一种能降低食品中生物胺含量的植物乳杆菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种能降低食品中生物胺含量的植物乳杆菌及其应用，属于微生物技 术领域。
【背景技术】
[0002] 生物胺（Biogenicamines)是一类主要由氨基酸脱羧或者醛和酮氨基化形成的具 有生物活性的小分子量含氮化合物，是生物体内正常的生理活性物质，在机体细胞活动中 发挥着重要作用。但当人体外源摄入过量的生物胺时，会导致头痛，血压升高，造成人神经 系统和心血管系统损伤，有时主要是胃肠功能紊乱，造成腹部痉挛、腹泻和呕吐等。而且生 物胺能和亚硝酸盐反应生成致癌物亚硝类化合物。
[0003] 生物胺是食品中普遍存在的有害物质，尤其是发酵食品中，食品中的生物胺主要 是由微生物产生，同时也受游离氨基酸含量、温度、pH值、含盐量等影响。各类食品中生物 胺的含量不尽相同，对于肉制品和水产品而言，屠宰后的新鲜肉和新鲜的水产品生物胺含 量非常低，但在贮藏过程中会有所上升，而经过发酵之后得到的香肠或腌制品中生物胺普 遍存在，且部分含量很高；此外，发酵乳制品中奶酪中生物胺浓度很高，调味品（如鱼露、豆 豉、醋等）中有些胺的含量很高，橙汁等果汁类、番茄酱等蔬菜罐头类和咖啡豆等中也发现 了生物胺。因为不同生物胺的毒性差别较大，且不同人群对生物胺的解毒能力也相差较大， 建立统一的生物胺限量标准非常困难。美国FDA规定水产品中的组胺含量不得超过50mg/ kg，并建议酪胺含量不要超过l〇〇mg/kg，生物胺总量不要超过1000mg/kg。
[0004] 生物胺热稳定性好，一般的烹饪过程不能消除食物中的生物胺，现有的控制食品 中生物胺含量的方法主要有以下几种：1.生产工艺控制：通过对生产过程中的原料、温度 和盐度进行合理选择，抑制生物胺产生菌的生长，以达到抑制生物胺产生的目的，局限性在 于加工温度和盐度等因素多由食物特性决定，而低温贮藏会提高设备和能耗费用，且有些 微生物低温下也能产生生物胺；2.化学方法：食品添加剂和香料控制，虽然具有一定的生 物胺控制效果，但是食品添加剂成本较高，香料强烈的本体风味会限制其应用范围；3.物 理方法：超高压处理，一般针对发酵前原料或发酵后产品且可能影响质构，发酵过程中只能 采用相对低压，而低压作用不明显；4.生物技术：使用不产生生物胺的微生物作为菌粉生 物制剂，令其成为发酵体系中的优势菌，然后通过营养、空间竞争，改变环境pH值以及产生 抑菌物质等方式抑制生物胺产生菌的生长，以达到降低生物胺含量的目的。以上方法具有 各自不可避免的局限性，而且均不能降解已经产生的生物胺。寻找降解生物胺的菌作为菌 粉生物制剂可以解决如上问题。目前分离到的具有生物胺降解功能的微生物还存在很多 局限：（1)降解生物胺种类少；（2)降解效果差；（3)安全性存疑等。目前已报道的降解生物 胺的微生物有壁画盐单胞菌和酿酒酵母工程菌等，但其用于食品中的安全性有待进一步验 证，且并非对于常见的8种生物胺都有很好的降解作用；而采用添加单胺氧化酶的方法降 解生物胺不仅成本高，而且可能会对设备有更高的要求。
[0005] 鉴于以上背景，亟需研发新型的菌粉生物制剂降低生物胺含量。乳酸菌是一类能 使碳水化合物发酵并产生乳酸的细菌的统称，广泛存在于自然发酵食品中，且一般在发酵 食品中起主导作用。长期科学研究结果表明，以乳酸菌为代表的益生菌是人体必不可少的 具有重要生理功能的有益菌，其主要生理功能有：防治乳糖不耐症、恢复人体肠道内菌群平 衡维护人体健康、抗肿瘤和预防癌症作用、控制人体内毒素水平、保护肝脏并增强肝脏解毒 功能等。考虑到乳酸菌具有无二次污染，不损害食品营养，不产生新的毒性物质的优点，加 之乳酸菌作为益生菌能在动物体内定植发挥其多种有益于健康的功效，探索乳酸菌在降低 食品中生物胺的应用具有重大的实用价值。本发明的植物乳杆菌CGMCCNo. 9740,分离自四 川内江地区自然发酵泡菜，是可用于食品的安全菌株，用于加工制作发酵类食品的方法具 有工艺简洁、成本低廉、适用于大规模工业化生产等特点。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种植物乳杆菌，分类学命名为植物乳杆菌 (Lactobacillusplantarum)，于2014年09月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 9740。
[0007] 所述植物乳杆菌CGMCCNo. 9740能够有效降低生物胺含量，来源于四川省内江市 一农家的自制泡菜，其在酸性环境中具有良好的生长特性。植物乳杆菌在我国《可用于食品 的菌种名单》上，可在食品加工领域中使用，具有良好的市场前景。
[0008] 本发明的第二个目的是提供一种菌粉生物制剂，所述菌粉生物制剂是用植物乳杆 菌CGMCCN0. 9740制备得到的。
[0009] 本发明的第三个目的是提供一种所述菌粉生物制剂的制备方法，是将植物乳杆菌 CGMCCN0. 9740活化后洗涤、离心得到活性菌泥；将菌泥和冻干保护剂按质量比1:10-1:20 混匀，得到菌体浓度在10s-109CFU/mL的植物乳杆菌CGMCCN0. 9740悬浮液，预冷后冻干，即 得到植物乳杆菌CGMCCN0. 9740菌粉菌粉生物制剂。
[0010] 所述制备方法中菌株的活化是多次转接MRS肉汤培养基。
[0011] 所述制备方法中菌泥是由活化洗涤后的植物乳杆菌CGMCCN0.9740菌液在 6000-8000rpm条件下离心5-lOmin得到的。
[0012] 所述制备方法中冻干保护剂是水与保护剂原料混合制备得到的含有80_120g/L 脱脂奶粉、80-120g/L海藻糖、120-160g/L蔗糖的保护剂。在105°C湿热灭菌10_15min。
[0013] 所述制备方法中菌体的洗涤是使用无菌生理盐水进行洗涤。
[0014] 所述制备方法中的冻干是在真空冻干机中冻干。
[0015] 所述冻干是在冷阱温度-45-55°C、真空度2-6Pa条件下干燥45-50h。
[0016] 所述制备方法得到的菌粉生物制剂中活菌浓度在Kf-K^CFU/g。
[0017] 本发明的第四个目的是提供所述植物乳杆菌CGMCCNO. 9740的用途，可用于发酵 乳、泡菜、鱼露等发酵食品的制备。
[0018] 本发明所提供的植物乳杆菌具有耐酸性，在体外对8种生物胺（色胺、苯乙胺、腐 胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺）具有较强的清除能力，将菌体数为IXK^CFU/mL的植 物乳杆菌与8种生物胺（每种生物胺浓度为100mg/L，总胺浓度为800mg/L)共培养24h， 总胺含量降低近70%，每种生物胺含量降低30% -100%不等，其中对于毒性最大的组胺清 除率达到96. 69% ;同时具有快速产酸能力，8小时即可将pH降到4以下，具有良好发酵潜 力。本发明的植物乳杆菌用于降解食品尤其是发酵食品中的生物胺，具有非常广泛的应用 前景。
[0019] 生物材料保藏
[0020] 一种植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)，于2014年09月28日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路 1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo. 9740。
【附图说明】
[0021] 图1是8种生物胺的高效液相色谱图。
[0022] 图2是MRS固体培养基上植物乳杆菌CGMCCN0. 9740的菌落形态。
[0023] 图3是40 X 100倍显微镜下植物乳杆菌CGMCCN0.9740革兰氏染色后的形态。
[0024] 图4是植物乳杆菌CGMCCN0. 9740在MRS液体培养基中的生长曲线及pH值变化 图。
【具体实施方式】
[0025] 下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材 料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0026] 植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)是从四川内江地区自然发酵泡菜中筛选 得到的，菌株编号：CGMCCN0. 9740,植物乳杆菌CGMCCN0. 9740菌落为乳白色，表面光滑湿 润，边缘光滑，在MRS肉汤培养基上生长良好。
[0027] 实施例1乳酸菌筛选及保存
[0028] 将取自四川内江地区的优质泡菜的泡菜水用无菌生理盐水进行梯度稀释，选取适 当梯度在添加了 1. 5%的溴甲酚紫溶液（溴甲酚紫溶液浓度为0. 5% )的MRS肉汤培养基 上培养，37°C下培养48h，挑取变色圈大的菌落接种到MRS液体培养基中静置培养24小时， 培养温度37°C。取培养后的菌液lmL至保菌管中，12000rpm，4°C离心2min后取上清，向沉 淀中加入lmL60%甘油重悬，置于-80°C中保存。
[0029] 实施例2植物乳杆菌CGMCCN0. 9740对生物胺降解作用试验
[0030] 1.植物乳杆菌CGMCCN0. 9740菌种的活化
[0031] 取-20 °C保存的植物乳杆菌CGMCCN0. 9740,将其在MRS平板上划线培养。在37°C 培养48小时后，从生长良好的植物乳杆菌单菌落上挑取乳酸菌细胞接种到MRS液体培养基 中静置培养24小时，培养温度37°C。
[0032] 2?生物胺标准品母液的配制
[0033] 所述生物胺为生物胺标准品，购于Sigma公司，使用时配制成每种生物胺浓度均 为100mg/L的母液。配置方法为：分别准确称取0.OlOOrng的色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组 胺、酪胺、亚精胺和精胺，溶于l〇〇mL无菌生理盐水中，充分混匀溶解，并使用0. 22ym有机 微孔滤膜进行过滤除菌后贮存于4°C。
[0034] 3?植物乳杆菌CGMCCN0. 9740菌体的获取
[0035] 将活化后的菌种按3%接种量接种到MRS液体培养基中于37°C培养箱中静置培养 18小时后离心取菌体，得到的菌体重新悬浮于0. 85%生理盐水中清洗后再离心获得植物 乳杆菌菌体，一共清洗3次。得到植物乳杆菌CGMCCNO. 9740菌体。
[0036] 4?植物乳杆菌CGMCCNO. 9740对八种生物胺降解能力的分析
[0037] 取10mL的菌液按上述步骤获得菌体后与2mL生物胺母液进行混合，使得菌体浓度 达到lXU^CFU/mLA种生物胺的浓度均为100mg/L。将共培养混合物置于37°C培养箱中 静置培养24h后，于4°C、lOOOOrpm的转速离心10min取上清液，取lmL上清用丹磺酰氯衍 生，采用高效液相色谱-质谱联用检测样品中8种生物胺的残留情况。
[0038] 衍生条件：lmL样品中加入200yL的2mol/L氢氧化钠溶液，使之呈碱性，然后加 入300yL饱和碳酸氢钠溶液进行缓冲，再加入lmL丹磺酰氯溶液（10mg/mL丙酮），在黑暗 中置于40°C水浴45min;取出后加入100yL氨水避光放置30min中断反应并去除多余的丹 磺酰氯；最后用乙腈调整到5mL并用0. 45ym的有机滤膜过滤后待测定。
[0039] 检测条件：采用的检测仪器为高效液相色谱-质谱（HPLC-MS)联用方法，其 中HPLC的型号为Ultimate-3000，MS的型号为QZxactive。HPLC的柱温为30°C，流速 5. 000yL/s，流动相A为超纯水，流动相B为乙腈（色谱纯