制备人绒毛膜干细胞培养液的方法及其应用与流程

本发明涉及干细胞技术应用，具体地，涉及制备人绒毛膜干细胞培养液的方法及其应用。

背景技术：

20世纪70年代，研究发现一种来源于中胚层、具有成纤维细胞样的贴壁细胞，即间充质干细胞，由于间充质干细胞具备很强的自我增殖能力和多分化潜能，已迅速成为国内外的研究热点，目前国外已有多项间充质干细胞相关应用制剂应用于临床的研究，且更多的临床试验正在进行或申请。目前已经从骨髓、脂肪、牙髓、羊膜、绒毛膜、蜕膜、脐带、脐血、羊水、睾丸、扁桃体等组织中分离提取出间充质干细胞。

间充质干细胞促进组织再生的机制包括分化和旁分泌两方面的作用。分化机制认为，间充质干细胞迁移到损伤部位，分化为与受区细胞相似表型的细胞，通过移植替代修复受损组织；旁分泌机制认为，间充质干细胞分泌的生长因子、细胞因子和趋化因子影响受区多种细胞的存活、增殖、迁移和基因表达，而且作用效果有组织特异性。目前的研究认为，由于间充质干细胞移植后成活率较低，间充质干细胞通过分化发挥替代修复的作用有限。数天甚至数小时内短暂而明显的抗炎和促进增殖作用，很难用间充质干细胞的分化修复来解释。此外，无细胞条件培养基具有改善受损组织功能的作用，同样也支持间充质干细胞的旁分泌机制。大量研究表明，相比组织构建，间充质干细胞通过复杂的旁分泌功能促进组织再生的作用可能更为关键。

目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中间充质干细胞的含量极其稀少，每10⁵-10⁶个单个核细胞中大约只有1个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。有研究表明，起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分，胎盘来源的间充质干细胞和骨髓来源的间充质干细胞具有相同的生物学特性。而且，胎盘作为分娩后的废弃物，不存在侵入性的获取过程，且与传统骨髓间充质干细胞相比，具有更强的增殖能力。人胎盘绒毛膜中含有丰富的干细胞，可作为一个崭新而丰富的来源，为实验研究和临床提供干细胞。

胎盘是胎儿发育的营养来源，最近的报告揭示了胎盘细胞上清液中存在丰富的活性因子，如碱性纤维母细胞生长因子(b-fgf)、表皮生长因子(egf)、和转化生长因子-β(tgf-β)等，这些细胞因子具有促进创伤愈合及组织再生的特性，这为皮肤抗老化的预防治疗提供了新的方法。培养人绒毛膜干细胞(cdsc)，得到的人绒毛膜干细胞培养液(cdsc-cnm)中含有b-fgf、egf、tgf-β、il-6及il-8等多种活性成分。将cdsc-cnm作用于光老化表皮细胞，有望可以使光老化表皮细胞得到修复再生。

目前，脂肪和骨髓来源的干细胞分泌因子己被用来治疗皮肤皱纹，而来源于人类胎盘的干细胞对于光老化的修复潜力尚缺乏研宄。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种制备人绒毛膜干细胞培养液的方法及其应用，以解决上述技术问题中的至少一个。

根据本发明的一个方面，提供一种制备人绒毛膜干细胞培养液的方法，包括以下步骤：步骤a.使用0.25vol％胰酶消化处于对数生长期的jeg-3人绒毛膜细胞系；步骤b.移除胰酶消化液终止消化，利用无血清悬浮培养法富集含有jeg-3人绒毛膜细胞系的细胞悬液中的人绒毛膜干细胞，获得jeg-3悬浮细胞球悬液；步骤c.利用0.05％胰酶和0.02％edta对jeg-3悬浮细胞球悬液进行消化，终止消化后，加入干细胞培养基传代培养，传代培养过程中提供2～4gy剂量钴⁶⁰γ射线照射，照射剂量率为165.44cgy/min，并加入基质细胞衍生因子-1α，获得人绒毛膜干细胞培养物；步骤d.将人绒毛膜干细胞培养物离心，过滤，除去人绒毛膜干细胞，得到滤液即为人绒毛膜干细胞培养液。

优选地，在步骤c的培养过程中加入0.2mg/l基质细胞衍生因子-1α。

优选地，在步骤c中，提供4gy剂量的钴⁶⁰γ射线照射。

本发明还提供采用上述的方法制备的人绒毛膜干细胞培养液。

本发明还提供采用上述的人绒毛膜干细胞培养液在护肤美容用品中的应用。

本发明还提供一种护肤美容用品，其特征在于：含有上述的人绒毛膜干细胞培养液。

优选地，护肤美容用品包括清洁类产品、美白除皱类产品以及化妆类产品。

优选地：清洁类产品包括洗手液、沐浴产品、洗发护发产品、洁面产品和卸妆产品；美白除皱类产品包括：润肤霜、爽肤水、收缩水、化妆水、乳液、日霜、晚霜、精华液、眼霜、护手霜、防裂膏、营养液；化妆类产品包括：妆前乳、隔离霜、粉底霜、唇膏、胭脂、花露水、香粉和面膜。

优选地，护肤美容用品为修复营养液，除了水分，其含有重量百分比为50～75％的所述人绒毛膜干细胞培养液，且还含有如下重量百分比组分：

本发明通过无血清悬浮培养法富集人绒毛膜干细胞，富集过程操作简单、成本低、所需器件常见，由此富集得到的人绒毛膜干细胞比率高，且不带毒性，其功能也不受富集过程操作影响。另外，本发明通过在cdscs的培养过程中，提供钴⁶⁰γ射线照射，且添加了基质细胞衍生因子-1α，可以极大地促进cdscs的旁分泌功能，由此培养得到cdsc-cnm中各种生长因子含量高于亲代jeg-3人绒毛膜细胞系。本发明培养的cdsc-cnm对光老化细胞有显著的修复作用，将其作为活性成分添加到美容护肤品中，可制备有修复效果的营养液。

附图说明

图1为显微镜下观察jeg-3人绒毛膜细胞系接种于无血清培养基后的生长情况；

图2为流式细胞仪分析cdscs表面标志物鉴定结果；

图3为cdsc-cnm中的细胞因子分析结果；

图4为光老化hacat细胞与正常hacat细胞的增殖率；

图5为不同浓度cdsc-cnm作用后的hacat细胞活性；

图6为hacat细胞经不同浓度cdsc-cnm作用后的荧光强度值；

图7为不同浓度cdsc-cnm作用光老化hacat细胞后的尾核比例。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

1.1人绒毛膜干细胞培养液(cdsc-cnm)的制备

无血清培养基的配制

将2μgegf、2μgbfgf、2mlb27、400μgbsa、400μg胰岛素、1ml青链霉素混合液移至100ml已灭菌好的玻璃血清瓶中，dmem培养基定容至100ml，即配制成干细胞培基，混匀、封装后置4℃冰箱备用。

细胞计数方式

准备一块清洁的细胞计数板，将盖玻片盖于计数槽上。将待测细胞制成单细胞悬液吹打混匀后，吸出5～10μl沿盖玻片边缘缓缓滴入，细胞悬液利用毛细管作用虹吸进入盖玻片下的计数槽内，充满盖玻片和计数板。保证盖玻片下无气泡，也避免让悬液流入旁边的小槽中。将计数器置于显微镜下观察，当看到视野中出现计数方格后，将四个大方格(每个大方格含有16个中格)中的细胞总数全部计数，压线的细胞记左不计右，记上不记下，出现两个以上细胞组成的细胞团则按单个细胞计数，若细胞团占10％以上说明细胞未消化好，吹打不够均匀，需重新制备悬液。

细胞计数公式：

细胞密度＝四大格细胞总数/4×10⁴

细胞总数＝四大格细胞总数/4×10⁴×稀释倍数

本实施例中采用的jeg-3人绒毛膜细胞系购自中科院细胞库，下述内容将对制备cdsc-cnm的过程进行详细描述。

步骤a：取对数生长期的jeg-3人绒毛膜细胞系，用0.25％的胰酶消化3～4分钟，在倒置显微镜下进行观察，当发现细胞突起收回，变圆时，立即将培养瓶翻转，使细胞脱离胰酶，然后将培养瓶移入超净工作台内，快速将瓶内的胰酶消化液吸净。

步骤b：往培养瓶中加入无血清干细胞培养基(含有0.4％bsa、egf20ng/ml、bfgf20ng/ml、胰岛素4μg/ml、b2720μl/ml、青链霉素混合液10μl/ml)终止消化，用枪头反复轻吹，使其脱壁并分散，形成单细胞悬液，计数，调整细胞数为5000～20000个细胞/孔，添加新的干细胞培基2ml接种于6孔非粘附板中，在37℃、5％co2饱和湿度的培养条件下培养，每2～3天添加新的干细胞培基，每24小时观察悬浮细胞球形成情况并拍照，待悬浮细胞球增大约50倍以后、生长状态最好时获取jeg-3悬浮细胞球悬液；用移液枪将jeg-3悬浮细胞球悬液移入15ml离心管中，37℃环境下静置20分钟(或15℃下500rpm离心5分钟)，使细胞球沉在离心管底部而质量较小的单细胞、死细胞、碎片仍悬浮在上部，轻轻吸弃上清液，用pbs轻轻将沉淀重悬，重复上述静置(或离心)、重悬沉淀操作2次以获得较纯的jeg-3悬浮细胞球悬液。

步骤c：；将获得的jeg-3悬浮细胞球悬液用0.05％胰酶和0.02％edta于37℃培养箱中消化5分钟，加入0.5～lml干细胞培养基以终止消化，轻轻反复吹打，机械分离制成单细胞悬液，计数后调整细胞密度，按5000～20000个细胞/孔重新接种于6孔板中，添加新的干细胞培基2ml连续传代培养，传代培养6代获得的人绒毛膜干细胞培养物应用到后续实施例中。

步骤d：收集上述人绒毛膜干细胞培养物，在2000～4000rpm条件下离心10～30分钟，待沉淀与清液充分分层，弃去沉淀了，保留上清液；将所得上清液用22μm的滤膜过滤，滤液再用20nm的滤膜过滤，最终所得滤液即为滤液即为本发明应用到后续实施例中的cdsc-cnm。

1.2cdscs及cdsc-cnm的鉴定

1.2.1jeg-3悬浮细胞球的细胞形态

在cdscs的培养过程中，使用倒置显微镜(ix70-131，olympus)观察细胞生长，并对悬浮细胞球形成情况进行连续观察、摄像。

jeg-3人绒毛膜细胞系接种于无血清培养基后，细胞呈悬浮生长，进行性增大，呈圆形或椭圆形球体。如图1所示，悬浮细胞球内细胞连接紧密，不能分细胞间界限，整个细胞透亮，折光性良好，球的边界清晰，培养至3～4天，细胞球成对数生长，至5天，细胞状态最佳，细胞体积增大约为刚接种的单个细胞的几十到几百倍大不等，呈较规则的圆形，第6天起，悬浮细胞球球虽逐渐增大，但球中心逐渐变暗，可能为球体增殖过大，中央的细胞因营养不够出现凋亡，折光性变差，球细胞轮廓不清晰，并在背景中开始出现脱落的死细胞碎片。因此，选取第5天的jeg-3悬浮细胞球悬液进行传代或作为下一步的实验对象。

1.2.2cdscs的表面标志物鉴定

胰蛋白酶消化传代至第6代的cdscs，经过离心(1000r/min，5分钟)后细胞重悬于pbs，分装至离心管。分别用fcd73、cd90、cd105、hla-dr、cd19、cd34f和fcd45f单克隆荧光抗体孵育cdscs细胞30分钟，同型对照免疫球蛋白g1作为阴性对照。孵育后的细胞用0.5％多聚甲醛固定,通过facsverse流式细胞仪facsuite软件进行荧光激活细胞分离(facs)。

流式细胞仪显示(图2)，cdscs表达间充质干细胞(mscs)的特异性表型，cd73、cd90和cd105表面抗原呈阳性，cd19、cd34、cd45和hla-dr表面抗原呈阴性。

1.2.3cdsc-cnm中旁分泌因子的检测

用酶联免疫吸附试验(elisa)测定cdsc-cnm中旁分泌因子的量：选取cdsc-cnm，使用elisa试剂盒测定上清中egf、tgf-β、白介素-6(il-6)、il-8等活性因子。并将接种亲代jeg-3人绒毛膜细胞系的无血清培养基设置为对照组，一同进行elisa法测定其中的旁分泌因子。

通过细胞因子分析，cdsc-cnm含有多种生长因子，如egf、tgf-β、il-6、il-8等。如图3所示，相比对照组，cdsc-cnm含有其5倍的il-6、4倍的il-8以及2倍的单核细胞趋化因子-1(mcp-1)。

实施例2

本实施例被设置与实施例1进行比较，以展示实施例2的技术方案对于cdscs旁分泌功能的促进效果。

2.1钴⁶⁰γ射线照射对cdscs旁分泌功能的影响

本部分内容中，设置在同实施例1中传代培养cdscs过程中分别接受2、4、8gy剂量的钴⁶⁰γ射线照射(对应实验组分别标记为2gy组、4gy组、8gy组)，照射剂量率均为165.44cgy/min，除了接受钴⁶⁰γ射线照射外，各实验组其他的处理步骤与实施例1保持一致。将实施例1设置为对照组进行比较，采用elisa测定对照组和2gy组、4gy组、8gy组的egf、tgf-β含量，其中在未接受钴⁶⁰γ射线前各组的egf含量为5.11±0.36ng/ml，tgf-β含量2.65±0.04ng/ml，测试结果见表1中数据。

与对照组比较，第1天4gy组egf略有下降，8gy组egf显著降低；第4天4gy组egf明显恢复并逐渐升高，而8gy组egf进一步下降；至第7天，8gy组几乎不能测出egf，而4gy组egf的含量为所有组别中最高的一组。各组对应时间点比较：2gy组呈缓慢增长，其egf含量与对照组相比略有提高：4gy组的egf含量在第1天有所下降，在第4天即明显回升，直至第7天，egf含量升高至明显超过对照组；8gy组中的egf含量持续降低直至测不出。tgf-β含量变化趋势与egf近似。

测试结果显示，较小剂量(2gy)钴⁶⁰γ射线辐射后egf及tgf-β含量随着时间推移逐渐升高，比对照组中旁分泌因子量的略有提升。而4gy剂量钴⁶⁰γ射线辐射后，egf及tgf-β含量先下降，后回升恢复至对照组水平之后持续上升。而大剂量(8gy)钴⁶⁰γ射线辐射后egf及tgf-β含量在显著下降，在随后的时间内依然未见恢复，直至最后完全检测不到。

表1不同剂量钴⁶⁰γ射线照射cdsc-cnm旁分泌因子含量(ng/ml)

2.2基质细胞衍生因子-1α对cdscs旁分泌功能的影响

在同实施例1中培养cdscs过程中，在培养基中加入了不同浓度的基质细胞衍生因子-1α。本部分内容中，除了改变培养cdscs过程中的培养基中的基质细胞衍生因子-1α浓度，其他的处理步骤与实施例中1保持一致。各组培养基中的胰岛素浓度具体为：

实验1组：基质细胞衍生因子-1α浓度为0.02mg/l；

实验2组：基质细胞衍生因子-1α浓度为0.2mg/l；

实验3组：基质细胞衍生因子-1α浓度为0.3mg/l；

对照组(实施例1)：无基质细胞衍生因子-1α组。

采用elisa测定培养7天后，对照组和实验1组、实验2组、实验3组的egf、tgf-β含量，结果表明(表2)，与对照组比较，基质细胞衍生因子-1α刺激下，实验1组和实验2组的egf、tgf-β含量都有明显增多，但进一步加大基质细胞衍生因子-1α的投入量，反而会降低egf、tgf-β含量，实验3组的egf、tgf-β含量低于对照组。由此可见，在cdscs的培养基中加入一定量基质细胞衍生因子-1α能有效促进cdscs的旁分泌功能，本实施例中确定基质细胞衍生因子-1α的最佳含量为0.2mg/l。

表2不同含量基质细胞衍生因子-1α培养的cdsc-cnm旁分泌因子含量

(ng/ml)

2.3钴⁶⁰γ射线照射、基质细胞衍生因子-1α对cdscs旁分泌功能的影响

cdscs传代培养过程中提供照射剂量率为165.44cgy/min的4gy剂量钴⁶⁰γ射线照射，并加入0.2mg/l基质细胞衍生因子-1α，其他处理步骤和检测上述同上述实施例保持一致。

采用elisa测定培养7天后所得cdsc-cnm的egf、tgf-β含量，得出egf为13.37±0.43ng/ml，tgf-β为20.93±0.74ng/ml。结果表明，与对照组或单个影响因素相比，在钴⁶⁰γ射线照射和基质细胞衍生因子-1α共同刺激下，cdsc-cnm旁分泌因子egf、tgf-β含量得到提升。

实施例3

设置本实施例验证cdsc-cnm的修复再生效果，并以cdsc-cnm为活性物质制备具有修复光老化皮肤功能的乳液。

3.1光老化人永生化表皮细胞的获得

人永生化表皮细胞(hacat)购于美国模式菌种收集中心(atcc)细胞系服务公司。生长培养基(growthmedium，gm)由dmem、10％fbs和1％青链霉素(0.1mg/ml青霉素和l00u/ml链霉素)组成，用gm培养正常的hacat细胞，置于37℃，5％co2培养箱。当细胞融合率达到90％以上时，根据后续实验分析的需要传代至6孔板、24孔板和96孔板。光老化诱导的hacat细胞，经pbs冲洗后，加少量pbs保持细胞湿润，充分暴露于uvb紫外灯下，uvb辐射量为1000j/m²；未经uvb辐射的hacat细胞做为对照组，同样用pbs冲洗。

3.2cdsc-cnm作用于光老化hacat细胞

hacat细胞经过uvb辐射之后，将pbs置换为不同浓度的cdsc-cnm进行作用。将收集的cdsc-cnm溶于对照培养基(controlmedium，cm)，浓度依次调整为0％(cm)、25％、50％和75％、100％，分别标记为对照组、实验a组、实验b组、实验c组、实验d组和实验e组。所有的细胞都置于置于37℃，5％co2培养箱，每3天换液一次，每个作用浓度设置3个复孔。

3.3hacat细胞增殖能力分析

利用细胞活性检测试剂盒(cellfcountingfkit-8，cck-8)进行细胞活力的测试。hacat细胞以2×10³/孔的数量接种于96孔板，经过uvb辐射后，将gm、cm及不同浓度的cdsc-cnm分别作用于光老化hacat细胞72小时。去除培养基，用pbs冲洗细胞，每孔加入100ml含有10％cck-8和90％新鲜无血清dmem的溶液。将细胞培养板用锡纸包裹避光，置于37℃，5％co2培养箱2小时。利用synergy2多功能酶标仪对培养板中的细胞上清液进行检测，分选波长设为450fnm,依据对照标准曲线计算出每孔的相对光密度值。利用倒置荧光显微镜拍照记录hacat细胞的增殖情况,每项增殖实验均设置3个复孔。

如图4所示，经过定量uvb辐射后形成光老化的hacat细胞，通过gm、cm继续培养检测，其细胞增殖率与正常hacat细胞相比明显下降，说明本实施例成功建立了光老化表皮细胞模型。

图5展示了cdsc-cnm对光老化表皮细胞増殖活力的影不同浓度的cmsc-cnm分别作用于光老化hacat细胞和未经辐射的hacat细胞，cm为对照培养基。尽管光老化hacat细胞比正常hacat细胞的细胞增殖率明显下降，但光老化hacat细胞经cdsc-cnm作用后，其细胞增殖率比cm作用后有明显増加。其中，增殖率增幅最大的是经75％cdsc-cnm作用后的光老化hacat细胞。

3.4hacat细胞活性氧自由基(radicalfoxygenfspecies，ros)生成量评估

h2dcfda探针在自由基氧化时可以生成荧光，并对细胞内的h2o2、oh及过氧亚硝基阴离子特别敏感，因此h2dcfda探针可以用来监测uvb辐射后细胞内ros的生成量。为了研宄cdsc-cnm在减少uvb辐射导致的细胞内ros生成量上的潜在保护作用，细胞培养在96孔板直到达到90～100％融合。将细胞暴露于uvb光进行辐射，采用cm和不同浓度的cdsc-cnm作用于细胞，并标记h2dcfda探针。培养板中细胞上清液通过synergy2多功能酶标仪进行检测。

光老化hacat细胞经cm和cdsc-cnm作用后ros的生成量有明显不同，图6中展示了h2dcfda荧光探针测定hacat细胞内ros生成量的结果，荧光信号强的代表ros生成量大。观察发现,未经uvb辐射的hacat细胞显示一定基础量的荧光信号，经uvb辐射之后，培养于cm的hacat细胞荧光信号相比基础状态(0％)时显著增加(97％)，而经cdsc-cnm作用后荧光信号强度相比cm作用时显著降低。其中，75％浓度cdsc-cnm抑制ros生成的作用最明显，ros生成量相比cm作用时降低了78％。

3.5碱性彗星分析hacat细胞的dna损伤程度

彗星试验(单细胞凝胶电泳)用于研究细胞核dna的损伤程度。hacat细胞经uvb辐射后，将cm及不同浓度的cdsc-cnm分别作用于光老化的hacat细胞72小时。胰蛋白酶消化细胞并用4％的多聚甲醛溶液重悬固定细胞，稀释细胞悬液，通过细胞计数将细胞浓度调整为5个/μl。利用彗星实验专用的单细胞电泳载玻片，每孔加入含10μl细胞悬液的100μl电泳凝胶，每孔共50个左右细胞核样品以观察单个细胞核dna损伤情况。凝胶分析使用荧光显微镜对sybrgreeni荧光染料染色的细胞核dna形态拍照，通过彗星分析软件测量并计算尾核比例，以dna拖尾长度占整个细胞总长度的百分比确定彗星分数，以定量分析dna损伤程度。

经uvb辐射后的细胞核dna损伤程度通过彗星试验进行分析。经1000juvb辐射形成的光老化hacat细胞和未经uvb辐射的hacat细胞，单细胞凝胶电泳后通过荧光显微镜观察发现细胞老化损伤越重，细胞核dna拖尾越长，dna拖尾长度占细胞总长度的百分比即为尾核比例值(图7)，通过彗星分析软件测量尾核长度并计算尾核比例，发现经uvb辐射后hacat细胞彗星分数显著增加，说明光老化hacat细胞dna损伤增加。经不同浓度的cdsc-cnm作用后，dna损伤程度有不同程度的减轻。其中，经50％的cdsc-cnm作用的光老化hacat细胞与cm作用的相比dna损伤程度降低了26％。

3.6修复营养液的制备

利用实施例2中在cdscs传代培养过程中提供照射剂量率为165.44cgy/min的4gy剂量钴⁶⁰γ射线照射，并加入0.2mg/l基质细胞衍生因子-1α的技术方案得到的cdsc-cnm制备修复营养液。将cdsc-cnm按重量百分比为70％作为活性成分添加，制备修复营养液。除了水分，修复营养液还含有如下重量百分比组分：