一种杨树质体表达系统的建立方法与流程

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种杨树质体表达系统的建立方法。具体包括杨树叶片再生体系、杨树质体转化载体的建立和杨树质体基因枪转化方法。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：

杨树是一种重要的经济林木和模式木本植物。山新杨是一种优良的杨树品种，它以采自嫩江县高峰林场山杨为母本，父本新疆杨来源于乌鲁木齐，于1964年进行杂交组合，经20年栽培试验，表现良好，性状稳定。适应性强，抗逆性好，常用于防风固沙。树干通直，树皮光滑淡绿色，披白粉，20年生树皮尚未开裂，果序自然脱落且不飞絮。

近年来，质体基因转化技术成为植物基因工程研究的热点之一，质体基因转化有诸多的优点，如：母系遗传、高效表达、无基因沉默、无位置效应、无基因污染等优点，而山新杨的繁殖是无性繁殖，不飞絮等特点，使其质体转基因更安全。

杨树作为用材林、防护林和四旁绿化的主要树种，但是目前危害杨树的病虫害种类很多，严重危害了杨树的正常生长。用质体转基因技术转抗虫基因、抗病基因和抗逆基因到杨树质体中，既能够达到相应的抗性效果,又增加了生物安全性。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)现有技术中，没有建立成熟的杨树质体表达系统。虽然在2006年，okumura等人在银白杨(populusalba)中表达了绿色荧光蛋白报告基因，但是10几年过去了，再也没有关于杨树质体转化方面的报道，也就是没有建立成熟稳定的杨树质体转化系统。

(2)杨树是木本植物，多数木本植物的再生较为困难，而用于杨树质体转化的材料再生更困难。

(3)没有适合用于杨树质体转化的较为完善的转化方法。

(4)没有用于山新杨质体转化的质体转化载体。

解决上述技术问题的意义：

经过多年的研究，本发明寻找到了山新杨质体转化的叶片再生体系，构建了山新杨质体转化载体和建立并优化了杨树基因枪转化方法，从而为杨树质体转基因成功奠定了坚实的基础，杨树质体转基因的再次成功为杨树质体转抗虫基因、抗病基因和抗逆基因奠定坚实的基础，并为杨树品种的改良提供一种有效的途径。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种杨树质体表达系统的建立方法。本发明的目的是建立成熟的杨树质体表达系统，包括杨树叶片再生体系、杨树质体转化载体和杨树质体基因枪转化方法。为杨树质体基因工程研究和应用提供有效的工具。

本发明是这样实现的，发明提出了一种杨树质体表达系统的建立方法，包括杨树叶片再生体系、杨树质体转化载体和杨树质体基因枪转化方法。从而为杨树质体转抗虫基因、抗病基因和抗逆基因和杨树品种的改良奠定坚实的基础。具体包括：

步骤1、山新杨高效叶片再生体系的建立

选取健壮的无菌山新杨(populusdavidianaxp.bolleana)幼嫩叶片，在叶片再生培养基pasim2中培养，把丛生芽转移至快繁培养基(同生根培养基)中培养，当组培苗生长4周左右(达到瓶高的1/2-2/3)时，选取顶端3-4个结节长度的茎段再放入生根培养基中生长，当此组培苗生长4周左右(达到瓶高的1/2-2/3)时，选取杨树组培苗顶端的第2-3片叶片作为转化的叶片材料。培养条件：25℃16h光照/20℃8h黑暗；光照强度：30-40μe·m^-2·s^-1。此杨树组培苗顶端的第2-3片叶片切成3mm*3mm大小的方块，转入叶片再生培养基pasim1中再生，叶片的再生率为100％，每个愈伤方块上丛生芽增殖数约为90.97个。

步骤2、山新杨质体转化载体的构建

以去除多克隆位点的质粒pbluescriptiiks(+)为载体骨架(seq:id:no:1)，把克隆的山新杨质体基因组中的左同源序列(seq:id:no:2)、右同源序列(seq:id:no:3)、烟草质体转化载体pyy12的中的aada表达盒和gfp表达盒(seq:id:no:4)克隆到去除多克隆位点的质粒pbluescriptiiks(+)中，构建了杨树质体转化载体pyy20。

步骤3、杨树质体基因枪转化体系的建立

首先把叶片材料置于渗透培养基paom中进行黑暗培养24小时之后，用金粉包裹杨树质体转化载体pyy20质粒dna，通过基因枪轰击叶片转化法，利用步骤1中高效的叶片再生体系，在含有30mg/l壮观霉素的pasim1培养基上筛选抗性芽，培养条件：25℃16h光照/20℃8h黑暗；光照强度：20-25μe·m^-2·s^-1。6次轰击得到了8个阳性苗，把得到的抗性芽转入含有30mg/l壮观霉素的pasim2培养基上，再经过2-3轮的叶片再生之后，southernbolt鉴定同质化抗性苗，从而得到同质化的转基因杨树组培苗。

步骤4、转基因杨树的炼苗和移栽

把得到的同质化转基因杨树组培苗移入土培基质(土培基质配方为：蛭石:草炭土:珍珠岩＝5:3:2)中，并在人工气候箱培养1-2个月，然后经过炼苗后，转入温室进行逐渐增强光照强度和降低湿度的培养，最后移栽到户外田间栽培培养。

步骤5

绿色荧光蛋白gfp基因在杨树质体中转录与表达

northernbolt分析显示了gfp基因的转录水平，westernblot分析表明了绿色荧光蛋白gfp基因在杨树质体中成功表达。

本发明的杨树质体表达系统的建立的亮点之一，是重现杨树质体转化，并且可以重复，并且也转化了其他基因，如抗虫基因，再就是本发明用的品种和现有技术中原先发表的用的杨树的品种不同，现有技术用的银白杨，本发明用的是山新杨。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明利用这个表达系统成功表达了绿色荧光蛋白gfp基因(gfp)。在山新杨质体转化中，基因枪轰击4次，得到了23个抗性芽，经southernblot鉴定后，阳性芽为8个，阳性率为34.78％。而在2006年，okumura等发表的文献中报道的银白杨质体转化中，基因枪轰击8次，得到了106个抗性芽，经southernblot鉴定后，阳性芽为21个，阳性率为19.81％。我们转化山新杨后得到的阳性芽阳性率比银白杨的阳性率高，但是因为品种不同，没有可比性。但是，本发明利用山新杨质体转化系统，本发明又成功转化了bt蛋白基因，并成功得到了同质化的抗虫杨树，说明本发明这个系统是成熟的，而且是稳定的，阳性苗移栽后成活率为100％。从而为杨树质体基因工程的研究和杨树新品种的开发奠定了坚实的基础。

附图说明

图1为本发明实施例提供的杨树转化载体pyy20构建图。

图2为本发明实施例提供的杨树质体转gfp基因同质化阳性苗的验证及gfp基因在质体中的转录和表达图。

图中：a：野生型杨树基因组和转gfp基因杨树基因组图；b：southernblot图；c：northernblot图；d：westernblot图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现有技术中，没有建立成熟的杨树质体表达系统,没有利用杨树叶片再生体系、杨树质体转化载体和杨树质体基因枪转化方法为杨树的质体基因工程研究和应用提供有效的工具。

下面结合具体分析对本发明的应用作进一步描述。

本发明实施例提供的杨树质体表达系统的建立方法，包括以下步骤：

步骤1、山新杨高效叶片再生体系的建立

选取健壮的无菌山新杨(populusdavidianaxp.bolleana)幼嫩叶片，在叶片再生培养基pasim2(4.4g/lms(duchefabiochemiem0245),0.08mg/lnaa,0.3mg/l6-ba,3％(w/v)蔗糖,0.54％(w/v)琼脂粉,ph5.7)中培养，把丛生芽转移至快繁培养基(同生根培养基parim：4.4g/lms(duchefabiochemiem0245),0.1mg/lnaa,3％(w/v)蔗糖,0.54％(w/v)琼脂粉,ph5.7)中培养，当组培苗生长4周左右(达到瓶高的1/2-2/3)时，选取顶端3-4个结节长度的茎段再放入生根培养基中生长，当此组培苗生长4周左右(达到瓶高的1/2-2/3)时，选取杨树组培苗顶端的第2-3片叶片作为转化的叶片材料，培养条件：25℃16h光照/20℃8h黑暗；光照强度：30-40μe·m^-2·s^-1。此杨树组培苗顶端的第2-3片叶片切成3mm*3mm大小的方块，转入再生培养基pasim1(4.4g/lms(duchefabiochemiem0245),0.1mg/lnaa,0.2mg/l6-ba,0.01mg/ltdz,3％(w/v)蔗糖,0.54％(w/v)琼脂粉,ph5.7)上再生，叶片的再生率为100％，每个愈伤方块上丛生芽增殖数约为90.97个。叶片在pasim1培养基上再生比在pasim2培养基上再生效率高，但再生后的丛生芽在pasim2培养基上比在pasim1培养基上生长的更快且更健壮。

步骤2、山新杨质体转化载体的构建

以去除多克隆位点的质粒pbluescriptiiks(+)为载体骨架，把克隆的山新杨质体基因组中的的左同源序列(trnfm-psab段)和右同源序列(trng-psbz段)、烟草质体转化载体pyy12的中的aada表达盒和gfp表达盒克隆到去除多克隆位点的质粒pbluescriptiiks(+)中，构建了杨树质体转化载体pyy20。具体构建方法见图1。

步骤3、杨树质体基因枪转化体系的建立

首先把叶片材料置于渗透培养基paom(4.4g/l,ms(duchefabiochemiem0245),0.1m山梨醇,0.1m甘露醇,3％(w/v)蔗糖,0.54％(w/v)琼脂粉,ph5.7)中进行黑暗培养24小时之后，用金粉包裹杨树质体转化载体pyy20质粒dna，通过基因枪轰击叶片转化法，利用步骤1中高效的叶片再生体系，在含有30mg/l壮观霉素的pasim1培养基上筛选抗性芽，大约在2个月左右会出现第一个抗性芽，在此培养基中继续培养8个月左右，期间会陆续有抗性芽出现。

培养条件：25℃16h光照/20℃8h黑暗；光照强度：20-25μe·m^-2·s^-1。6次轰击得到了8个阳性苗，把得到的阳性苗叶片置于含30mg/l壮观霉素的pasim2培养基上经过2-3轮的叶片再生，然后通过southernbolt鉴定同质化抗性苗，见图2a和图2b，从而得到同质化的转基因杨树组培苗。

步骤4、转基因杨树的炼苗和移栽

把得到的同质化转基因杨树组培苗移入土培基质(土培基质配方为：蛭石:草炭土:珍珠岩＝5:3:2)中，并在人工气候箱培养1-2个月，然后经过炼苗后，转入温室进行逐渐增强光照强度和降低湿度的培养，最后移栽到户外田间栽培培养。

步骤5、gfp基因在质体中的转录与表达

northernbolt分析显示了gfp基因的转录水平，见图2c，westernblot分析表明了绿色荧光蛋白gfp基因在杨树质体中成功表达。见图2d。

本发明所述的杨树质体表达系统的建立及应用。

本发明提供一种完善的杨树质体表达系统，包括杨树叶片再生体系、杨树质体转化载体和杨树质体基因枪转化方法。为杨树质体基因工程研究和应用提供有效的工具。

下面结合具体分析对本发明的应用作进一步描述。

实施例一

山新杨高效叶片再生体系的建立：选取健壮的无菌山新杨(populusdavidianaxp.bolleana)幼嫩叶片，在叶片再生培养基pasim2中培养，把丛生芽转移至快繁培养基(同生根培养基：4.4g/lms(duchefabiochemiem0245),0.1mg/lnaa,3％(w/v)蔗糖,0.54％(w/v)琼脂粉,ph5.7)中培养，当组培苗生长4周左右(达到瓶高的1/2-2/3)时，选取顶端3-4个结节长度的茎段再放入生根培养基中生长，当此组培苗再生长4周左右(达到瓶高的1/2-2/3)时，选取杨树组培苗顶端的第2-3片叶片作为转化的叶片材料，培养条件：25℃16h光照/20℃8h黑暗；光照强度：30-40μe·m^-2·s^-1。此杨树组培苗顶端的第2-3片叶片切成3mm*3mm大小的方块，转入再生培养基pasim1(4.4g/lms(duchefabiochemiem0245),0.1mg/lnaa,0.2mg/l6-ba,0.01mg/ltdz,3％(w/v)蔗糖,0.54％(w/v)琼脂粉,ph5.7)再生中，叶片的再生率为100％，每个愈伤方块上丛生芽增殖数约为90.97个。叶片在pasim1培养基上再生比在pasim2培养基上再生效率高，但再生后的丛生芽在pasim2培养基上比在pasim1培养基上生长的更快且更健壮。见图1。

实施例二

山新杨质体转化载体的构建：选择杨树叶绿体trng和trnfm基因间隔作为目标片段得插入位点。以此构建了山新杨质体转化载体pyy20载体。

首先把烟草质体转化载体pyy12质粒dna用限制性内切酶ncoi和xbai双酶切后，回收大片段，可获得去除gfp基因的pyy12载体骨架，再以pyy12质粒dna为模板，以gpf-noti-f(5’ctttaagaaggagatatacccatggtgagtaaaggagaagaacttttcactg3’)和gpf-noti-r(5’agcctttcgttttatttgatgcggccgctcattgtacagctcgtccatgcc3’)这对引物扩增得到gfp基因两端带有限制性酶切位点ncoi和noti序列的片段，然后再把得到的gfp基因片段通过无缝无酶连接到pyy12载体骨架上，通过酶切验证初步鉴定重组子，最后通过测序验证此重组子，把验证正确的重组子命名为pyy11。

根据银白杨(populusalbal.)叶绿基因组dna中psbz-psab区段序列(ap008956.1)设计一对引物psbz-psab-f(5’gatgtaggatctagaataagcatttgtg3’)和psbz-psab-r(5’tggcattggaagcacataacatta3’)。以山新杨叶绿体基因组dna为模板，用psbz-psab-f和psbz-psab-r这对引物扩增psbz-psab区段序列，把pcr扩增得到的片段克隆到克隆载体pmd18-t上，转化大肠杆菌xl10-gold，转化子经pcr验证和测序验证后，把正确的转化子命名为pyy15。测序后的山新杨叶绿体基因组psbz-psab区段序列经blast后，发现与银白杨叶绿体基因组dna中psbz-psab区段序列(ap008956.1)核苷酸一致性为96％，与新疆杨(populusalbavar.pyramidalis)叶绿体基因组dna中psbz-psab区段序列(mg262344.1)核苷酸一致性为98％，与山杨(populusdavidiana)叶绿体基因组dna中psbz-psab区段序列(kx306825.1)核苷酸一致性为98％。这些都证明我们所克隆的dna片段是山新杨质体基因组psbz-psab区段序列。

用限制性内切酶saci和kpni双酶切pbluescriptiiks(+)质粒dna，切除多克隆位点序列(mcs)得到的大片段作为载体骨架，命名为片段1；用限制性内切酶spei和sali双酶切pyy11质粒dna，得到含有aada表达盒和gfp表达盒的区段命名为片段2；以pyy15质粒dna为模板，用lhrr-f(5’ttttgtcgaccttaagctcgagtcttttctttcctcccccctc3’)(带有sali酶序列接头)和lhrr-r(5’ttttggtacctggcattggaagcacataacatta3’)(带有kpni酶序列接头)这对引物扩增trnfm-psab区段序列，得到的pcr产物再用限制性内切酶sali和kpni双酶切，获得的片段命名为片段3；以pyy15质粒dna为模板，用rhrr-f(5’ttttgagctcgatgtaggatctagaataagcatttgtg3’)(带有saci酶序列接头)和rhrr-r(5’ttttgctagccccgggagatctccgcgggggtagaattagactattagggtcaac3’)(带有nhei酶序列接头)这对引物扩增psbz-trng区段序列，得到的pcr产物再用限制性内切酶saci和nhei双酶切，获得的片段命名为片段4，把这四个片段按照摩尔比为1:2:2:2的量混合，用solutioni酶连接后转化大肠杆菌xl10-gold，在含有氨苄青霉素和壮观霉素的双抗平板上进行筛选，然后再挑选在蓝光激发下发绿色荧光的菌落，把这样的菌落提取其dna，经酶切验证和pcr验证后正确的重组子再送测序公司进行测序验证，经验证正确的重组子命名为pyy20，即获得到山新杨质体转化载体。见图2。

实施例三

杨树质体基因枪转化方法步骤：

1、转化植物叶片材料的渗透处理

选取经过亚培养的杨树组培苗顶端第2-3片叶片作为转化的叶片材料，把叶片的远轴面朝上置于渗透培养基paom(4.4g/l,ms(duchefabiochemiem0245),0.1m山梨醇,0.1m甘露醇,3％(w/v)蔗糖,0.54％(w/v)琼脂粉,ph5.7)上黑暗24小时备用。

2、质粒dna的准备

把质粒pyy20转化大肠杆菌xl10-gold后得到单菌落，挑取单菌落于含有氨苄青霉素抗性的lb液体培养基中37℃中过夜培养，不超过16小时，收集菌体用阴离子交换试剂盒(如nucleobond@xtraplasmidpurification)提取质粒，提取的dna溶于无菌milliq水中。

3、金粉包裹dna

(1)称取1.5毫克金粉置于1.5毫升eppendorf管中，在管中加入600微升无水乙醇，涡旋1分钟；

(2)1150g离心15秒；

(3)小心去除上清液；

(4)加入600微升无菌miliq水，用eppendorf枪头混合均匀，1150g，离心15秒；

(5)小心去除上清液；

(6)加入172微升无菌miliq水，用用eppendorf枪头混合均匀；

(7)在管中加入2.5m氯化钙溶液175微升，涡旋1s，再加入0.1m亚精胺溶液35微升，涡旋1s；

(8)置于冰上10min，每1分钟重悬1次；

(9)1150g，离心15秒；

(10)小心去除上清液；

(11)加入600微升无水乙醇，混合均匀；

(12)1150g，离心15秒；

(13)小心去除上清液；

(14)重复步骤11-13；

(15)加入50微升无水乙醇重悬；

(16)轰击时，每个微载片使用6.5微升悬液。

4、基因枪轰击

(1)用95％乙醇浸泡微载片5分钟，用95％乙醇浸泡可裂膜1分钟，用95％乙醇浸泡阻拦网10分钟，分别把它们置于无菌大培养皿中，在超净工作台上干燥。

(2)操作基因枪，参数如下：真空度28，氦气压900psi，阻拦网到平铺的叶片距离为9厘米左右。

(3)轰击后的叶片切成3mm*3㎜大小，远轴面朝上置于再生筛选培养基上生长。

实施例四

杨树抗性苗的筛选：

(1)经基因枪轰击后的叶片材料切成3mm*3㎜大小，远轴面朝上置于含30mg/l壮观霉素的pasim1筛选培养基上直至抗性芽出现，在此培养基上每隔1-2月换1次培养基，大约在2个月左右会出现第一个抗性芽，在此培养基中继续培养8个月左右，期间会陆续有抗性芽出现。筛选培养条件为：25℃16h光照/20℃8h黑暗，光照强度：20-25μe·m^-2·s^-1。

(2)把抗性芽转入含30mg/l壮观霉素的pasim2培养基上继续培养，待长出叶片后，通过southernbolt分析抗性苗。southernbolt分析用罗氏地高辛试剂盒(dighighprimednalabelinganddetectionstarterkitii)。具体分析如下：首先提取抗性苗叶片基因组dna和野生型杨树叶片基因组dna，把提取的基因组dna用限制性内切酶bglii，37℃酶切20小时，再在1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳后，用半干毛细管转移法把凝胶中的dna片段转移到带正电荷的尼龙膜(gehealthcare,usa)上。以杨树基因组dna为模板，用psab-probe-f(5’ttagccaaaggtgtacgttcatgag3’)和psab-probe-r(5’ttgcccggctggttaaatgc3’)这对引物扩增得到的587bp的片段制备地高辛标记的psab探针，探针的标记和杂交按照罗氏地高辛试剂盒手册进行操作。野生型杨树叶片杂交出3504bp大小的带，达到同质化的抗性苗叶片仅仅杂交出4789bp大小的带，而未达到同质化的抗性苗叶片会杂交出3504bp和4789bp这两条带。见图2a与图2b。

(3)把未达到同质化的阳性苗的叶片切成3㎜*3㎜大小，在含30mg/l壮观霉素的pasim2培养基上进行2-3轮叶片再生之后，通过southernbolt检测再生的抗性苗是否达到同质化，把同质化的抗性苗转入生根培养基中继续培养。

(4)6次轰击得到了8个阳性苗，在含30mg/l壮观霉素的pasim2培养基上经过2-3轮的叶片再生，经southernbolt鉴定同质化抗性苗，从而得到同质化的转基因杨树组培苗。

实施例五

转基因杨树同质化组培苗的炼苗和移栽：把同质化抗性苗置于30mg/l壮观霉素的生根培养基中培养，把生根完好，生长健壮的同质化抗性苗的培养瓶逐步开盖，向全开盖的培养瓶中倒入适量蒸馏水，开盖3-4天炼苗，加入蒸馏水以使固体培养基变软容易清洗，将炼苗后的同质化抗性苗去除后清洗根系上的培养基，再将根浸泡在蒸馏水中过夜，以使根系上的培养基彻底清除。培养条件：25℃16h光照/20℃8h黑暗，光照强度：～30-40μe·m^-2·s^-1，移栽入土培基质(土培基质配方为：蛭石:草炭土:珍珠岩＝5:3:2)中，置于培养箱中，每隔2-3天浇水1次，每隔1周浇1次1/8ms基本盐，光照条件为25℃16h光照/20℃8h黑暗，光照强度逐渐加强，从40μe·m-2·s-1左右升高到80μe·m^-2·s^-1左右，每隔3天升高10μe左右的强度，湿度从90％下降至65％逐渐下降，每隔3天左右下降5％的湿度，大约在培养箱培养至株高30厘米左右便可移栽到温室中用盆钵培养，培养条件：25℃16h光照/20℃8h黑暗，湿度50％左右。

实施例六

gfp基因在质体中的转录与表达：northernbolt分析显示了gfp基因的转录水平，见图2c，westernblot分析表明了绿色荧光蛋白gfp基因在杨树质体中成功表达。见图2d。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>湖北大学

<120>一种杨树质体表达系统的建立方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2865

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggtacccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcttggcgtaatcatggtc60

atagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccgg120

aagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgtt180

gcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcgg240

ccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactga300

ctcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaat360

acggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagca420

aaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccc480

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aagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgcc600

gcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctc660

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