提高高GC含量噬铜菌属细菌电转化效率的方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种提高高gc含量噬铜菌属细菌电转化效率的方法。

背景技术：

噬铜菌属(genuscupriavidus)是细菌分类学中的一个属，目前该属下包括17个种，分别为：c.alkaliphilus，c.basilensis，c.campinensis，c.gilardii，c.laharis，c.metallidurans，c.necator，c.nantongensis，c.numazuensis，c.oxalaticus，c.pampae，c.pauculus，c.pinatubonensis，c.plantarum，c.respiraculi，c.taiwanensis，c.yeoncheonensis。所属细菌为革兰氏阴性菌，具有杆状，专性好氧，能运动，有鞭毛等特征，对铜，钴，锌等金属耐受。所属细菌大部分分离自土壤、水、池塘沉积物、豆科植物结节和火山泥流沉积物。通过对已报道的12个种的基因组测序结果分析显示，噬铜菌属属于高gc含量(63％-69％)细菌。目前报道的噬铜菌属细菌对环境具有重要的作用和影响，如cupriavidustaiwanensis是一种根瘤菌，能够与多种豆科植物共生进行生物固氮；一些种的细菌具有促进植物生长的特征，如分泌植物生长调节剂吲哚乙酸，促进磷酸盐增容等；cupriaviduspampae与cupriavidusnumadzuensis被报道可以降解三氟乙烯等有机污染物，cupriavidusnantongensis与cupriavidusgilardii被报道能够将多种有机磷农药与新烟碱类农药完全矿化。

为了研究噬铜菌属细菌在土壤，植株根际以及植物体内的迁移，充分发挥其生物技术潜力和应用价值，亟待提出一种稳定、高效的电转化技术方法。常规的细菌转化方法包括化学转化法和电转化法，电转化法以其简单高效被广泛使用，但这些方法一般仅适用于大肠杆菌等模式生物，对于其余种属的细菌转化效率低下，尤其是对于含有高gc含量的细菌，表面丰富的胞外聚合物(eps)使转化效率更低甚至无法转化。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种提高高gc含量噬铜菌属细菌电转化效率的方法。

为了实现本发明目的，本发明提供的提高高gc含量噬铜菌属细菌电转化效率的方法，高gc含量噬铜菌属细菌经活化后接种于含有表面活性剂和果胶酶的稀释的富营养培养基中，培养一段时间后，离心收集菌体，然后用无菌去离子水重悬洗涤数次，离心收集菌体沉淀，重悬于预冷的甘油水溶液中，制备得到的感受态细胞进行电转化。

其中，所述富营养培养基为lb液体培养基或soc液体培养基。

前述的方法，富营养培养基稀释的倍数为2-5倍，优选5倍。

本发明中，lb液体培养基配方为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph自然。lb固体培养基是在液体培养基基础上添加浓度为17g/l的琼脂。

稀释5倍的lb液体培养基(即20％lb液体培养基)的配方为：胰蛋白胨2g/l，酵母提取物1g/l，氯化钠2g/l，ph自然。

本发明中，所述表面活性剂为非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂包括但不限于吐温80。所述表面活性剂的终浓度为1％-2％，优选1％。

所述果胶酶的终浓度为20-100u/ml，优选100u/ml。

前述的方法，将无菌去离子水洗涤后离心得到的菌体沉淀重悬于预冷的甘油水溶液中，然后离心收集菌体沉淀，重复此操作1次，然后将所得菌体重悬于预冷的甘油水溶液中，制备得到感受态细胞。

优选地，所述甘油水溶液的浓度为10％-20％，优选10％。

在本发明的一个具体实施方式中，所述方法包括以下步骤：

1)从冻存管中挑取一环高gc含量噬铜菌属细菌于lb固体培养基上培养活化，挑取活化后的单菌落，接种于含有1％v/v吐温80和100u/ml果胶酶稀释5倍的lb液体培养基中，于37℃震荡培养至od600＝0.6左右，然后6000g4℃离心收集菌体，并用无菌去离子水重悬洗涤2次；

2)感受态细胞的制备：将步骤1)中收集得到的菌体用预冷的10％甘油水溶液重悬，6000g4℃离心，去上清收集菌体并重复此操作1次，所得菌体重悬于10％预冷的甘油水溶液中；

3)电转化：将步骤2)所得感受态细胞置于冰上，加入质粒dna溶液，于冰上放置一段时间，将上述混合溶液加入2mm预冷的电极杯中，在2.5kv，25uf，200-400ω条件下进行电击；然后向电极杯中加入lb液体培养基或soc液体培养基混匀，于37℃恒温震荡培养复苏菌体；最后将菌液涂平板(含相应抗生素)，计算转化率。

本发明中，所述高gc含量噬铜菌属细菌选自cupriavidustaiwanensis、cupriavidusnantongensis、cupriavidusgilardii。更优选cupriavidustaiwanensisx1、cupriavidusgilardiit-1。

进一步地，本发明提供一种用于提高高gc含量噬铜菌属细菌电转化效率的试剂。所述试剂为含有1％-2％v/v吐温80和20-100u/ml果胶酶的20％-50％lb液体培养基。优选地，所述试剂为含有1％v/v吐温80和100u/ml果胶酶的20％lb液体培养基。

使用时，高gc含量噬铜菌属细菌菌体用所述试剂洗涤或者将高gc含量噬铜菌属细菌在所述试剂中培养一段时间，以有效减少噬铜菌属细菌胞外聚合物，洗涤或培养后离心收集菌体，可进一步制备成感受态细胞，进行电转化。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

采用经稀释的lb液体培养基培养高gc含量噬铜菌属细菌，通过减少培养基中营养物质含量以有效减少噬铜菌属细菌胞外聚合物的产生，然后进行如下操作：

a、按照常规方法制备感受态细胞，进行电转化；或，

b、将培养好的高gc含量噬铜菌属细菌菌体用所述试剂洗涤后，离心收集菌体，制备感受态细胞，进行电转化。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(一)利用常规lb培养基培养高gc含量噬铜菌属细菌时，所得菌体的营养含量是过剩的，导致细菌在生长过程中会产生大量的胞外聚合物，本发明通过对培养基进行改良，发现减少培养基中营养物质含量可以有效减少噬铜菌属细菌胞外聚合物的产生。

(二)培养过程中加入少量表面活性剂(如吐温80)，一方面可以使细菌分散，减少细菌之间相互粘附，另一方面可以溶解油脂类物质，减少胞外聚合物的产生。考虑到表面活性剂对细菌生长具有一定的抑制作用，使用浓度不能过高，推荐用量1％-2％。

(三)培养过程中加入适量果胶酶。以多种纯净物作为培养基原料时，细菌产生的胞外聚合物多为多糖(ps)类物质，加入果胶酶可以有效去除这些多糖类物质。可有效制备获得感受态细胞。

(四)相较于已报道的噬铜菌属近源种电转化方法，本发明方法的电转化效率提高了14.75倍左右。

(五)本发明针对高gc含量噬铜菌属细菌的特点开发出一种稳定、高效的电转化方法，为高效率转基因体系的构建以及深入研究分析噬铜菌属细菌提供有力的技术支持。

附图说明

图1为本发明实施例1中成功转入质粒ptr102：：luxab的阳性转化子。

图2为本发明实施例2中成功转入质粒ptr102：：gfp的阳性转化子。

图3为本发明实施例3中成功转入质粒ptr102：：gfp的阳性转化子。

图4为本发明实施例5中不同培养基条件下cupriavidustaiwanensisx1胞外聚合物情况。

图5为本发明实施例5中采用不同电转化法对cupriavidustaiwanensisx1进行电转化的转化率比较。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw，molecularcloning：alaboratorymanual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的果胶酶购自江苏锐阳生物科技有限公司(9032-75-1，100u/mg)。

实施例1质粒ptr102：：luxab电转化导入cupriavidustaiwanensisx1

(1)受体菌的培养：从冻存管中取一环cupriavidustaiwanensisx1于lb固体培养基上37℃恒温培养24h，挑取活化后的单菌落，接种于100ml含有1％v/v吐温80和100u/ml果胶酶的20％lb液体培养基中，于37℃震荡培养至od600＝0.6左右，然后6000g4℃离心15min收集菌体，并用无菌去离子水重悬洗涤2次。

(2)感受态细胞的制备：将步骤(1)所得菌体，重悬于10％预冷的甘油中，5000g于4℃恒温离心10min，去上清收集菌体，重复此操作一次，所得菌体重悬于1ml10％预冷的甘油中，所得感受态可直接用于转化或保存于-80℃冰箱。

(3)电转化：

a.取100ul步骤(2)中所得感受态细胞置于冰上解冻。

b.分别加入1ug质粒ptr102：：luxab(质粒序列见seqidno：1)，于冰上放置30min。

c.将(b)中感受态细胞与质粒dna混合溶液加入2mm预冷的电极杯中，在2.5kv，25uf，400ω条件下进行电击。

d.向(c)中溶液中加入500ulsoc液体培养基，轻轻混匀，转入1.5mlep管中，于37℃恒温震荡培养1h复苏菌体。

e.取(d)中所培养菌液100ul涂布于含有质粒所带抗性相应抗生素的lb固体培养基上，37℃恒温培养24h。利用平板计数仪对长出的菌落数进行计数。

质粒ptr102：：luxab含有发光酶基因luxab，在平板上层加10ul癸醛，成功转入质粒的细菌不仅能在相应抗生素抗性平板上生长，同时在暗室条件下可发光，如图1所示。

本实施例中电转化效率可达2.3×10⁴cfu/ug～2.7×10⁴cfu/ug。

实施例2质粒ptr102：：gfp电转化导入cupriavidustaiwanensisx1

与实施例1不同的是，将步骤(3)b中的质粒ptr102：：luxab换为ptr102：：gfp。

质粒ptr102：：gfp的构建方法如下：1)以商品化质粒ppk2-osca-gfp为模板，扩增gfp基因；2)利用限制性内切酶psti与kpni对ptr102：：luxab进行双酶切；3)将扩增得到的gfp基因插入到ptr102：：luxab经双酶切后回收的大片段中，构建得到质粒ptr102：：gfp。

质粒ptr102：：gfp含有绿色荧光蛋白基因gfp，成功转入质粒的细菌不仅能在相应抗生素抗性平板上生长，同时在荧光显微镜下，成功转入质粒的细菌可发出绿色荧光，如图2所示。

本实施例中电转化效率可达2.0×10⁴cfu/ug～2.4×10⁴cfu/ug。

实施例3质粒ptr102：：gfp电转化导入cupriavidusgilardiit-1

与实施例2不同的是，将步骤(1)中的cupriavidustaiwanensisx1换为cupriavidusgilardiit-1。

质粒ptr102：：gfp含有绿色荧光蛋白基因gfp，成功转入质粒的细菌不仅能在相应抗生素抗性平板上生长，同时在荧光显微镜下，成功转入质粒的细菌可以发出绿色荧光，如图3所示。

本实施例中电转化效率可达1.7×10⁴cfu/ug～1.9×10⁴cfu/ug。

实施例4质粒ptr102：：luxab电转化导入cupriavidusnantongensislmg29218

与实施例1不同的是，将步骤(1)中的cupriavidustaiwanensisx1换为cupriavidusnantongensislmg29218。

本实施例中电转化效率可达2.3×10⁴cfu/ug～2.7×10⁴cfu/ug。

实施例5不同电转化方法的比较

(一)传统的大肠杆菌电转化法对cupriavidustaiwanensisx1进行电转化

1.收集菌体：将活化后的cupriavidustaiwanensisx1接种于100mllb液体培养基，37℃恒温培养至od600＝0.6，6000g4℃离心15min收集菌体，并用无菌去离子水重悬洗涤2次。

2.感受态细胞的制备：将步骤1中收集得到的菌体用20％预冷的甘油重悬，6000g4℃离心15min，去上清收集菌体并重复此操作1次，所得菌体重悬于1ml20％预冷的甘油中，以100ul每支分装后直接用于转化或保存于-80℃冰箱。

3.电转化：将步骤2所得感受态细胞在冰上解冻，加入1ug质粒ptr102：：luxab，于冰上放置30min，将混合溶液加入2mm预冷的电极杯中，在2.5kv，25uf，400ω条件下进行电击。向电极杯中加入500ulsoc液体培养基，轻轻混匀，转入1.5mlep管中，于37℃恒温震荡培养1h复苏菌体。取复苏后菌体100ul涂布于含有质粒所带抗性相应抗生素的lb固体培养基，37℃恒温培养24h，利用平板计数计算转化率。

(二)已报道的噬铜菌属细菌(c.necatorjmp134)电转化法对cupriavidustaiwanensisx1进行电转化

1.收集菌体：将活化后的cupriavidustaiwanensisx1接种于100ml无机盐液体培养基(1.0g/l氯化钠，0.1g/l七水合硫酸镁，0.3g/l磷酸二氢钾，1g/l磷酸氢二钾，ph7.0)中，37℃恒温培养至od600＝0.6，6000g4℃离心15min收集菌体，并用无菌去离子水重悬洗涤2次。

2.感受态细胞制备：将步骤1中收集得到的菌体用预冷的1m山梨醇溶液重悬，6000g4℃离心15min，去上清收集菌体并重复此操作1次，所得菌体重悬于400ul1m山梨醇中，以40ul每支分装后直接用于转化或保存于-80℃冰箱。

3.电转化：步骤同上述(一)。

(三)已报道的近源种(ralstoniasolanacearum)电转化法对cupriavidustaiwanensisx1进行电转化

1.收集菌体：将活化后的cupriavidustaiwanensisx1接种于100mllb液体培养基，28℃恒温培养至od600＝0.8，6000g4℃离心15min收集菌体，并用无菌去离子水重悬洗涤2次。

2.感受态细胞的制备：将步骤1中收集得到的菌体用预冷的10％甘油重悬，6000g4℃离心15min，去上清收集菌体并重复此操作1次，所得菌体重悬于1ml10％预冷的甘油中，以100ul每支分装后直接用于转化或保存于-80℃冰箱。

3.电转化：将步骤2所得感受态细胞在冰上解冻，加入lug质粒ptr102：：luxab，于冰上放置30min，将混合溶液加入2mm预冷的电极杯中，在2.4kv，25uf条件下进行电击。向电极杯中加入500ulsoc液体培养基，轻轻混匀，转入1.5mlep管中，于37℃恒温震荡培养1h复苏菌体。取复苏后菌体100ul涂布于含有质粒所带抗性相应抗生素的lb固体培养基，28℃恒温培养24h，利用平板计数计算转化率。

(四)本发明电转化法对cupriavidustaiwanensisx1进行电转化

1.收集菌体：从冻存管中取一环cupriavidustaiwanensisx1于lb固体培养基上37℃恒温培养24h，挑取活化后的单菌落，接种于100ml含有1％v/v吐温80和100u/ml果胶酶的20％、50％和100％lb液体培养基中，于37℃震荡培养至od600＝0.6左右，6000g4℃离心15min收集菌体，并用无菌去离子水重悬洗涤2次。

2.感受态细胞的制备：将步骤1中收集得到的菌体用预冷的10％甘油重悬，6000g4℃离心15min，去上清收集菌体并重复此操作1次，所得菌体重悬于1ml10％预冷的甘油中，以100ul每支分装后直接用于转化或保存于-80℃冰箱。

3.电转化：将步骤2所得感受态细胞在冰上解冻，加入1ug质粒ptr102：：luxab，于冰上放置30min，将混合溶液加入2mm预冷的电极杯中，在2.5kv，25uf，200-400ω条件下进行电击。向电极杯中加入500ulsoc液体培养基，轻轻混匀，转入1.5mlep管中，于37℃恒温震荡培养1h复苏菌体。取复苏后菌体100ul涂布于含有质粒所带抗性相应抗生素的lb固体培养基，37℃恒温培养24h，利用平板计数计算转化率。

图4是不同培养基条件下cupriavidustaiwanensisx1胞外聚合物情况。从图4可以看出，20％液体培养基培养收集得到的菌体在10％甘油重悬状态下胞外聚合物最少，细菌形态最好，而常规lb液体培养基(即100％lb液体培养基)收集得到的菌体在10％甘油重悬状态下大部分被胞外聚合物包裹，形成粘稠状态，难以沉淀用以制备感受态细胞。

图5是采用不同电转化法对cupriavidustaiwanensisx1进行电转化的转化率比较。

通过以上几种电转化方法的比较，结果显示前三种方法均不能成功转化c.taiwanensis。并且实验中发现，在使用甘油重悬菌体时会形成黏稠状菌悬液，表明在这些方法条件下形成了大量的胞外聚合物，感受态细胞无法有效获得。

实施例6不同培养基条件下的cupriavidustaiwanensisx1电转化效率比较

采用实施例1的方法，仅步骤(1)中活化后的单菌落接种的培养基成分不同。具体如下：

利用20％lb液体培养基，最终cupriavidustaiwanensisx1的电转化效率是(2.0±0.1)×10⁴cfu/ug。

利用含有1％v/v吐温80的20％lb液体培养基，最终cupriavidustaiwanensisx1的电转化效率是(2.2±0.1)×10⁴cfu/ug。

利用含有100u/ml果胶酶的20％lb液体培养基，最终cupriavidustaiwanensisx1的电转化效率是(2.2±0.2)×10⁴cfu/ug。

利用含有1％v/v吐温80和100u/ml果胶酶的20％lb液体培养基，最终cupriavidustaiwanensisx1的电转化效率是(2.5±0.2)×10⁴cfu/ug。

从以上比较可以看出，通过减少培养基中营养物质含量并加入适量的表面活性剂(吐温80)和果胶酶可以有效减少噬铜菌属细菌胞外聚合物的产生，大大提高了感受态细胞的电转化效率。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>安徽农业大学

<120>提高高gc含量噬铜菌属细菌电转化效率的方法

<130>pi201810537

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>13510

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gacctcgatcgtcggacccctcctcttcacggcgatctatgcggcttctataacaacgtg60

gaacgggtgggcatggattgcaggcgctgccctctacttgctctgcctgccggcgctgcg120

tcgcgggctttggagcggcgcagggcaacgagccgatcgctgatcgtggaaacgataggc180

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