一种雨生红球藻的藻种更新纯化方法与流程

本发明涉及一种雨生红球藻的藻种更新纯化方法；属于微生物学在生物
技术领域：
的应用。
背景技术：
：雨生红球藻又被叫做湖生红球藻或湖生血球藻，是一种普遍存在的绿藻，属于团藻目，红球藻科，是公认的自然界中生产天然虾青素的最好生物。虾青素是类胡萝卜素科的秦椒黄族中的一种。秦椒黄有助于防止维生素a、维生素e及其他的类胡萝卜素发生氧化，是所有类胡萝卜素中抗氧化效果最强的，比β-胡萝卜素强10倍，比维生素e强100倍。经营养学家证实，虾青素可以跨越从血液到大脑的屏障，所以虾青素对大脑、中枢神经系统及双眼都可起到保护作用。实验表明优良的雨生红球藻可以保持优良特性传代25代前均保持稳定性，以便有利于科研研究和扩增生产，实验人员根据生产需求规定藻种的传代次数为17代，如果在17代以后，原本优良的藻种仍可以持续的保持着稳定性法则，在保证保种的前提下亲本继续进行传代。当藻种稳定性减弱后，随着传代次数的增多主要会带来以下影响：1.原本抗性耐受性等性质均稳定的优质藻细胞稳定性衰退，最终影响科学研究和生产；2.相同时间内分裂能力减慢、细胞数目减少、藻种对数期缩短最终总产值减少；3.生长周期变长、适用周期变长不仅是生产研究时间增多，生产成本增加，同时细胞本身变性与外在污染的几率均增加；4.异型细胞增多、细胞直径缩小、细胞色素不均匀、色素含量降低等最终导致虾青素的含量降低；5.根据外界环境变化所挑选出来的具有特异性的藻细胞特异性衰退。技术实现要素：本发明的目是提供一种雨生红球藻的藻种更新纯化方法；以解决现有雨生红球藻的藻种培育技术中存在的上述问题。技术方案：一种雨生红球藻的藻种更新纯化方法，包括藻种选择和更新纯化措施、培养液配制，具体如下：一、雨生红球藻的藻种更新纯化措施：1、从平板保存的藻种中挑选单个细胞增殖出来的单株细胞，保证后期培养是单种培养；2、平板挑选出来的单株细胞在96孔板中培养，培养量100ul，培养量小，有利于单株细胞快速增殖；3、96孔板培养后的藻液转移前通过观察检测，藻液生长状态好的直接用于继续更新和藻种保存，生长状态不好的废弃；4、96孔板培养较好的藻种继续更新使用的是取上清液转移到24孔板中进一步更新，保证了细胞的生物活性和分裂能力；5、24孔板培养后的藻液转移前通过观察检测，藻液生长状态好的直接用于继续更新和藻种保存，生长状态不好的废弃；6、24孔板培养较好的藻种继续更新使用的是取上清液转移到15ml试管内进一步更新，保证了细胞的生物活性和分裂能力；7、15ml试管中培养后的藻液转移前通过取样进行显微镜观察检测，藻液生长状态好的直接用于继续更新和藻种保存，生长状态不好的废弃；8、15ml试管中培养较好的藻种继续更新使用的是取上清液转移到250ml三角瓶内进一步更新，保证了细胞的生物活性和分裂能力；9、250ml三角瓶中培养后的藻液转移前通过取样进行显微镜观察检测，将与之前保存的藻种，即平板上藻种、96孔板藻种、24孔板、15ml试管藻种同时对比，必须是各阶段生长状态均好的情况才可继续进行进一步的更新工作，否则将从头开始操作，保证藻种的活性、生长速率的稳定性；10、确定长势好的250ml藻种将按1∶2的比例不断的进行反复扩种，比较确保来源相同的两个250ml三角瓶内的藻液长势是否相同，选择相同时间内藻液生长速度最快、ph变化最小、od值最大、色素最多的两瓶用于藻种继续培养；所述按1∶2即1个250ml三角瓶中藻种移入2个250ml三角瓶中扩种；11、取挑选出来的两瓶250ml进行藻种扩增，每次扩增保证9个250ml三角瓶的藻种和6个1l的三角瓶的藻种；12、9个250ml三角瓶的藻种反复循环使用，每次都挑选三个长势最好的用作藻种保存反复使用（正常使用20代左右），1l的三角瓶的藻种用于藻种扩增；13、1l的三角瓶的藻种按照1∶1的比例扩增至5l的烧瓶中进行藻种扩增；所述1∶1是1个1l三角瓶的藻种移到1个5l的烧瓶中扩种；14、5l的烧瓶藻种培养后通过显微镜镜检，状态好的藻种将按照1∶8的比例再次进行扩增；所述1∶8是指1个5l烧瓶中的藻种移入8个5l烧瓶中扩种；15、扩增后的藻种即可作为规模化室外生产培养用的藻种。二、上述藻种纯化措施中使用的培养液有两种，第一种是适合使用5l烧瓶内雨生红球藻的快速生长繁殖的培养液a，第二种是适合使用96孔板、24孔板、15ml试管、250ml三角瓶、1l三角瓶内雨生红球藻快速生长繁殖的培养液b。所述培养液a的配制方法，包括主料和辅料：1、以配制1升培养液计，主料成分：nano3（硝酸钠）0.2-0.4g/l,k2no3（硝酸钾）0.1-0.3g/l,mgso4*7h2o（七水硫酸镁）0.05-0.2g/l,柠檬酸0.1-0.3g/l,cacl2*2h2o（二水氯化钙）0.02-0.08g/l,kh2po4(磷酸二氢钾)0.01-0.03g/l,na2edta（乙二胺四乙酸二钠）0.001-0.003g/l,nahco3（碳酸氢钠）0.025-0.05g/l,na2so3(亚硫酸钠)0.02-0.05g/l,feso4*7h2o0.001-0.003g/l,fecl3*6h2o(氯化铁)0.001-0.003g/l；2、辅料成分即微量元素：mncl2*4h2o（四水氯化锰）0.00025-0.00045g/l，zncl2（氯化锌）0.00003-0.00006g/l，（nh4）6mo7o24（钼酸铵）0.00002-0.00006g/l，cuso4*5h2o（五水硫酸铜）0.00002-0.00005g/l，cocl2*6h2o（氯化钴）0.00003-0.00006g/l。所述培养液b的配制方法包括主料和辅料：1、主料：nano3（硝酸钠）0.8-1.5g/l，k2hpo4（磷酸氢二钾）0.02-0.08g/l，mgso4*7h2o（七水硫酸镁）0.05-0.08g/l，cacl2*2h2o（二水氯化钙）0.02-0.04g/l，柠檬酸0.02-0.08g/l，柠檬酸铁铵0.02-0.08g/l，na2edta（乙二胺四乙酸二钠）0.001-0.003g/l，na2co3（碳酸钠）0.02-0.06g/l；2、辅料成分即微量元素：h3bo3（硼酸）0.002-0.003g/lmncl2*4h2o（四水氯化锰）0.001-0.002g/l，znso4*7h2o（七水硫酸锌）0.0002-0.0003g/l，na2moo4（钼酸钠）0.0003-0.0005g/l，cuso4*5h2o（五水硫酸铜）0.00008-0.0001g/l，co(no3)2*6h2o（六水硝酸钴）0.00005-0.00008g/l。培养液、培养的工具、器皿作高温灭菌，灭菌条件为121℃，灭菌至少30min；接种、转接操作均在超净工作台上进行。本发明包括配制培养液以及雨生红球藻的藻种更新纯化方法，优点在于每次更新所用设备容量小、培养时间短、操作简单、避免了雨生红球藻受菌污染及转移过程中存在的成功概率以影响工作的问题，而且采用的是物理纯化的方法，避免了藻细胞采用化学纯化方法受化学药品的影响，导致细胞畸形、抗菌能力的抗性下降的问题，整体上可大大提高雨生红球藻的藻细胞的生物活性、藻细胞的分裂能力，从而保证雨生红球藻在规模化培养中的藻液的适应期不会变长，对数期不会缩短，细胞数目不会减少，色素含量不会降低，最终导致虾青素的含量相对稳定。附图说明图1是本发明实施例提供的一种雨生红球藻的更新纯化流程示意图。具体实施方式以下作为实例，对技术方案进一步说明。实例一，配制培养液实例，其中，所述培养液包括培养液b和培养液a；培养液配制时，先在技术方案给出的各成分的取量范围取量，计算所需配制培养液的体积，按照上述培养液中的成分重量计算每个成分所需重量，依次准确称量，每个称量后都采用超纯水溶解，依次按配方顺序一个一个称量并溶解完后，定容至所需配制培养液的体积。1、培养液a的配制方法组分配方量g/l1nano3（硝酸钠）0.352k2no3（硝酸钾）0.23mgso4*7h2o（七水硫酸镁）0.14柠檬酸0.155cacl2*2h2o（二水氯化钙）0.066kh2po4(磷酸二氢钾)0.027na2edta（乙二胺四乙酸二钠）0.0018nahco3（碳酸氢钠）0.0459na2so3(亚硫酸钠)0.0410feso4*7h2o0.00111fecl3*6h2o(氯化铁)0.00112a5h3bo3（硼酸）0.0006mncl2*4h2o（四水氯化锰）0.00035zncl2（氯化锌）0.00005（nh4）6mo7o24（钼酸铵）0.00004cuso4*5h2o（五水硫酸铜）0.00003cocl2*6h2o（氯化钴）0.000052、培养液b的配制方法组分配方量g/l1nano3（硝酸钠）1.252k2hpo4（磷酸氢二钾）0.043mgso4*7h2o（七水硫酸镁）0.0754cacl2*2h2o（二水氯化钙）0.0365柠檬酸0.066柠檬酸铁铵0.067na2edta（乙二铵四乙酸二钠）0.0018na2co3（碳酸钠）0.029a5h3bo3（硼酸）0.00286mncl2*4h2o（四水氯化锰）0.00186znso4*7h2o（七水硫酸锌）0.00022na2moo4（钼酸钠）0.00039cuso4*5h2o（五水硫酸铜）0.00008co(no3)2*6h2o（六水硝酸钴）0.000053、将配制好的培养液用灭菌锅按常规方式进行灭菌处理。实例二、结合附图，对雨生红球藻的藻种更新纯化方法进一步说明图1是本发明实施例提供的雨生红球藻的藻种更新纯化方法的流程示意图；按藻种更新纯化工艺顺序，方法包括以下步骤：1、利用平板保存的藻种，通过显微镜观察，挑选是单个细胞增殖出来的一株细胞，如果细胞有污染、细胞受到干扰的则直接舍弃，重新挑选。2、杀菌处理：将96孔板和24孔板置于紫外灯下照射至少2h，封口膜于紫外灯下照射至少30min。3、向消过毒的96孔板内添加100ul改良的培养液，按要求将平板保存的藻种挑选至孔板，同时挑选部分重新涂平板保存（藻种一）。4、全部挑选结束后，用封口膜给96孔板封口，置于22℃±1℃，光照度600lux的恒温光照培养箱中培养。5、每天通过肉眼观察96孔板内藻液生长状态，当藻液颜色均匀、颜色浓绿，透光性强的，可以用于下一步更新使用。6、向消过毒的24孔板内添加1ml改良的培养液，按要求将96孔板内培养达到要求的藻种取上清液转移至24孔板中，必须一一对应，已转移了部分藻液的96孔板的藻种继续培养保存（藻种二）。7、全部挑选结束后，用封口膜给24孔板封口，置于22℃±1℃，光照度600lux的恒温光照培养箱中培养。8、每天通过肉眼观察24孔板内藻液生长状态，当藻液颜色均匀、颜色浓绿，透光性强的，可以用于下一步更新使用。9、向灭过的菌的15ml试管内添加5ml改良的培养液，按要求将24孔板内培养达到要求的藻种取上清液转移至15ml试管内，必须一一对应，已转移了部分藻液的24孔板的藻种继续培养保存（藻种三）。10、全部挑选结束后，置于22℃±1℃，光照度600lux的恒温光照培养箱中培养。11、每天通过肉眼观察15ml试管内藻液生长状态，当藻液颜色均匀、颜色浓绿，透光性强的时候，取样通过显微镜进行镜检，记录游动细胞、不动细胞、死细胞数量、污染情况，并检测od值和ph值，对比确定哪一个藻种生长状态最好（记录检测数据，藻种四），用于下一步更新使用，状态差的直接废弃。12、向灭菌过的的250ml三角瓶内添加50ml改良的培养液，按要求将15ml试管内培养达到要求的藻种取上清液转移至250ml三角瓶内，必须一一对应。13、全部转移结束后，将250ml三角瓶置于振荡器上，并置于洁净区内，控制环境温度22℃±1℃，光照度600lux的条件下培养。14、每天通过肉眼观察250ml三角瓶内藻液生长状态，当藻液颜色均匀、颜色浓绿，透光性强的时候，取样通过显微镜进行镜检，记录游动细胞、不动细胞、死细胞数量、污染情况，并检测od值和ph值，对比确定哪一个藻种生长状态最好（藻种五），状态差的直接废弃。15、对比检测，上述处理好的藻种一、藻种二、藻种三、藻种四、藻种五，看是否在各个更新阶段藻种状态都好，如果某一个阶段藻种状态出现不好的情况，说明该藻种不稳定，不能用于后期培养，将重复上述步骤，直至各个阶段的藻种状态都好，才能进行下一步更新。16、已确定长势较好的250ml三角瓶内的藻种添加培养基至125ml，培养7天左右，按照1∶2比例进行反复平扩（平扩时只取上清液），看来源相同的两个三角瓶的长势是否相同，如相同看相同时间内那两瓶生长速度最快、ph变化最小、od值最大、色素最多。17、选定的长势最好的250ml三角瓶内的藻种，将用于室内扩大培养，将250ml三角瓶内的藻种按1∶4～6比例转接至250ml三角瓶内。18、转移结束后，将250ml三角瓶置于振荡器上，并置于洁净区内，控制环境温度22℃±1℃，光照度600lux的条件下培养。19、培养7天左右，先看藻液状态，再检测od值，细胞数情况。20、向灭菌过的9瓶灭菌好的250ml三角瓶及6个1l的三角瓶中内添加改良的培养液，取上述长势最好的3瓶250ml三角瓶藻液，取上清液转移至9瓶灭菌好的250ml三角瓶及6个1l的三角瓶中。21、转移结束后，将250ml及1l的三角瓶置于振荡器上，并置于洁净区内，控制环境温度22℃，光照度600lux的条件下培养。22、向灭菌过的5l烧瓶添加灭过菌传统的bg11培养液，取上清液按照1∶1的比例将1l三角瓶内的藻液转接至5l烧瓶中，同时250ml三角瓶内的藻液城府2.17～2.20的操作。23、转移结束后，将5l烧瓶置于洁净区内，控制环境温度22℃，光照度600lux的条件下通气培养，控制ph值在7.5～8.5之间。24、培养7天左右，先看藻液状态，再检测od值，细胞数情况；检测后通过1∶8的比例进行5l烧瓶的藻种平扩，供雨生红球藻规模化培养的藻种使用。25、每次使用的藻种均按照2.22的步骤重复操作，直至藻种培养20代左右或藻种出现异常，将对各阶段保存的藻种进行重新检测，哪个阶段的藻种状态最好，将从哪个阶段重新开始更新或者直接从平板保存的藻种重新开始另一轮的藻种更新工作。26、培养液、培养的工具、器皿要进行高温灭菌，灭菌条件为121℃，灭菌30min，接种、转接操作均在超净工作台上进行。本发明的有益效果是：本发明作为一种雨生红球藻藻种更新纯化的新方法，主要包括配制培养液以及雨生红球藻的藻种更新纯化方法，本发明的优点在于每次更新所用设备容量小、培养时间短、操作简单、避免了雨生红球藻无受菌污染及转移过程中存在成功概率以影响工作的问题，而且采用的是物、理纯化的方法，避免了藻细胞采用化学纯化方法受化学药品的影响，导致细胞畸形、抗菌能力的抗性下降的问题，整体上可大大提高雨生红球藻的藻细胞的生物活性、藻细胞的分裂能力，从而保证雨生红球藻在规模化培养中的藻液的适应期不会变长，对数期不会缩短，细胞数目不会减少，色素含量不会降低，最终导致虾青素的含量相对稳定。以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，当然，本发明还可以采用与上述实施方式不同的形式，以及相近的领域，这些都不构成对本实施方式的任何限制，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下所作的变换或相应的改动，都应该属于本发明的保护范围内。当前第1页12