高山芽孢杆菌Bacillus altitudinis YLX-5及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种嗜硒微生物及其应用，尤其涉及一株高山芽孢杆菌Bacillus altitudinisYLX-5及其在微生物转化合成有机硒、微生物合成纳米硒、微生物活化硒矿 石、富硒微生物肥料及硒污染环境修复中的应用，属于生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 极端微生物是指适合在极端环境中生活的微生物种属，包括嗜热菌、嗜盐菌、嗜 碱菌、嗜酸菌、嗜压菌、嗜冷菌以及抗辐射、耐干燥、抗高浓度金属离子和极端厌氧的微生 物（Rothschild&Mancinelli，2001 ;陈骏等，2006)，目前极端微生物的研究主要在大洋中 脊、热泉、盐湖、矿坑排水等区域。在深海洋中脊的热液环境中生活着大量嗜热、嗜压细 菌，其在洋中脊的Fe、S、Zn、Cu循环及成矿中扮演着重要的角色（Taylor&Wirsen, 1997 ; Labrenzetal.,2000 ；Kasama&Murakami,2001 ；Emerson&Mayer,2002；Kennedyet al.，2003;彭晓彤等，2007;陈顺等，2010)。地质微生物学家对美国黄石公园（Susanet al.，1994, 1996)、冰岛（Marteinssonetal.，2001;Thomasetal.，2007)、意大利（Kvist etal.，2005)、中国云南（宋兆齐等，2008;黄秋媛等，2010)等地的众多热泉进行研究， 揭示在这些高达70摄氏度以上，有些甚至超过100摄氏度的热泉里面，活跃着大量嗜热 微生物一一泉古菌，拓展了我们之前对微生物生存极限的想象。而美国犹他大盐湖（盐 度2. 2% )、死海（盐度2. 5% )、里海（盐度（1. 7% )等高盐环境中生活着许多抗高渗透 压微生物（Antonioetal.，1998;Vreelandetal.，1998 ;0renetal.，2001)。位于青 海省东北部的中国境内最大的内陆高原咸水湖泊，更由于其独特的沉积环境，成为地质微 生物学研究的天然实验室（妥进才等，2005)。酸性矿坑排水中大量存在嗜酸铁氧化菌， 如氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillusferrooxidans)，大量参与Fe、Mn、S等的循环 (Baker&Banfield, 2003 ;Fortin&Langley, 2005 ;陆建军等，2005 ;蒋嘉等，2006)，一方面造 成广泛的生态问题，另一方面为矿坑排水的治理提供了新的思路（Johnson&Kevin, 2003)。 即使对于遥远南极的厚厚冰层下封存几百万年之久的冰下湖生命系统，我们依然保存着浓 厚的兴趣（Bulatetal.，2009, 2011)。
[0003] 可是，很少有人关注富硒极端环境中的微生物组成。这主要是因为硒是地壳中的 微量元素，难以成矿或形成极端富硒的环境，极大限制了对嗜硒微生物的研究。
[0004] 湖北恩施渔塘坝具有世界上唯一的硒矿床，是典型和独特的极端富硒环境，在硒 矿区的渗滤水系统和硒矿尾矿的渗滤水系统中具有高浓度的硒含量，其中水体中的硒含量 高达40.0-94.1 1^/1，平均值为58.4±16.8 1^/1(21111&21161^，2001;211116七&1.，2008)，是 克山病区水体硒含量的330倍（Fordyceetal.，2000)，是世界卫生组织（WHO)推荐饮用水 硒含量上限的10倍（Presser，1994);沉积物中的硒含量高达8. 28-82. 9mg/kgDW，平均值 为26.6±26.8mg/kgDW(Zhu&Zheng，2001;Zhuetal.，2008)，是美国西部沉积物硒含量上 限值（1. 4mg/kgDW)的19倍（Presser，1994)。目前，仅有朱建明小组对湖北恩施渔塘坝高 硒碳质泥岩中的微生物多样性特征进行了初步研究（雷磊等，2009)，并分离了两株具有亚 硒酸盐还原能力的细菌（王明义等，2006)。在发明专利方面，仅有《一种利用微生物发酵生 产活化硒矿粉的方法》（ZL201210166664. 4)和《一种利用超耐硒微生物制备红色单质硒的 方法》（申请号201210167650. 6)中利用湖北恩施硒矿物的硒矿渣、土壤进行分离相关耐硒 微生物，进而接种到硒矿粉或其他含硒介质中，制备活化硒矿粉或红色单质硒。但发明专利 中并未分离纯化相关耐硒微生物，也未鉴定微生物种属和特征。
【发明内容】
[0005] 为解决上述技术问题，本发明提供了一株高山芽孢杆菌Bacillusaltitudinis YLX-5及其应用。
[0006] 本发明的技术方案是：
[0007] 本发明提供了一株高山芽孢杆菌BacillusaltitudinisYLX-5,该高山芽孢杆 菌是从中国湖北恩施硒矿区渗滤水系统的菌席沉积物中分离纯化的、具有嗜硒微生物特征 的细菌菌株，该高山芽孢杆菌的保藏名称为高山芽孢杆菌YLX-5(Bacillusaltitudinis YLX-5)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏地址为：中国武汉武汉大学， 保藏日期为2013年12月18日，保藏编号为CCTCCN0:M2013675。
[0008] 该高山芽孢杆菌的菌种菌学特征描述如下：
[0009]【形态特征】该高山芽孢杆菌在28摄氏度的TSA培养基中培养24小时观察到的 菌株群落为淡粉红色平滑的圆形，并具有全缘凸面（附图1);菌株为杆状，大小为0.5~ 0. 8X8~10ym(附图2);对该菌株进行革兰氏染色，显示为革兰氏阳性菌。
[0010]【嗜硒特征】将该高山芽孢杆菌依次分别接入到含硒（以亚硒酸钠配置）0、10、20、 50、100、200、500、1000、2000、5000mg/kg的TSB培养液中，结果显示：在硒浓度彡 20mg/kg 情况下，细菌生长不受抑制，培养液颜色不呈现明显的红色。在硒浓度彡200mg/kg情况下， 培养液颜色开始呈现明显的红色，在2000mg/kg条件下，培养液中的红色依然明显，表明该 菌种代谢正常。必须指出的是即使在硒含量高达2000mg/kg的极端条件下，菌种依然能生 长，体现出了极端耐硒能力，但是培养液红色已经明显减弱。超过2000mg/kg浓度下，该菌 种不能生长。
[0011] 【16SrRNA基因序列分析】从本发明所述菌株的纯培养物中提取基因组DNA，利用 通用引物27f和1492r进行PCR扩增和测序，进一步通过CLUSTALX软件和Mega4. 0软 件以Neighbour-joining方法构建系统进化树（附图3)，进行系统发育分析。结果显示 菌株属于高山芽抱杆菌（Bacillusaltitudinis)，命名为高山芽抱杆菌YLX_5(Bacillus altitudinisYLX-5)，保藏单位为中国典型培养物保藏中心（CCTCC)，保藏地址为：中国武 汉武汉大学，保藏日期为2013年12月18日，保藏编号为CCTCCN0:M2013675。
[0012]【生理生化反应特征】该菌株的运动性特征检测显示其运动性良好，pH生长适宜范 围为5-8,在11 %及以上浓度的NaCl条件下不能生长；可以以肌醇或D-山梨醇为唯一碳源 生长，但是不能以D-棉籽糖为唯一碳源生长（表1)。
[0013] 表1菌株运动性、生长耐受条件及碳源利用
[0014]
[0015]
[0016] 该k株的酶活检测结果▲示：菌株具有碱性磷k酶、酯酶（C4)、酯酶jj旨酶(Cs)、白 氨酸芳胺酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、0 -半乳糖苷酶、0 -糖 醛酸苷酶、a-葡萄糖苷酶、0 _葡萄糖苷酶、a-甘露糖苷酶反应呈阳性（表2)。
[0017] 表2菌株酶活性特性
[0018]
[0019]
[0020] 菌株抗生素抗性检测结果显示：菌株对阿米卡星、阿莫西林、氨苄西林、头孢哌酮、 氯霉素、环丙沙星、复方新诺明、诺氟沙星、新生霉素、盘尼西林均为敏感，唯独对林可霉素 具有抗性（表3)。
[0021 ] 表3菌株抗生素抗性
[0022]
[0023]
[0024] 注明：其中"R"表示抗性，"S"表示敏感。
[0025] 本发明还公开了高山芽孢杆菌BacillusaltitudinisYLX-5在制备微生物转化 有机硒的应用。本发明所述高山芽孢杆菌B