提取液中丹参素钠和定量分析时，选取4352～7943cm^-1波段作为建立检测模型的光谱范围；用于丹参提取液中丹酚酸b定量分析时，选取5850～9265cm^-1波段作为建立检测模型的光谱范围。

优选的，应用于生产心可舒片丹参提取液的近红外在线检测中。

由于采用上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

1.本发明所提供的在线检测方法，以产业化规模丹参水提工序作为研究系统，以水提液的主要有效成分——丹参素钠、丹酚酸b的含量变化作为研究对象，利用nir在线检测技术采集光谱，并结合hplc检测技术和化学计量学的数据处理方法，建立水提过程中丹参素钠、丹酚酸b的含量检测模型，实现生产过程的全程实时质量监控，为含丹参提取液的中药复方药剂的生产过程质量控制与检测提供科学依据，尤其被应用于心可舒片生产过程质量控制与检测。

2.本发明方法具有操作简便、快速，结果准确且无污染的优势，是对中成药在线质量检测和控制方法的有益补充。

说明书附图

图1为本发明实施例1丹参水提液的近红外谱图；

图2为本发明实施例1经过sg15+1d预处理全光谱建模结果(测试丹参素钠)；

图3为本发明实施例1经过msc预处理全光谱建模结果(测试丹酚酸b)；

图4为本发明实施例1丹参素钠模型交互验证变量选择图；

图5为本发明实施例1丹酚酸b模型交互验证变量选择图；

图6为本发明实施例1ipls回归分析直方图(测试丹参素钠)；

图7为本发明实施例1ipls回归分析直方图(测试丹酚酸b)；

图8为本发明实施例1ipls方法选择波段图(测试丹参素钠)；

图9为本发明实施例1ipls方法选择波段图(测试丹酚酸b)；

图10为本发明实施例1丹参素钠ipls波段选择图；

图11为本发明实施例1丹酚酸bipls波段选择结果；

图12为本发明实施例1丹参素钠定量模型预测值与真实值关系图；

图13为本发明实施例1丹酚酸b定量模型预测值与真实值关系图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

本实施例以心可舒片为研究对象，对丹参提取液进行在线监测。

本实施例涉及的近红外光谱采集仪器是antarisii傅里叶变换近红外光谱仪(美国thermofisher公司)，附件配置：透射模块，result近红外光谱采集软件；hplc仪器是agilent1100高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。本实施例提取采用3500l多功能提取罐(山东沃华医药科技股份有限公司)。

本实施例使用的丹参(产地山东)经山东沃华医药科技股份有限公司司质量部鉴定为丹参(radixpaeoniaealba)。hplc分析使用的有效成分丹参素钠、丹酚酸b对照品来自中国食品药品检定研究院。色谱纯乙腈、甲醇(merck,germany)，超纯水(自制)，磷酸等均为分析纯。

在线监测方法主要包括以下步骤：

s1.近红外光谱和提取液样本在线采集：

本实施例总共使用5批次的丹参药材。

对于每个批次的丹参，称取药材350kg，置于3500l提取罐中，加6倍量水，煎煮提取2小时，从沸腾开始取样，每隔15min取一次样，每次取样5ml；药渣进行第二次提取，加入5倍量水，煎煮提取1.5小时，从沸腾开始取样，每隔15min取一次样，每次取样5ml。重复生产5个批次，共收集样品80份。

采谱的同时取样进行hplc检测，样品编号一一对应。

光谱采集条件：扫描范围：光谱范围4000～10000cm^-1,扫描次数32，分辨率8cm^-1。

丹参水提液的近红外谱图参见图1。

其中，有效成分含量的hplc测定包括以下步骤：

1)标准品溶液的配制

取丹参素钠对照品、丹酚酸b对照品适量，精密称定，分别加入70％v/v甲醇水溶液，制成1ml溶液中含50μg丹参素钠、100μg丹酚酸b的标准品溶液；

2)供试品溶液的制备

精密吸取0.5ml丹参水提液于5ml具塞试管中，准确加入4.5ml70％v/v甲醇，摇匀，过0.22μm滤头，供液相进样用。

3)色谱条件

agilentc18柱(4.6×250mm5μm)；流动相：乙腈(a相)-0.1％磷酸水溶液(b相)梯度洗脱；检测波长：286nm。

s2.建立监测模型：

根据所述近红外光谱和有效成分含量通过偏最小二乘法建立检测模型。

对采集得到的近红外光谱作预处理然后再建立监测模型，用于丹参提取液中丹参素钠定量分析时，通过sg15+1d法对近红外光谱进行预处理，建立检测模型时，采用7作为主因子数。用于丹参提取液中丹酚酸b定量分析时，通过msc法对采集的近红外光谱作预处理，采用ipls方法选择最优区间建立丹参素钠和丹酚酸b的定量分析模型，用于丹参素钠含量模型选择区间为4352～7943cm-1，而用于丹酚酸b含量模型选择区间为5850～9265cm^-1。建立检测模型时，采用4作为主因子数。最终建立了心可舒片中丹参水提过程有效成分含量变化pls定量分析模型，模型评价参数如表5所示。

s3.有效成分含量测定：

在线采集待检测丹参提取液样本的近红外光谱，并输入所述检测模型得到所述待检测样本的有效成分含量，实现丹参提取液中的有效成分含量的在线检测。

实验例1.方法学考察，采用实施例1的检测方法，

线性考察：将各标准品溶液在上述色谱条件下测定，以浓度对峰面积回归得到回归方程。

精密度试验：取同一供试品连续进样5次，用以考察日内精密度，连续进样3天，用以考察日间精密度。

稳定性试验：取同一供试品0，50min，2.5h，5h，10h，15h，25h分别进样。

重复性试验：取同一样品同上供试品配制方法配制6份，同上色谱条件进样测定。

方法学考察结果

线性考察结果如表1所示：

表1hplc线性考察结果

结论：各成分标准曲线线性良好，线性范围符合分析要求。

表2精密度、稳定性、重复性考察结果

结论：精密度、重复性、稳定性均小于5％，符合分析要求。

校正集和验证集样品的划分结果：

由matlab软件中k-s算法，按校正集：验证集为4:1划分出64个校正集样品和16个验证集样品。

实验例2.光谱数据的预处理

在近红外光谱的采集过程中，环境的变化会引起光谱的基线偏移，随机噪声和样品背景干扰都会对校正结果产生影响，因此需要对光谱数据进行预处理。本实验例采用各种光谱预处理方法，包括多元散射校正(msc)、标准正交变换(snv)、一阶导数、二阶导数、s-g平滑等对原始光谱进行预处理，然后分别在全光谱范围建立pls定量分析模型。其他步骤同实施例1，计算出相关系数、均方根误差等模型评价指标，其中主要以rmsecv和rmsep两个指标对各个方法进行比较，筛选最佳光谱预处理方法。

丹参素钠和丹酚酸bpls模型的预处理方法具体结果分别见表3和表4。

表3不同预处理方法建模结果比较(丹参素钠)

表4不同预处理方法建模结果比较(丹酚酸b)

从上表可以看出，两种成分近红外光谱经过各预处理方法处理后的建模结果与无处理相比，建模效果均得到一定的改善。当选择sg15+1d对光谱进行预处理时，丹参素钠模型具有最小的rmsecv和rmsep值；当选择msc对光谱进行预处理时，丹酚酸b模型具有最小的rmsecv和rmsep值，说明此时模型预测结果最好，其中图2和图3分别为丹参素钠和丹酚酸b含量建模结果。

试验例3.最佳主因子数的选择

采用偏最小二乘法(pls)建立定量模型时，为避免出现“过拟合”现象，需要对主因子数进行合理选择。本实施例采用留一交叉验证法，考察主因子数对内部交叉验证均方差(rmsecv)的影响，其他参数和步骤同实施例1。

丹参素钠模型的交叉验证结果见图4。从图4中可以看出，当主因子数为7时，rmsecv值最低且趋于稳定，超过此主因子数时，rmsecv不再下降反而有所上升，因此确定最佳主因子数为7。

丹酚酸b模型的交叉验证结果见图5。从图5中可以看出，当主因子数为4时，rmsecv值首次到达低估，之后随变量增加，会引入多余的噪声，因此确定最佳主因子数为4。

实验例4.光谱范围的选择

本实验例在去除吸收饱和波段及噪声较大的部分波段后，进一步考察ipls方法对模型建模区间的选择，以期筛选得到预测结果最好，更具稳健性的模型。其他参数和步骤同实施例1。一般来说，ipls方法是将整个光谱区间等分为一定数量的光谱子区间，通过计算各个子区间的建模结果，主要以交互验证均方根误差(rmsecv)来评价各个子区间参与建模的好差程度，依此选择相关较大、rmsecv小的光谱区间建立pls回归模型。

本实验将全光谱等分为10个间隔子区间，并对每个子区间建立pls模型，采用内部交互验证的方法计算出rmsecv值，以rmsecv值作为纵坐标，建立关于10个子区间的ipls回归分析直方图，具体见图6和图7。

图中黑色曲线分别为经过最佳的光谱预处理方法处理后的光谱，黑色虚线为分别采用全光谱建立pls模型的rmsecv值。各个柱状图代表相应子区间下建立模型的rmsecv值，柱状图下方的数字代表在此区间建立模型时采用的主成分数。当柱状图位于虚线以下时，代表在该子区间建立模型优于全光谱所建立模型。实验采用在虚线以下的子区间进行建模，具体结果见图8和图9。如图9中阴影部分为挑选出最优的建模区间，从图中可以看出，挑选出的建模区间对应光谱信号较为明显，与实际相符。

对于丹参素钠模型，将光谱进行sg15+1d转换后，在潜在变量数(lvs)为7时，采用ipls波段选择方法选择波段，考察了当间隔变量数为500时所选波段建波效果，并与全光谱建模结果比较，选出最佳建模光谱区间。如图10所示，浅色阴影部分(左边阴影部分)为所选变量区间，对应波段为4352～7943cm^-1。

对于丹酚酸b模型，将光谱进行msc转换后，在潜在变量数(lvs)为4时，采用ipls波段选择方法选择波段，考察了当间隔变量数为500时所选波段建波效果，并与全光谱建模结果比较，选出最佳建模光谱区间。如图11所示，浅色阴影部分(左边阴影部分)为所选变量区间，对应波段为5850～9265cm^-1。

本实验例综合考虑各参数，采用ipls方法选择最优区间建立丹参素钠和丹酚酸b的定量分析模型，用于丹参素钠含量模型选择区间为4352～7943cm-1，而用于丹酚酸b含量模型选择区间为5850～9265cm^-1。

试验例5.模型的建立

本实施例对5批次丹参提取过程共计80个实验样本进行数据分析，经过样品集的划分、光谱转化方式的选择、光谱区间的优化及最佳主因子数合理性的考察，最终建立了心可舒片中丹参水提过程有效成分含量变化pls定量分析模型，模型评价参数如表5所示。同时，图12、13给出了本实施例1模型预测值与真实值的关系图。

表5最佳模型评价参数

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。