一种适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法与应用与流程

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法与应用。

背景技术：

沙门菌是公共卫生学上具有重要意义的人兽共患病原菌，是各国公认、全球报道最多、世界最常见引发食源性疾病的首要病原菌，能引起胃肠炎、菌血症和伤寒等疾病。沙门菌属的大部分成员具有很强的致病性。沙门菌属于肠杆菌科沙门菌属，为两端钝圆、中等大小的革兰氏阴性菌，无芽孢，一般无荚膜，除鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌外，其余都有周身鞭毛，能运动，大多数具有纤毛，需氧或兼性厌氧菌。沙门菌最常侵害幼年、青年动物，使之发生败血症、胃肠炎及其他组织局部炎症。

外膜蛋白是原核生物细胞膜的重要组成成分之一，在维持细菌正常形态结构及细菌在机体内的生存和繁殖中发挥着不可替代的作用。外膜蛋白占细胞外膜成分的1/2左右，在维持细胞膜的流动性、维持细胞结构和保证物质转运等方面发挥重要作用。同时，外膜蛋白与细菌的致病性、抗药性和免疫原性等方面也有一定的联系。近年来，细菌细胞膜中的一种重要组成成分外膜蛋白(omp)的免疫作用越来越受到科技人员的关注。实验证明，omp具有良好的免疫原性，不仅可刺激体液免疫，而且也可刺激细胞免疫作用。

现阶段，常用于提取外膜蛋白的方法有碳酸钠法、等密度梯度离心法和sarkosyl法，triton-x114法，这些方法对仪器设备的要求比较高，提取过程相对繁琐，同时由于沙门氏菌细胞膜结构的特殊性而很难严格的将同属膜结构的质膜与外膜区分开。因此，现有的方法不适用于提取沙门氏菌的外膜蛋白。

技术实现要素：

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法。该方法步骤简单、操作方便、所需设备少，适于高纯度高活性外膜蛋白的大量提取，质与量可同时满足蛋白活性、结构和疫苗研发等后续实验要求。

本发明的另一目的在于提供所述适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法，包括以下步骤：

(1)将沙门氏菌外膜蛋白的基因克隆到表达载体中，得到重组表达载体；然后将重组表达载体导入宿主沙门菌中，得到重组菌株；

(2)将步骤(1)中得到的重组菌株进行扩大培养，然后加入阿拉伯糖，再离心收集菌体并冷冻保存，得到冷冻菌体；

(3)向步骤(2)中得到的冷冻菌体中加入蛋白裂解液重悬菌体，并加入苯甲基磺酰氟溶液，混合均匀后恒温超声破碎，然后离心、收集上清，得到上清液i；将上清液i再次离心，收集蛋白质沉淀；

(4)向步骤(3)中收集的蛋白质沉淀中加入外膜蛋白提取液，重悬沉淀并充分混匀后置于4℃条件下震荡孵育3～4h，然后离心、收集上清，得到上清液ii；

(5)将步骤(3)中得到的上清液ii进行蛋白分离纯化，得到沙门氏菌外膜蛋白。

步骤(1)中所述的沙门氏菌外膜蛋白的基因是以沙门菌的基因组dna为模板通过pcr扩增得到。

所述的沙门菌为鼠伤寒沙门菌；优选为鼠伤寒沙门菌sl1344。

所述的pcr扩增引物是针对acrb基因而设计的引物。

步骤(1)中所述的表达载体为原核表达载体；优选为带有组氨酸标签的原核表达载体；更优选为带有组氨酸标签的pbad33表达载体。

步骤(1)中所述的沙门菌为鼠伤寒沙门菌；优选为鼠伤寒沙门菌sl1344。

所述的适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法，还包括将步骤(1)中的重组菌株利用氯霉素药板进行筛选的步骤。

所述的氯霉素药板中氯霉素的浓度为25μg/ml。

步骤(2)中所述的扩大培养的条件优选为：37℃震荡培养过夜。

步骤(2)中所述的扩大培养所用培养基为lb液体培养基；优选为含有25μg/ml氯霉素的lb液体培养基。

步骤(2)中所述的阿拉伯糖的添加量为按其在体系中的终浓度为0.2％(w/v)计算。

步骤(2)中所述的离心的条件优选为：10000rpm离心8min。

步骤(2)中所述的冷冻保存的温度为-80℃。

步骤(3)中所述的蛋白裂解液的组成成分为：ph7.0、50mmtris-hcl以及10％(v/v)甘油。

步骤(3)中所述的菌体与蛋白裂解液的体积比优选为1：5。

步骤(3)中所述的苯甲基磺酰氟溶液为苯甲基磺酰氟溶于异丙醇得到的溶液；优选为饱和苯甲基磺酰氟溶液(即饱和苯甲基磺酰氟异丙醇溶液)。

步骤(3)中所述的苯甲基磺酰氟溶液与蛋白裂解液的体积比为1：500。

步骤(3)中所述的超声的条件为：恒温4℃，破碎时间3h，10s/次，每次间隔10s，ampl值为50％。

步骤(3)中所述的离心的条件为：4℃、3500～4500g离心10min；优选为：4℃、4000g离心10min。

步骤(3)中所述的再次离心的条件为：4℃、40000～50000g离心60min；优选为：4℃、50000g离心60min。

步骤(4)中所述的外膜蛋白提取液的组成成分为：2％(w/v)十二烷基-β-d-麦芽糖苷，ph7.0、50mmtris-hcl以及10％(v/v)甘油。

步骤(4)中所述的蛋白质沉淀与外膜蛋白提取液的体积比优选为1：10。

步骤(4)中所述的孵育的时间优选为3h。

步骤(4)中所述的离心的条件为：4℃、40000～50000g离心60min。

步骤(5)中所述的分离纯化为采用ni-nta柱进行分离纯化；优选为通过如下步骤实现：

(a)向上清液ii中加入ni-nta柱填料和咪唑，然后置于4℃条件下震荡孵育1～2h，得到ni-nta混悬液；

(b)将ni-nta混悬液转移到柱子中，弃去上清，然后将ni-nta柱用清洗液冲洗，再用洗脱液洗脱，得到纯化后的沙门氏菌外膜蛋白。

步骤(a)中所述的ni-nta柱填料与上清液ii的体积比为1：1000。

步骤(a)中所述的咪唑的添加量为按其在体系中的终浓度为50mm添加。

步骤(b)中所述的清洗液的组成成分为：ph7.5、20mmtris-hcl，0.3mnacl，10％(v/v)甘油，0.2％(w/v)十二烷基-β-d-麦芽糖苷和50mm咪唑。

步骤(b)中所述的清洗液的用量优选为按20倍ni-nta柱体积计算。

步骤(b)中所述的洗脱液的组成成分为：ph7.5、20mmtris-hcl，0.3mnacl，10％(v/v)甘油，0.2％(w/v)十二烷基-β-d-麦芽糖苷和500mm的咪唑。

步骤(b)中所述的洗脱液的用量优选为按2.5倍ni-nta柱体积计算。

所述的适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法在提取沙门氏菌外膜蛋白、或在制备沙门氏菌外膜蛋白疫苗中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明包括表达载体的构建与导入、菌体培养与收集、蛋白裂解、恒温超声振荡等步骤，然后收集蛋白质沉淀并用外膜蛋白提取液处理，将提取液处理过的溶液离心后保留上清液，用柱填料和咪唑孵育后，梯度过柱洗脱，即得到高纯度沙门氏菌外膜蛋白。该方法适于大量提取和纯化沙门菌外膜蛋白的方法，在调整蛋白提取步骤和选取最优试剂的同时，量化了每个步骤中试剂的用量，大大提高了蛋白提取的效率和纯净度，有效除去了目的蛋白之外的杂质，建立了一种大量提取高纯度细菌外膜蛋白的方法。

2、本发明仅采用超声破碎细胞，所用蛋白裂解液配方可使外膜蛋白充分释放，提高了外膜蛋白纯化效率。

3、本发明通过选取苯甲基磺酰氟、十二烷基-β-d-麦芽糖苷等试剂、增加孵育步骤，使得非超速离心即可得到大量高纯度的外膜蛋白。传统的方法需使用超速离心(≥100000g)，很多实验室难以满足该离心条件。

4、本发明有效提高了外膜蛋白的提取量和纯度，仅相同浓度咪唑的洗脱液即可得到高浓度和纯度的目的蛋白。

5、本发明的方法与传统方法相比，步骤简单、操作方便、对仪器无过高要求，该方法重复性好，所得蛋白的纯净度高，满足蛋白活性、结构和疫苗研发等后续实验要求，对外膜蛋白的研究具有重要意义。

附图说明

图1是沙门氏菌外膜蛋白sds-page电泳图；其中，泳道m为蛋白maker；泳道1～4为本发明所得蛋白(从条带数量与形状可看出本发明方法得到的蛋白纯度高)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。如没有特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。如没有特别说明均指重量百分比；所用试剂均为分析纯，水为超纯水。

实施例1沙门氏菌外膜蛋白的提取

一种适于获得大量高纯度沙门氏菌外膜蛋白的提取方法，包括以下步骤：

(1)表达载体的构建与导入：使用oligo7.0设计acrb基因的构建引物(引物f:5’-tttaagaaggagatatacatatgcctaatttctttatcgatcgc-3’，引物r：5’-tggtggtggtgctcgaggcgatgttctgtcgaatgacta-3’)，并由华大基因公司合成。使用水煮法获得鼠伤寒沙门菌sl1344(购于北京科展生物科技有限公司)的基因组模板，并以此为pcr模板，使用高保真酶platinum^tmpfxdna聚合酶(invitrogen)利用上述引物对acrb基因进行扩增，将通过酶切后将基因构建至带有组氨酸标签的pbad33表达载体(购于武汉淼灵生物科技有限公司)中，并将构建好的载体通过电转化导入宿主鼠伤寒沙门菌sl1344，利用25μg/ml的氯霉素药板筛选出构建成功的菌株。

(2)菌体的培养与收集：挑取氯霉素药板上的沙门氏菌单菌落于含有25μg/ml氯霉素的1llb液体培养基中37℃震荡培养过夜，于培养基中加入阿拉伯糖至终浓度为0.2％(w/v)；将菌液分装至50ml的离心管，每个离心管装入的菌液量为管总体积的1/3，在转速为10000rpm的离心机中离心8min，除去多余的培养基，用封口膜封住管口，保存于-80℃的冰箱中，备用。

(3)取冷冻菌体，按蛋白裂解液体积：菌体体积＝5：1往每个离心管中加入蛋白裂解液以重悬菌体，然后合并重悬后的菌，共加入60ml蛋白裂解液，充分混匀；其中，蛋白裂解液成分为：50mmtris-hcl(ph7.0)以及10％(v/v)甘油；将上述菌液放置于冰水上，加入120μl(1/500蛋白提取液体积)的饱和苯甲基磺酰氟异丙醇溶液(苯甲基磺酰氟溶于异丙醇)，恒温超声破碎，恒温超声破碎时要求：恒温4℃，破碎时间3h，10s/次，每次间隔10s，ampl值为50％。

(4)在相对离心率为4000g的离心机中4℃离心10min，收集上清液；将上清液在相对离心率为50000g的离心机中4℃离心60min，收集蛋白质沉淀。

(5)向所述蛋白质沉淀加入30ml外膜蛋白提取液，重悬沉淀并充分混匀，置于4℃震荡孵育3h；其中，外膜蛋白提取液的组成为：2％(w/v)十二烷基-β-d-麦芽糖苷(ddm)，50mmtris-hcl(ph7.0)以及10％(v/v)甘油。

(6)在相对离心率为50000g的离心机中4℃离心60min，收集上清液。

(7)向上清液中加入1/1000菌液体积的ni-nta柱填料(catalognumber：30210，qiangen，购买自广州佳研生物科技有限公司)和50mm咪唑(终浓度)，恒温孵育器中4℃震荡孵育2h。

(8)将上述ni-nta混悬液转移至空的柱子中，放干液体，留ni-nta柱填料。

(9)用20ml清洗液(20倍ni-nta柱体积)，冲洗ni-nta柱；其中，清洗液成分为：20mmtris-hcl(ph7.5)，0.3mnacl，10％(v/v)甘油，0.2％(w/v)十二烷基-β-d-麦芽糖苷和50mm咪唑。

(10)再次用2.5ml洗脱液洗脱纯化外膜蛋白；其中，洗脱液成分为：20mmtris-hcl(ph7.5)，0.3mnacl，10％(v/v)甘油，0.2％(w/v)十二烷基-β-d-麦芽糖苷和500mm咪唑，该外膜蛋白用1.5ml离心管保存于-80℃的冰箱中，备用。

实施例2：沙门氏菌外膜蛋白的检测和验证

将实施例1得到的外膜蛋白进行检测，具体方法如下：

(1)用sds-page电泳法检测蛋白质，将购买的12％预制胶安装至电泳槽，加入电泳缓冲液至凝胶板短板0.5cm以上，电泳缓冲液(tris-甘氨酸缓冲液ph8.3)的配制：称取tris6.0g，甘氨酸28.8g，sds1.0g，用水溶解后定容至1l。

(2)将实施例1中所得外膜蛋白与6×lodingbuffer以1：5的体积比混匀后加入凝胶凹形样品槽底部，加入蛋白maker，开始电泳，电泳电压为160v，电泳时间为40min。

(3)取出凝胶置于培养皿中，将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色过夜，直到蛋白条带清晰。其中，染色液成分为：0.25g考马斯亮蓝g-250，加入454ml50％(v/v)甲醇溶液和46ml冰乙酸；脱色液成分为：75ml冰乙酸，875ml水与50ml甲醇混匀。

(4)染色结果如图1所示，条带宽而清晰，无杂带，具有较好的重复性，可满足后续研究的需要。

效果实施例

(1)不同提取方法的蛋白提取效率和纯净度的比较

本发明实施例1的提取方法与碳酸钠法、sarkosyl法、triton-x114法、等密度梯度离心法(参考如下参考文献进行提取)相比，其蛋白提取效率和纯净度的差别如表1所示。

碳酸钠法：fujikiy,hubbardal,fowlers,etal.isolationofintracellularmembranesbymeansofsodiumcarbonatetreatment:applicationtoendoplasmicreticulum[j].jcellbiol,1982,93(1):97-102.

sarkosyl法：田丁，林天龙，许斌福.创伤弧菌、溶藻弧菌外膜蛋白特性的比较研究[j].水产科学，2011(1):27-30.

triton-x114法：bordierc.phaseseparationofintegralmembraneproteinsintritonx-114solution[j].jbiolchem,1981,256(4):1604-1607.

等密度梯度离心法：osbornmj,ganderje,parisie,etal.mechanismofassemblyoftheoutermembraneofsalmonellatyphimurium.isolationandcharacterizationofcytoplasmicandoutermembrane[j].jbiolchem,1972,247(12):3962-3972.

表1为本发明方法与其它几种方法在蛋白的提取效率和纯净度的比较。

表中数据是这五种方法在相同原料(0.1g菌体)下经不同提取方法所得的od595nm值和最终蛋白浓度。其中蛋白浓度、od595的单位分别为微克/微升、纳米，数值均为平均值。从表1可看出，本发明的方法提取的效率较高，蛋白的纯净度较高。

(2)本发明与不添加十二烷基-β-d-麦芽糖苷或不添加苯甲基磺酰氟的比较提取沙门氏菌外膜蛋白的同实施例1，区别在于：提取过程中步骤(5)、(9)、(10)中均不添加ddm(十二烷基-β-d-麦芽糖苷)或步骤(3)中不添加pmsf(苯甲基磺酰氟)。结果如表2所示。

表2

表中数据是在相同原料(0.1g菌体)下经不同提取方法所得的od595nm值和最终蛋白浓度；其中蛋白浓度、od595的单位分别为微克/微升、纳米，数值均为重复3次实验所得为平均值。从表2也可看出，本发明的方法提取的效率较高，蛋白的纯净度较高。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。