本发明涉及肺部病灶肿瘤的良恶性判断领域，更具体地说，它涉及一种支气管肺病灶灌洗液的shox2甲基化检测方法。
背景技术：
支气管病灶处的灌洗液常常被用来检测肿瘤，来判断肺部肿瘤的良恶性质，判断肿瘤的良恶性对患者的治疗具有重大的意义，可以帮助医生清楚的了解病情，控制转移，提高患者的生命，做到针对性的治疗。
现代研究表明，在肿瘤发生后，肿瘤细胞的dna发生了突变，利用dna甲基化可以作为肿瘤标志物应用在肿瘤筛查之中，最新出现的shox2甲基化的研究表明其在肿瘤筛查方面也有较高的特异性和敏感性，选择检查的体液一般以支气管病灶处的灌洗液为主，支气管病灶处的灌洗液具有肿瘤细胞多、不易混入其他肿瘤细胞，特异性强的特点。
技术实现要素：
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种支气管肺病灶灌洗液的shox2甲基化检测方法，以解决背景技术中提到的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
一种支气管肺病灶灌洗液的shox2甲基化检测方法，包括以下步骤：
s1、将患者支气管肺病灶处采集的灌洗液等量分为3份，作为3个样本；
s2、将s1中的3个样本分别应用dna提取试剂盒提取dna，应用uv分光光度计测定dna浓度及纯度，取浓度大于7ng/ul且od260/280吸光光度比值为1.8-1.9为合格样本；
s3、亚硫酸氢盐转化，将所述s2中合格的样本进行亚硫酸氢盐转化；
s4、对所述s3中的样本进行实时荧光定量pcr，并以内参基因β-actin作为阳性对照，实验时采用20ulpcr反应体系；
s5、对所述s4中的样本进行实时荧光定量pcr仪扩增，pcr反应条件为98℃/10″，并进行60个循环；
s6、在阳性对照、阴性对照、空白对照有效的情况下，测量绘制样本中β-actin和shox2基因的指数扩张曲线；
s7、若所述s6中样本中β-actin和shox2基因均有指数扩张曲线则判断为甲基化阳性，若样本中β-actin有指数扩增曲线，而shox2基因无扩增曲线则为甲基化阴性。
进一步的，所述s1中将患者支气管肺病灶处采集的灌洗液等量分为3份，作为3个样本，样本体积不小于5ml。
进一步的，所述s2中将s1中的3个样本分别应用dna提取试剂盒提取dna，应用uv分光光度计测定dna浓度及纯度，取浓度为7.2-7.6ng/ul且od260/280吸光光度比值为1.82-1.86为合格样本。
进一步的，所述s3中进行亚硫酸氢盐转化时采用的是亚硫酸氢钠，在配置转化液时向亚硫酸氢钠中滴入氢氧化钠，得到5ml体积、ph＝5的溶液。
进一步的，所述s4在pcr扩增之后，将pcr扩增产物供于离子交换色谱，并获得检测信号的工序。
进一步的，所述离子交换色谱为阴离子交换色谱。
进一步的，所述离子交换色谱中使用的色谱柱填充剂在表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两者。
进一步的，所述s6中绘制基因扩张曲线时，以时间为横轴，每隔1分钟测量一次样本中β-actin和shox2基因的数量，并记录在纵轴上。
进一步的，所述s6中的空白对照仅用稀释液代替检测样本，阴性对照样本选取无支气管肺病灶患者的肺部灌洗液，阳性对照样本为病灶处灌洗液多次离心筛除蛋白质的对照液。
进一步的，在所述s7中若判断为甲基化阳性，则继续进行病理检查以明确病症。
综上所述，本发明主要具有以下有益效果：
一、本发明中利用了肿瘤细胞dna的甲基化特性，使得其具有良好的检测效果，检测的精度较高，当判断为甲基化阳性时，即有百分之98以上的肯定度判断为恶性肿瘤；
二、本发明中的设计了空白对照、阴性对照和阳性对照进一步增大了dna甲基化检测方法的判断合理性；
三、本发明中的dna甲基化检测方法步骤短，操作简单，适合推广应用。
具体实施方式
实施例1
一种支气管肺病灶灌洗液的shox2甲基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1、将患者支气管肺病灶处采集的灌洗液等量分为3份，作为3个样本；
s2、将s1中的3个样本分别应用dna提取试剂盒提取dna，应用uv分光光度计测定dna浓度及纯度，取浓度为7.2ng/ul且od260/280吸光光度比值为1.8为合格样本；dna提取试剂盒是根据氯化芐法构建的，能够从样本中提取基因组dna的试剂盒；uv分光光度计是利用紫外可见吸收光谱法，根据在特定吸收波长处所测得的吸收度，来进行药品的鉴别、纯度检查及含量测定的测量装置；
s3、亚硫酸氢盐转化，将所述s2中合格的样本进行亚硫酸氢盐转化；
s4、对所述s3中的样本进行实时荧光定量pcr，并以内参基因β-actin作为阳性对照，实验时采用20ulpcr反应体系；20ulpcr反应体系中10xbuffer为2ul，dntp为1.6ul，taq-酶为1ul；其中10xbuffer是用于琼脂糖凝胶电泳的10倍浓度的核酸样品用loadingbuffer，制品中含有sds，可即刻停止各种酶促反应，向酶促反应液中加入1/10量的本制品，即可停止反应，此溶液可直接用于琼脂糖凝胶电泳，dntp为脱氧核糖核苷三磷酸，taq-酶为dna聚合酶；
s5、对所述s4中的样本进行实时荧光定量pcr仪扩增，pcr反应条件为98℃/10″，并进行60个循环，实时荧光定量pcr是一种在dna扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(pcr)循环后产物总量的方法，；
s6、在阳性对照、阴性对照、空白对照有效的情况下，测量绘制样本中β-actin和shox2基因的指数扩张曲线，β-actin是pcr常用的内参，β-actin抗体是westernblot很好的内参指数。内参即是内部参照，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物，shox2基因的甲基化程度对判断肺部肿瘤有重大意义；
s7、若所述s6中样本中β-actin和shox2基因均有指数扩张曲线则判断为甲基化阳性，若样本中β-actin有指数扩增曲线，而shox2基因无扩增曲线则为甲基化阴性。
优选的，所述s1中将患者支气管肺病灶处采集的灌洗液等量分为3份，作为3个样本，样本体积不小于5ml。
优选的，所述s3中进行亚硫酸氢盐转化时采用的是亚硫酸氢钠，在配置转化液时向亚硫酸氢钠中滴入氢氧化钠，得到5ml体积、ph＝5的溶液。
优选的，所述s4在pcr扩增之后，将pcr扩增产物供于离子交换色谱，并获得检测信号的工序。
优选的，所述离子交换色谱为阴离子交换色谱。
优选的，所述离子交换色谱中使用的色谱柱填充剂在表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两者。
优选的，所述s6中绘制基因扩张曲线时，以时间为横轴，每隔1分钟测量一次样本中β-actin和shox2基因的数量，并记录在纵轴上。
优选的，所述s6中的空白对照仅用稀释液代替检测样本，阴性对照样本选取无支气管肺病灶患者的肺部灌洗液，阳性对照样本为病灶处灌洗液多次离心筛除蛋白质的对照液。
优选的，在所述s7中若判断为甲基化阳性，则继续进行病理检查以明确病症。
上述的实施例中利用了肿瘤细胞dna的甲基化特性，使得其具有良好的检测效果，检测的精度较高，当判断为甲基化阳性时，即有百分之98以上的肯定度判断为恶性肿瘤；由于上述的实施例中设计了空白对照、阴性对照和阳性对照进一步增大了dna甲基化检测方法的判断合理性；由于上述dna甲基化检测方法步骤短，操作简单，适合推广应用。
实施例2
一种支气管肺病灶灌洗液的shox2甲基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1、将患者支气管肺病灶处采集的灌洗液等量分为3份，作为3个样本；
s2、将s1中的3个样本分别应用dna提取试剂盒提取dna，应用uv分光光度计测定dna浓度及纯度，取浓度为7.6ng/ul且od260/280吸光光度比值为1.9为合格样本；
s3、亚硫酸氢盐转化，将所述s2中合格的样本进行亚硫酸氢盐转化；
s4、对所述s3中的样本进行实时荧光定量pcr，并以内参基因β-actin作为阳性对照，实验时采用20ulpcr反应体系；
s5、对所述s4中的样本进行实时荧光定量pcr仪扩增，pcr反应条件为98℃/10″，并进行60个循环；
s6、在阳性对照、阴性对照、空白对照有效的情况下，测量绘制样本中β-actin和shox2基因的指数扩张曲线；
s7、若所述s6中样本中β-actin和shox2基因均有指数扩张曲线则判断为甲基化阳性，若样本中β-actin有指数扩增曲线，而shox2基因无扩增曲线则为甲基化阴性。
优选的，所述s1中将患者支气管肺病灶处采集的灌洗液等量分为3份，作为3个样本，样本体积不小于5ml。
优选的，所述s3中进行亚硫酸氢盐转化时采用的是亚硫酸氢钠，在配置转化液时向亚硫酸氢钠中滴入氢氧化钠，得到5ml体积、ph＝5的溶液。
优选的，所述s4在pcr扩增之后，将pcr扩增产物供于离子交换色谱，并获得检测信号的工序。
优选的，所述离子交换色谱为阴离子交换色谱。
优选的，所述离子交换色谱中使用的色谱柱填充剂在表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两者。
优选的，所述s6中绘制基因扩张曲线时，以时间为横轴，每隔1分钟测量一次样本中β-actin和shox2基因的数量，并记录在纵轴上。
优选的，所述s6中的空白对照仅用稀释液代替检测样本，阴性对照样本选取无支气管肺病灶患者的肺部灌洗液，阳性对照样本为病灶处灌洗液多次离心筛除蛋白质的对照液。
优选的，在所述s7中若判断为甲基化阳性，则继续进行病理检查以明确病症。
实施例3
一种支气管肺病灶灌洗液的shox2甲基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1、将患者支气管肺病灶处采集的灌洗液等量分为3份，作为3个样本；
s2、将s1中的3个样本分别应用dna提取试剂盒提取dna，应用uv分光光度计测定dna浓度及纯度，取浓度为7.4ng/ul且od260/280吸光光度比值为1.84为合格样本；
s3、亚硫酸氢盐转化，将所述s2中合格的样本进行亚硫酸氢盐转化；
s4、对所述s3中的样本进行实时荧光定量pcr，并以内参基因β-actin作为阳性对照，实验时采用20ulpcr反应体系；
s5、对所述s4中的样本进行实时荧光定量pcr仪扩增，pcr反应条件为98℃/10″，并进行60个循环；
s6、在阳性对照、阴性对照、空白对照有效的情况下，测量绘制样本中β-actin和shox2基因的指数扩张曲线；
s7、若所述s6中样本中β-actin和shox2基因均有指数扩张曲线则判断为甲基化阳性，若样本中β-actin有指数扩增曲线，而shox2基因无扩增曲线则为甲基化阴性。
优选的，所述s1中将患者支气管肺病灶处采集的灌洗液等量分为3份，作为3个样本，样本体积不小于5ml。
优选的，所述s3中进行亚硫酸氢盐转化时采用的是亚硫酸氢钠，在配置转化液时向亚硫酸氢钠中滴入氢氧化钠，得到5ml体积、ph＝5的溶液。
优选的，所述s4在pcr扩增之后，将pcr扩增产物供于离子交换色谱，并获得检测信号的工序。
优选的，所述离子交换色谱为阴离子交换色谱。
优选的，所述离子交换色谱中使用的色谱柱填充剂在表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两者。
优选的，所述s6中绘制基因扩张曲线时，以时间为横轴，每隔1分钟测量一次样本中β-actin和shox2基因的数量，并记录在纵轴上。
优选的，所述s6中的空白对照仅用稀释液代替检测样本，阴性对照样本选取无支气管肺病灶患者的肺部灌洗液，阳性对照样本为病灶处灌洗液多次离心筛除蛋白质的对照液。
优选的，在所述s7中若判断为甲基化阳性，则继续进行病理检查以明确病症。
实施例4
一种支气管肺病灶灌洗液的shox2甲基化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1、将患者支气管肺病灶处采集的灌洗液等量分为3份，作为3个样本；
s2、将s1中的3个样本分别应用dna提取试剂盒提取dna，应用uv分光光度计测定dna浓度及纯度，取浓度为7.5ng/ul且od260/280吸光光度比值为1.85为合格样本；
s3、亚硫酸氢盐转化，将所述s2中合格的样本进行亚硫酸氢盐转化；
s4、对所述s3中的样本进行实时荧光定量pcr，并以内参基因β-actin作为阳性对照，实验时采用20ulpcr反应体系；
s5、对所述s4中的样本进行实时荧光定量pcr仪扩增，pcr反应条件为98℃/10″，并进行60个循环；
s6、在阳性对照、阴性对照、空白对照有效的情况下，测量绘制样本中β-actin和shox2基因的指数扩张曲线；
s7、若所述s6中样本中β-actin和shox2基因均有指数扩张曲线则判断为甲基化阳性，若样本中β-actin有指数扩增曲线，而shox2基因无扩增曲线则为甲基化阴性。
优选的，所述s1中将患者支气管肺病灶处采集的灌洗液等量分为3份，作为3个样本，样本体积不小于5ml。
优选的，所述s3中进行亚硫酸氢盐转化时采用的是亚硫酸氢钠，在配置转化液时向亚硫酸氢钠中滴入氢氧化钠，得到5ml体积、ph＝5的溶液。
优选的，所述s4在pcr扩增之后，将pcr扩增产物供于离子交换色谱，并获得检测信号的工序。
优选的，所述离子交换色谱为阴离子交换色谱。
优选的，所述离子交换色谱中使用的色谱柱填充剂在表面具有强阳离子性基团和弱阳离子性基团这两者。
优选的，所述s6中绘制基因扩张曲线时，以时间为横轴，每隔1分钟测量一次样本中β-actin和shox2基因的数量，并记录在纵轴上。
本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。