专利名称：一种检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测乳与乳制品中微生物的方法，尤其适用于检测乳与乳制品中嗜冷菌的含量。
背景技术：
目前，乳与乳制品中嗜冷菌检测方法主要为国家行业标准SN/T 2552.4-2010《乳及乳制品卫生微生物学检验方法-第四部分:嗜冷微生物菌落计数》，其中的第一法:6.5°C菌落计数法的培养条件为6.5°C下培养10天，其检测结果准确但耗时较长。为解决耗时较长的问题，上述标准又提供了第二法21°C菌落计数法，采用的培养条件为21°C下培养25±1小时，虽然解决了耗时较长的问题，但在短时间内菌落生长较小，计数不便，影响检测结果的准确性。且由于在21°C的培养条件下，除了嗜冷菌外还有其他菌能够生长，其最终形成的菌落不全部为嗜冷菌菌落，所以第二法是一种近似的检测方法，如果仅仅为了使菌落生长的更大而延长第二法中的培养时间，会使更多的非嗜冷菌形成新的菌落，进一步影响检测结果的准确性。目前还缺乏一种能够在第一法基础上有效降低检测时间、且不影响检测准确性的检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法，能够在第一法基础上有效降低检测时间、检测准确性较高。本发明提供了一种检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法，其接种后培养的条件为:先于16°C至18°C下培养18小时至20小时，再于6°C至7°C下培养4天。在检测乳与乳制品 中嗜冷菌含量的方法的一种示意性实施方式中，该方法包括如下步骤:对待测乳或乳制品进行梯度稀释，制成多个梯度样本；将每个梯度样本分别接种制成多份菌落培养物；对菌落培养物进行培养，培养的条件为:先于16°C至18°C下培养18小时至20小时，再于6°C至7°C下培养4天；培养结束后，对培养后的菌落培养物进行菌落计数并计算出待测乳或乳制品中嗜冷菌含量，其中可以选用生理盐水或蛋白胨盐溶液作为稀释液进行梯度稀释。在检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法的一种示意性实施方式中，接种的方法为:取每个梯度样本分别加入无菌平皿中，然后向平皿倾注平板牛奶计数琼脂，转动平皿使梯度样本和平板牛奶计数琼脂混合均匀，水平放置平皿至混合均匀的物质凝固，且培养时菌落培养物叠放可以不超过6个。在检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法的一种示意性实施方式中，接种的方法为:取每个梯度样本分别置于菌落总数测试片内，并使梯度样本在菌落总数测试片上形成均匀的计数区域，静置菌落总数测试片直至菌落总数测试片内的物质固化，且培养时菌落培养物叠放可以不超过20个。在检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法的一种示意性实施方式中，接种时，制成每个菌落培养物所需的梯度样本的用量为I毫升，且每个稀释倍数的梯度样本分别同时接种两份平板牛奶计数琼脂或菌落总数测试片，制成两份菌落培养物。其中在培养结束后，对培养后的菌落培养物进行菌落计数，可以将菌落数为10-300CFU的培养后的菌落培养物作为目标培养物，并通过如下方法计算出待测乳或乳制品中嗜冷菌含量。若目标培养物对应的梯度样本涉及I个稀释倍数，则应按目标培养物的平均菌落数乘以相应的稀释倍数得到待测乳或乳制品中嗜冷菌含量。若目标培养物对应的梯度样本涉及2个稀释倍数，则采用如下公式计算出待测乳或乳制品中嗜冷菌含量:Ν= Σ C / [ Cn1 + 0.1Xn2) X d]，式中，N为待测乳或乳制品中嗜冷菌含量，单位为CFU/mL，Σ C为所有目标培养物中菌落数的总和，单位为CFU^1为目标培养物中较低稀释倍数的梯度样本对应的目标培养物的个数，n2为目标培养物中较高稀释倍数的梯度样本对应的目标培养物的个数，d为较低稀释倍数的稀释因数。若所有的培养后的菌落培养物的菌落数均少于10CFU，则应按稀释倍数最低的梯度样本对应的两个培养后的菌落培养物的平均菌落数乘以相应的稀释倍数得到待测乳或乳制品中嗜冷囷含量。若所有的培养后的菌落培养物的菌落数均多于300CFU，则应按稀释倍数最高的梯度样本对应的两个 培养后的菌落培养物的平均菌落数乘以相应的稀释倍数得到待测乳或乳制品中嗜冷囷含量。本发明中梯度稀释是指对样品进行N倍的梯度稀释，如N取10，即表示对样本进行十倍梯度稀释，可首先将样本稀释十倍，得到Tl，再将Tl稀释十倍，得到T2 ;将T2稀释十倍，得到T3 ;将T3稀释十倍，得到T4，依次类推。T1、T2、T3、T4的稀释倍数依次为10\102、103、IO4,稀释倍数对应的稀释因数为该稀释倍数的倒数，依次为10' 10_2、10' ο-40本发明的一种检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法，其培养用时不到5天；最后形成的菌落较大，计数时不易产生误差；检测用时较短，准确性较高。
具体实施例方式为了对发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现结合以下各实施例说明本发明的具体实施方式
。第一实施例。1、试剂及样品。选用生牛乳作为待测乳或乳制品。蛋白胨盐溶液:市购。平板牛奶计数琼脂:市购。为了检测的方便，若生牛乳中菌含量较高，可先对其进行一定比例稀释后再用本实施例所述方法进行检测。2、操作步骤。a.快速翻转盛有生牛乳的容器，使其混合均匀；用无菌吸管吸取IOmL生牛乳于含有90mL无菌蛋白胨盐溶液的三角瓶中，经充分振摇获得梯度样本Tl ;另用一支ImL无菌吸管吸取ImL梯度样本Tl，加入到含有9mL无菌蛋白胨盐溶液的试管中，振摇试管，混合均匀，获得梯度样本T2 ;另用一支ImL无菌吸管吸取ImL梯度样本T2，加入到含有9mL无菌蛋白胨盐溶液的试管中，振摇试管，混合均匀，获得梯度样本T3 ;另用一支ImL无菌吸管吸取ImL梯度样本T3，加入到含有9mL无菌蛋白胨盐溶液的试管中，振摇试管，混合均匀，获得梯度样本T4。b.取梯度样本T1-T4各两份，每份lmL，分别将其加入8个直径为90_100mm的无菌平皿中，然后向每个平皿倾注12-15mL温度不高于46°C的平板牛奶计数琼脂，转动平皿使梯度样本和平板牛奶计数琼脂混合均匀，水平放置平皿至混合均匀的物质凝固，制成8份菌落培养物。c.对8份菌落培养物进行倒置培养,培养的条件为:先于18°C下培养20小时,再于7°C下培养4天；培养时菌落培养物叠放不超过6个。d.培养结束后，对培养后的菌落培养物进行菌落计数，将菌落数为10-300CFU的培养后的菌落培养物作为目标培养物，并通过如下方法计算出生牛乳中嗜冷菌含量。若目标培养物对应的梯度样本涉及I个稀释倍数，则应按目标培养物的平均菌落数乘以相应的稀释倍数得到生牛乳中嗜冷菌含量。若目标培养物对应的梯度样本涉及2个稀释倍数，则采用如下公式计算出生牛乳中嗜冷菌含量:
式中，N为生牛乳中嗜冷菌含量，单位为CFU/mL，Σ C为所有目标培养物中菌落数的总和，单位为CFU，Ii1为目标培养物中较低稀释倍数的梯度样本对应的目标培养物的个数，n2为目标培养物中较高稀释倍数的梯度样本对应的目标培养物的个数，d为较低稀释倍数的稀释因数。若所有的培养后的菌落培养物的菌落数均少于10CFU，则应按稀释倍数最低的梯度样本对应的两个培养后的菌落培养物的平均菌落数乘以相应的稀释倍数得到生牛乳中嗜冷菌含量。若所有的培养后的菌落培养物的菌落数均多于300CFU，则应按稀释倍数最高的梯度样本对应的两个培养后的菌落培养物的平均菌落数乘以相应的稀释倍数得到生牛乳中嗜冷菌含量。3、检测结果。
权利要求
1.一种检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法，其特征在于，接种后培养条件为:先于16°C至18°C下培养18小时至20小时，再于6°C至7°C下培养4天。
2.一种检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法，包括如下步骤: 对待测乳或乳制品进行梯度稀释，制成多个梯度样本； 将每个所述梯度样本分别接种制成多份菌落培养物； 在如权利要求1所述的培养条件下对所述菌落培养物进行培养；所述培养结束后，对培养后的所述菌落培养物进行菌落计数并计算出所述待测乳或乳制品中嗜冷菌含量。
3.如权利要求2所述的检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法，其中，所述梯度稀释的稀释液选用生理盐水或蛋白胨盐溶液。
4.如权利要求2所述的检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法，其中，所述接种的方法为:取每个所述梯度样本分别加入无菌平皿中，然后向所述平皿倾注平板牛奶计数琼脂，转动所述平皿使所述梯度样本和所述平板牛奶计数琼脂混合均匀，水平放置所述平皿至混合均匀的物质凝固。
5.如权利要求2所述的检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法，其中，所述接种的方法为:取每个所述梯度样本分别置于菌落总数测试片内，并使所述梯度样本在所述菌落总数测试片上形成均匀的计数区域，静置所述菌落总数测试片直至所述菌落总数测试片内的物质固化。
6.如权利要求4所述的检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法，其中，进行所述培养时，所述菌落培养物叠放不超过6个。
7.如权利要求5所述的检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法，其中，进行所述培养时，所述菌落培养物叠放不超过20个。
8.如权利要求2所述的检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法，其中，所述接种时，制成每个所述菌落培养物所需的所述梯度样本的用量为I毫升，且每个稀释倍数的所述梯度样本分别同时接种于两份平板牛奶计数琼脂或菌落总数测试片，制成两份所述菌落培养物。
9.如权利要求8所述的检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法，其中，所述培养结束后，对培养后的所述菌落培养物进行所述菌落计数，将菌落数为10-300CFU的培养后的所述菌落培养物作为目标培养物，并通过如下方法计算出所述待测乳或乳制品中嗜冷菌含量: 若所述目标培养物对应的所述梯度样本涉及I个稀释倍数，则应按所述目标培养物的平均菌落数乘以相应的稀释倍数得到所述待测乳或乳制品中嗜冷菌含量； 若所述目标培养物对应的所述梯度样本涉及2个稀释倍数，则采用如下公式计算出所述待测乳或乳制品中嗜冷菌含量:N= Σ C / [ Cn1 + 0.1 Xn2) X d], 式中， N为所述待测乳或乳制品中嗜冷菌含量，单位为CFU/mL， Σ C为所有所述目标培养物中菌落数的总和，单位为CFU， H1为所述目标培养物中较低稀释倍数的所述梯度样本对应的所述目标培养物的个数， H2为所述目标培养物中较高稀释倍数的所述梯度样本对应的所述目标培养物的个数， d为所述较低稀释倍数的稀释因数； 若所有的培养后的所述菌落培养物的菌落数均少于10CFU，则应按稀释倍数最低的所述梯度样本对应的两个培养后的所述菌落培养物的平均菌落数乘以相应的稀释倍数得到所述待测乳或乳制品中嗜冷菌含量； 若所有的培养后的所述菌落培养物的菌落数均多于300CFU，则应按稀释倍数最高的所述梯度样本对应的两个培养后的所述菌落培养物的平均菌落数乘以相应的稀释倍数得到所述待测乳或乳制品中嗜 冷菌含量。
全文摘要
本发明提供了一种检测乳与乳制品中嗜冷菌含量的方法，其接种后培养的条件为先于16-18℃下培养18-20小时，再于6-7℃下培养4天。本发明检测方法的检测用时较少；其最后形成的菌落较大，计数时不易产生误差；本发明检测方法与6.5℃菌落计数法的检测结果有较好的相关性。
文档编号C12Q1/06GK103160563SQ20111041688
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月14日 优先权日2011年12月14日
发明者刘晓川, 喻东威, 杜丽, 薛志清, 刘志楠, 李梅, 刘卫星 申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司