一种用于嗜热微生物遗传操作的诱导型毒素-抗毒素元件的制作方法

本发明涉及一种利用热稳定的毒素-抗毒素元件构建遗传筛选标记的方法和应用，具体涉及通过高静水压力诱导此类毒素-抗毒素元件在超嗜热微生物中进行遗传操作的方法和应用。

背景技术：

超嗜热微生物遗传操作研究已经有超过20年的时间，但是由于高温条件的限制，已开发可用的遗传工具数量非常有限。例如，热球菌thermococcuskodakaraensiskod1是第一个发展了基因敲除系统的菌株，其使用pryf基因作为筛选标记，尿嘧啶缺陷菌株作为出发菌株配合合成培养基使用。随后几种氨基酸缺陷标记陆续被开发：像色氨酸缺陷菌株,组氨酸缺陷菌株，但这些标记只能在合成培养基中使用。直到开发了辛伐他丁/hmg-coa还原酶过表达系统，其真正实现了在富营养培养基中操作。但是目前为止，超嗜热古菌中还没有科学家开发出一套可以直接在原养型菌株中进行无痕敲除的遗传系统。目前超嗜热菌遗传操作的出发菌株皆为氨基酸/核苷缺陷菌株，相比于原养型菌株，缺陷菌株对于代谢网络和适应性研究具有一定的干扰，增加了研究难度。而且在合成培养基中进行遗传操作由于菌株生长较慢需要花费更长的时间。因此亟需开发一种可在原养型菌株中进行遗传操作的遗传系统。

最近，毒素抗毒素(ta)系统已经在中温细菌中实现了遗传操作。特别是ii型的ta系统，由于毒素与抗毒素都是蛋白，并且直接相互作用，毒素蛋白通过转录或翻译抑制菌体生长，抗毒素可以中和这种毒性，而且ta系统广泛分布在细菌和古菌中，特别是能耐受更高温度的超嗜微生物中寻找可用的ta系统用于遗传操作是一种可行的方案。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一种可直接应用于原养型超嗜热微生物的遗传操作的选择性元件，具体是一种用于超嗜热微生物遗传操作的高静水压诱导的毒素-抗毒素元件；本发明还提供了制备上述选择性元件的方法和其应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明涉及一种热稳定的毒素-抗毒素选择性筛选标记hhp-tac，所述选择性筛选标记hhp-tac包含来自于超嗜热古菌的高静水压力诱导型启动子、热稳定性毒素基因和抗毒素基因、组成型启动子以及hmg-coa还原酶基因。

优选地，所述组成型启动子包括组成型启动子phmtb和组成型启动子pgdh。

进一步优选地，所述组成型启动子phmtb和pgdh区域来源于质粒pts535。

优选地，所述诱导型启动子是来自于超嗜热古菌pyrococcusyayanosii的高静水压力诱导型启动子phhp；热稳定性毒素和抗毒素的编码基因分别来自于超嗜热古菌p.furiosus的pf0776基因和pf0775基因。

优选地，所述选择性筛选标记hhp-tac的碱基序列如seqidno.1所示。

第二方面，本发明涉及一种选择性筛选标记hhp-tac的制备方法，包括如下步骤：

使用融合pcr扩增技术，依次将高静水压力诱导型启动子与热稳定性毒素基因融合，组成型启动子与抗毒素基因融合，以及组成型启动子与hmg-coa还原酶基因融合，获得所述选择性筛选标记hhp-tac。

优选地，所述高静水压力诱导型启动子为来自于超嗜热古菌pyrococcusyayanosii的高静水压力诱导型启动子phhp。该压力诱导型启动子phhp元件序列长度488bp，碱基序列如seqidno.13所示。

优选地，所述热稳定性毒素基因为来自于超嗜热古菌p.furiosus的pf0776基因；所述抗毒素基因为来自于超嗜热古菌p.furiosus的pf0775基因。所述毒素基因pf0776和抗毒素基因pf0775序列长度分别为327bp和324bp；所述热稳定性毒素基因的碱基序列如seqidno.14所示；抗毒素基因的碱基序列如seqidno.15所示。控制毒素基因的表达可以实现对菌株生长的抑制。

进一步优选地，使用融合pcr扩增技术，依次将高静水压力诱导型启动子phhp与热稳定性毒素基因pf0776融合，组成型启动子phmtb与抗毒素基因pf0775融合，以及组成型启动子pgdh与hmg-coa还原酶基因融合，获得所述选择性筛选标记hhp-tac。

优选地，所述hmg-coa还原酶基因来源于超嗜热古菌p.furiosus。过表达该基因可赋予该超嗜热古菌对辛伐他汀的抗性。其碱基序列如seqidno.16所示。

优选地，所述制备方法还包括对所得选择性元件进行验证的步骤。

优选地，所述验证具体包括将所述选择性元件插入无痕敲除质粒pus776ta1369中在e.colidh5α中进行质粒扩增并测序验证，然后将其转入超嗜热古菌p.yayanosiia1验证其成功进行敲除实验。

第三方面，本发明提供一种所述选择性筛选标记hhp-tac在嗜热微生物中的用途，该选择性筛选标记hhp-tac可在嗜热微生物的原养型中直接进行分子遗传操作。

优选地，所述选择性筛选标记hhp-tac中的高静水压力诱导型启动子用于控制蛋白的表达。

本发明构建的用于超嗜热微生物遗传操作的高压诱导型毒素-抗毒素元件，可以在原养型的超嗜热微生物中直接进行基因敲除的遗传操作工具并极大的扩大了负筛选标记的选择范围。同时该元件携带有高温可用的辛伐他汀抗性标记基因，使在高温下对其进行抗性筛选成为可能。丰富了超嗜热微生物遗传工具的种类，有助于对该类菌株进行功能基因组学研究。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)压力诱导型启动子使用物理(压力)诱导，易于操作，应用成本低。

(2)毒素-抗毒素元件广泛分布在超嗜热微生物中，该遗传标记不存在高温失活的问题。而且同一微生物中存在多种毒素抗毒素元件，可以发展为不同的选择性标记。

(3)基于压力诱导的毒素-抗毒素元件可以直接在原养型菌株中进行遗传操作，排除了营养缺陷型基因的干扰。

附图说明

通过阅读参照以下附图对选择性元件实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1是选择性元件hhp-tac构建说明图；

图2是pus776ta1369无痕敲除质粒示意图；

图3是无痕敲除菌株δ1369^-基因组水平pcr验证结果图；其中，图a为目的基因pych_1369基因上下游区域间pcr片段分析，m为1kbdnaladder；1,a1；2,δ1369^-；图b为目的基因pych_1369基因内部pcr片段分析，m为1kbdnaladder；1,a1；2,δ1369^-；图c为鲁戈氏碘液法残余淀粉量分析，1,trm含2‰(m/v)可溶性淀粉；2,菌株a1培养在含2‰(m/v)可溶性淀粉trm培养基中；3,无痕敲除菌株δ1369^-培养在含2‰(m/v)可溶性淀粉trm培养基中；4,trm。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明所涉菌株均为公知菌株，公开情况具体如下：

超嗜热古菌p.yayanosii已在文献：《pyrococcusyayanosiisp.nov.,anobligatepiezophilichyperthermophilicarchaeonisolatedfromadeep-seahydrothermalvent》,2011中公开；

超嗜热古菌p.furiosus已在文献：《pyrococcusfuriosussp.nov.representsanovelgenusofmarineheterotrophicarchaebacteriagrowingoptimallyat100℃》,1986中公开；

超嗜热古菌p.yayanosiia1已公开于文献：所述p.yayanosiia1菌株已经发表于《genetictoolsforthepiezophilichyperthermophilicarchaeonpyrococcusyayanosii》,2015；

实施例1、构建选择性元件hhp-tac

选择性元件hhp-tac构建说明书如图1；pcr扩增超嗜热古菌p.yayanosiia1中压力诱导型启动子phhp元件488bp，超嗜热古菌p.furiosus的毒素基因pf0776(327bp)和抗毒素基因pf0775(324bp)；以及质粒pts535的启动子区phmtb和pgdh(421bp)，以及p.furiosus的hmg-coa还原酶基因1227bp，并使用融合pcr将其依次融合得到选择性元件hhp-tac，碱基序列如seqidno.1所示。

实施例2、构建功能验证无痕敲除载体pus776ta1369

在已获得过选择性元件hhp-tac的基础上进行进一步修饰，过程如下：

(1)、对质粒puc18进行pcr线性化改造，所用引物碱基序列如seqidno.3-4所示；

(2)、pcr扩增p.yayanosiia1中基因pych_01369上游片段pych1369-ta-up(890bp)所用引物碱基序列如seqidno.5-6所示，下游片段pych1369-ta-dw(656bp)所用引物碱基序列如seqidno.7-8所示以及目的片段pych1369-ta(820bp)所用引物碱基序列如seqidno.11-12所示；

(3)、pcr扩增选择性元件hhp-tac所用引物碱基序列如seqidno.9-10所示，并使用重组酶按照上游片段pych1369-ta-up、下游片段pych1369-ta-dw、选择性元件hhp-tac和目的片段pych1369-ta的顺序将其连接到线性化质粒puc18上，得到功能验证无痕敲除质粒pus776ta1369，碱基序列如seqidno.2所示；pus776ta1369无痕敲除质粒示意图如图2所示；

(4)、将构建好的pus776ta1369无痕敲除质粒在e.colidh5α中进行质粒扩增并测序验证质粒已经构建正确。pus776ta1369无痕敲除质粒序列如表2所示。将构建好的pus776ta1369无痕敲除质粒，使用m13-47/48引物pcr扩增得到线性化敲除片段，转化至超嗜热古菌p.yayanosiia1中，通过辛伐他丁抗性正向筛选和高压反向筛选，进行功能的验证，所用引物见表1。

表1pus776ta1369无痕敲除质粒构建及鉴定的引物序列

表2pus776ta1369无痕敲除质粒序列说明

实施例3、实施效果

pus776ta1369无痕敲除质粒具有自杀载体的特性，可以在大肠杆菌e.colidh5α中复制，获得大量质粒。然后使用引物m13-47/48扩增得到线性化敲除片段，将获得的线性化敲除片段转化至超嗜热古菌p.yayanosiia1中，经过辛伐他汀抗性筛选阳性克隆子，提取总dna进行pcr验证。然后转接至trm培养基中高压诱导培养，筛选阳性克隆子无痕敲除菌株δ1369^-，进行pcr无痕敲除结果验证，验证结果如图3a.b所示。对鉴定为阳性的克隆子在含可溶性淀粉的培养基中进行培养，验证其对淀粉的降解能力，验证结果如图3c所示。

表明选择性元件hhp-tac可以作为一种超嗜热古菌p.yayanosiia1基因选择元件进行遗传操作应用。

综上所述，本发明的选择性元件hhp-tac能够在超嗜热古菌p.yayanosiia1菌株中高效的进行辛伐他丁抗性正向选择和高压诱导方向选择，该元件可作为超嗜热古菌的基因遗传操作应用于基因功能鉴定研究。本发明涉及的选择性元件hhp-tac具有诸多效果：高压诱导表达，既可以用来表达毒性蛋白也可以用来其他蛋白的控制性表达，可用于蛋白的过表达纯化等；毒素-抗毒素元件广泛分布在超嗜热微生物中，该遗传标记不存在高温失活的问题。而且同一微生物中存在多种毒素抗毒素元件，可以发展为不同的选择性标记；基于压力诱导的毒素-抗毒素元件可以直接在原养型菌株中进行遗传操作，排除了营养缺陷型基因的干扰。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。