本发明涉及一种增强纳豆菌代谢产物的抗菌作用的方法，属于生物工程
技术领域：
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背景技术：
：食品工业中使用的防腐剂大多是化学防腐剂，对人体有一定的毒副作用。开发天然防腐剂是目前食品防腐研究的热点，从传统发酵食品的微生物的代谢产物中寻找天然生物防腐剂更是一个安全有效的方法。纳豆菌的代谢产物具有广谱抗菌作用，对常见的污染食品的微生物有拮抗作用。经日本专家研究，纳豆菌的代谢产物对细菌、酵母菌和霉菌均具有一定的抗菌活性，具有抑制沙门氏菌、伤寒菌、痢疾菌及o-157、h7大肠杆菌等致病菌作用。纳豆菌代谢的粘液里含有杆菌肽、多粘菌素和2,6-吡啶梭酸，对原发性大肠杆菌及沙门氏菌具有较强抗菌作用。多粘菌素对革兰氏阴性菌的抗菌活性强，主要敏感菌有大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、布鲁氏菌、弧菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌等，尤其对绿脓杆菌具有强大的杀菌作用。短杆菌肽和杆菌肽主要作用于革兰氏阳性菌。杆菌肤对耐药金黄色葡萄球菌、肠球菌、链球菌有效，对螺旋体和放线菌也有效，但对革兰氏阴性菌无效。纳豆菌产生的抗菌物质是经过微生物发酵而产生的，属于纯生物制剂，对人、畜均无毒害作用，因此可以通过生物纯化技术把这些抗菌物质分离出来，用来制取天然生物防腐剂，把它运用在食品添加剂方面。其作用可相当于防腐剂，且无毒无副作用，以此来满足消费者对天然食品防腐剂的要求。技术实现要素：本发明目的是解决纳豆菌代谢产物抑菌作用较弱的问题，提供一种增强纳豆菌代谢产物的抗菌作用的方法。本发明的技术方案概述如下：一种增强纳豆菌代谢产物的抗菌作用的方法，包括如下步骤：(1)将纳豆芽孢杆菌(bacillusnatto)接种在种子培养基中，220r/min的摇床上37℃培养8-15h，得到种子液；(2)低温预处理：将培养好的种子液以12000r/min低温(4℃)离心15min收集菌体，将菌体重悬于新鲜的种子培养基中进行0℃低温预处理24-48h。(3)将步骤(2)预处理后的种子液按3％-5％的接种量接种于发酵培养基中，37℃在220r/min的摇床上培养24-36h。本发明的有益效果：本发明对在种子培养基中培养8-15h得到菌体进行24-48h的低温预处理，菌体再在发酵培养基上发酵24-36h得到的代谢产物的抗菌作用效果比对照组(未经过低温预处理)要好。本发明的方法，简单易行，可以有效且快速增强纳豆菌代谢产物的抗菌作用。具体实施方式纳豆芽孢杆菌(bacillusnatto)属于枯草芽孢杆菌属，保藏编号为bncc185324，于2017年6月构自北纳生物(www.bnbio.com)，地址:北京市朝阳区双惠苑甲5号楼。大肠杆菌(escherichiacoli)，保藏编号为bncc336902，于2017年3月构自北纳生物(www.bnbio.com)，地址:北京市朝阳区双惠苑甲5号楼。种子培养基：蛋白胨1wt％，牛肉膏0.3wt％，nacl0.5wt％，葡萄糖0.5wt％，酵母膏0.5wt％，ph为7.0。发酵培养基：葡萄糖2wt％，蛋白胨0.5wt％，nacl0.5wt％，k2hpo40.4wt％，kh2po40.2wt％，ph为7.0。实施例1(g1)一种增强纳豆菌代谢产物的抗菌作用的方法，包括如下步骤：(1)将纳豆芽孢杆菌(bacillusnatto)接种在上述种子培养基中，220r/min的摇床上37℃培养8h，得到种子液；(2)低温预处理：将培养好的种子液以12000r/min，4℃离心15min收集菌体，将菌体重悬于新鲜的种子培养基中进行0℃低温预处理24h；(3)将步骤(2)预处理后的种子液按3％的接种量接种于发酵培养基中，37℃在220r/min的摇床上培养24h。对照例1(ck1)(1)将纳豆芽孢杆菌(bacillusnatto)接种在种子培养基中，220r/min的摇床上37℃培养8h，得到种子液；(2)对照预处理方法：将培养好的种子液以12000r/min(4℃)离心15min收集菌体，将菌体重悬于新鲜的种子培养基中进行室温预处理24h；(3)将步骤(2)预处理后的种子液按3％的接种量接种于发酵培养基中，37℃在220r/min的摇床上培养24h。取步骤(3)发酵结束后的菌悬液离心收集上清液，即为纳豆菌代谢产物溶液；取106～107cfu/ml指示菌(大肠杆菌)悬液0.2ml加入已制备好的2个平皿培养基中，涂布均匀，再用无菌镊子在每皿中放入3个无菌牛津杯，分别用无菌移液管吸取0.2ml实施例1中g1和对照例1中ck1的代谢产物溶液放入相应标记的牛津杯中，48h后测量各抑菌圈直径，取均值。(见表1)实施例2(g2)一种增强纳豆菌代谢产物的抗菌作用的方法，包括如下步骤：(1)将纳豆芽孢杆菌(bacillusnatto)接种在种子培养基中，220r/min的摇床上37℃培养12h，得到种子液；(2)低温预处理：将培养好的种子液以12000r/min(4℃)离心15min收集菌体，将菌体重悬于新鲜的种子培养基中进行0℃低温预处理36h；(3)将步骤(2)预处理后的种子液按4％的接种量接种于发酵培养基中，37℃在220r/min的摇床上培养30h。对照例2(ck2)(1)将纳豆芽孢杆菌(bacillusnatto)接种在种子培养基中，220r/min的摇床上37℃培养12h，得到种子液；(2)对照预处理方法：将培养好的种子液以12000r/min(4℃)离心15min收集菌体，将菌体重悬于新鲜的种子培养基中进行室温预处理36h；(3)将步骤(2)预处理后的种子液按4％的接种量接种于发酵培养基中，37℃在220r/min的摇床上培养30h。取发酵结束后的菌悬液离心收集上清液，即为纳豆菌代谢产物溶液；取106～107cfu/ml指示菌(大肠杆菌)悬液0.2ml加入已制备好的2个平皿培养基中，涂布均匀，再用无菌镊子在每皿中放入3个无菌牛津杯，分别用无菌移液管吸取0.2mlg2和ck2的代谢产物溶液放入相应标记的牛津杯中，48h后测量各抑菌圈直径，取均值。(见表1)实施例3(g3)一种增强纳豆菌代谢产物的抗菌作用的方法，包括如下步骤：(1)将纳豆芽孢杆菌(bacillusnatto)接种在种子培养基中，220r/min的摇床上37℃培养15h，得到种子液；(2)低温预处理：将培养好的种子液以12000r/min(4℃)离心15min收集菌体，将菌体重悬于新鲜的种子培养基中进行0℃低温预处理48h；(3)将步骤(2)预处理后的种子液按5％的接种量接种于发酵培养基中，37℃在220r/min的摇床上培养36h。对照例3(ck3)(1)将纳豆芽孢杆菌(bacillusnatto)接种在种子培养基中，220r/min的摇床上37℃培养15h，得到种子液；(2)对照预处理方法：将培养好的种子液以12000r/min(4℃)离心15min收集菌体，将菌体重悬于新鲜的种子培养基中进行室温预处理48h；(3)将步骤(2)预处理后的种子液按5％的接种量接种于发酵培养基中，37℃在220r/min的摇床上培养36h。取发酵结束后的菌悬液离心收集上清液，即为纳豆菌代谢产物溶液；取106～107cfu/ml指示菌(大肠杆菌)悬液0.2ml加入已制备好的2个平皿培养基中，涂布均匀，再用无菌镊子在每皿中放入3个无菌牛津杯，分别用无菌移液管吸取0.2mlg3和ck3的代谢产物溶液放入相应标记的牛津杯中，48h后测量各抑菌圈直径，取均值。(见表1)表1实验编号抑菌直径(mm)ck19.2g111.6ck210.3g212.7ck310.9g313.2从表1可以看出经过4℃低温预处理后，实施例1中抑菌圈直径增加了26.07％，实施例2中抑菌圈直径增加了23.30％，实施例3中抑菌圈直径增加了21.10％。从上述三个实施例中可以看出，经过4℃低温预处理后，纳豆菌代谢产物的抑菌作用得到了提高。当前第1页12