），梯度洗脱程序如下：
[0040] 表1高效液相色谱洗脱程序 [0041 ]
[0042] MS检测的条件如下：
[0043] 表2质谱检测条件1
[0044]
[0045] 表3质谱检测条件2
[0046]
[0047] 检测结果：8种生物胺在高效液相色谱图上的出峰位置如图1所示，每种生物胺 具体出峰时间见表4,色胺，苯乙胺，腐胺，尸胺，组胺，酪胺，亚精胺，精胺的保留时间分别为 10. 22min，11.lOmin，11. 67min，12. 30min，14. 93min，15. 29min，17. 63min和 22. 95min〇
[0048] 根据峰面积变化可计算出乳酸菌对生物胺的降解情况，具体数据见表5,植物乳杆 菌CGMCCNO. 9740在对单胺和总胺的降解率上表现都很优异，对色胺，苯乙胺，腐胺，尸胺， 组胺，酪胺，亚精胺，精胺的降解率分别为86. 74 %，38. 94 %，63. 90 %，53. 12 %，96. 69 %， 32. 81%，85. 68%，92. 15%，对总胺的降解率达到 67. 33%。
[0049] 表4 8种生物胺高效液相色谱图上的保留时间
[0050]
[0051] 表5CGMCCN0.9740对于8种生物胺和总胺的降解率
[0052]
[0053] 实施例3植物乳杆菌CGMCCN0.9740的形态及鉴定结果
[0054] 取-80°C甘油管中保存的植物乳杆菌CGMCCN0. 9740,将其在MRS平板上划线培 养。在37°C培养48小时后，可观察到菌落形态为乳白色，表面光滑湿润，边缘光滑，见图2， 经革兰氏染色后在40X100倍显微镜下观察，可见植物乳杆菌CGMCCN0. 9740为杆状的革 兰氏阳性菌，见图3。
[0055] 进行菌落PCR，用无菌牙签挑取单菌落至混合好的体系中，在PCR仪中进行反应。 其中体系包括：l〇XTaqBuffer5yL，2.5mMdNTPs4yL，5u/yLTaqDNA聚合酶0.5yL， 20yM上、下游引物各0. 5yL(16S通用引物27F和1492R)，无菌水38. 5yL。反应程序为： 94°C，5min一（94°C，30s一 5(TC，30s一 72°C，lmin)X30 个循环一 72°C，5min一 4°C，20h。
[0056] 将PCR产物送至上海某生物公司测序，16SrDNA测序结果（SEQIDNO. 1)经BLAST 分析比对，CGMCCNO. 9740与植物乳杆菌有99%相似度。
[0057] 实施例4植物乳杆菌CGMCCN0.9740生长曲线的绘制
[0058] 取甘油管中保存的植物乳杆菌CGMCCN0.9740,将其在MRS平板上划线培养。在 37°C培养48小时后，从生长良好的植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)单菌落上挑取 乳酸菌细胞接种到MRS液体培养基中静置培养24小时，培养温度37°C。然后按3%接种量 将此活化后的植物乳杆菌CGMCCN0.9740培养液接种到MRS液体培养基中于温度为37°C， 静置培养24小时，每隔2个小时取5mL培养液使用紫外分光光度计测600nm下的0D值，根 据结果绘制植物乳杆菌CGMCCN0.9740的生长曲线，其结果如图4所示，从图中可以看出： 植物乳杆菌CGMCCN0.9740在MRS培养基中生长迅速，在2h左右进入对数期，12h左右进入 稳定期。随着培养时间的延长，菌株生长产酸，pH不断降低，8h即可将pH降到4以下，进入 稳定期后，pH下降趋势渐缓。24h培养结束时，培养液的pH值为3. 62,培养液中活菌浓度 可以达到 2.OX109CFU/mL。
[0059] 实施例5植物乳杆菌CGMCCNO. 9740生物制剂的制备
[0060] 植物乳杆菌CGMCCN0.9740的活化：
[0061] 从保存于-80°C的甘油管内吸取100-300yL植物乳杆菌CGMCCN0.9740菌液，接 种至800-1200mLMRS肉汤培养基中，于35-40°C恒温孵育24-48h;吸取200-500yL孵育 后菌液接种至800-1200mLMRS肉汤培养基中，重复这一步骤2-4次得到活化的植物乳杆菌 CGMCCN0.9740菌液。将活化后的菌液高速离心使菌体沉淀，弃去上清后用无菌生理盐水对 菌体沉淀进行洗涤并重悬，重复这一步骤2-3次并弃去上清，得到菌体浓度在Kf-K^CFU/ g的活性菌泥。
[0062] 菌粉生物制剂的制备：
[0063] 选择脱脂乳液作为冻干保护剂，将上一步得到的菌泥和脱脂乳液按质量比 1:10-1:20充分混勾，得到菌体浓度在10s-109CFU/mL的植物乳杆菌CGMCCN0. 9740脱脂乳 悬浮液。接着，让该悬浮液在温度37°C的条件下预培养60min，之后将悬浮液置于-80°C冰 箱中预冻2-3h，预冻完成后置于真空冻干机中冻干。即得到活菌浓度在Kf-K^CFU/g的冻 干植物乳杆菌CGMCCN0. 9740菌粉生物制剂。
[0064] 实施例6植物乳杆菌CGMCCN0.9740菌粉生物制剂用于发酵乳制备
[0065] 鲜牛奶或复原乳经净化和过滤处理后，95 °C杀菌20min，迅速冷却至40-50°C后， 按3-6 %添加植物乳杆菌CGMCCN0. 9740菌粉生物制剂，混匀，于42 °C培养箱中培养4-6h至 全部凝乳，之后置于4°C中后熟过夜，即得含植物乳杆菌CGMCCN0. 9740生物制剂发酵乳。
[0066] 实施例7植物乳杆菌CGMCCN0.9740菌粉生物制剂用于泡菜制备
[0067] 在洗净晾干的2mL泡菜坛中加入1kg冷开水，50g泡菜盐，100g花椒，一组添加10g 植物乳杆菌CGMCCNO. 9740菌粉生物制剂充分溶解混匀，另外一组（对照组）不添加10g 植物乳杆菌CGMCCNO. 9740菌粉生物制剂，分别制成发酵母水。将清洗洁净的黄瓜、莴苣、 胡萝卜分别切成厚度1. 〇〇cm的长条，与洗净的红椒、仔姜一同投入泡菜坛中至泡菜水液面 距离坛口l〇-15cm。盖上坛子盖，在坛沿加上淡盐水，常温下泡制24小时即可食用。与不添 加植物乳杆菌CGMCCN0. 9740菌粉生物制剂的组相比，添加植物乳杆菌CGMCCN0. 9740可 使发酵泡菜成品中总生物胺的水平降低了 30. 47%。
[0068] 实施例8植物乳杆菌CGMCCNO. 9740菌粉生物制剂用于泡椒凤爪制备
[0069] 参考实施例7制作泡菜母水，然后将鸡爪洗净，剪掉爪尖，剁小块，放热水中煮 10-15分钟，之后用冷水洗掉浮油，晾凉后分别放入接种了植物乳杆菌CGMCCN0. 9740和没 有接种植物乳杆菌CGMCCN0. 9740的泡菜水的坛子中，并加入野山椒至泡菜水液面距离坛 口 10-15cm。盖上坛子盖，在坛沿加上淡盐水，常温下泡制3-5天即可食用，以此来制作泡椒 凤爪。与不使用植物乳杆菌CGMCCN0. 9740相比，添加植物乳杆菌CGMCCN0. 9740可使成 品中总生物胺的水平降低了 70. 47%。由于使用植物乳杆菌CGMCCNO. 9740菌粉生物制剂 作为发酵剂，可降解发酵过程中已有及产生的生物胺，使产品更加安全。
[0070] 实施例9植物乳杆菌CGMCCN0.9740菌粉生物制剂用于发酵鱼露制备
[0071] 新鲜黄鲫鱼加入15 % (w/w)海盐，混合均匀，然后加入10 % (w/w)的植物乳杆菌 CGMCCN0. 9740菌粉生物制剂，或者不添加植物乳杆菌CGMCCN0. 9740菌粉生物制剂，混匀 后置于发酵容器，六层纱布封口，在35°C下静置发酵，在此期间要进行多次翻拌使鱼逐渐在 酶的作用下分解咸汁和渣。分解完毕后，进行露晒，每天翻拌1-2次。日晒1个月左右，逐 渐产生香气而趋于成熟。之后抽滤，将竹编长筒插入晒缸中，抽出清液，即得原油。滤渣一 般再浸泡过滤二次，鱼渣供作饲料或肥料。最后配制：取不同比例原油、中油、一油混合，即 为各级鱼露。与不添加植物乳杆菌CGMCCN0. 9740相比，添加植物乳杆菌CGMCCN0. 9740 能使鱼露成品的总生物胺水平减少了 80. 25%。植物乳杆菌CGMCCNO. 9740菌粉生物制剂 的使用可控制生物胺的风险。
[0072] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技 术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。
【主权项】
1. 一种植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum)，于2014年09月28日保藏于中国普 通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院 3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 9740。2. -种含有权利要求1所述植物乳杆菌CGMCC No. 9740的降解生物胺的生物制剂。3. -种制备权利要求2所述的用于降解生物胺的生物制剂的方法，其特征在于，将植 物乳杆菌CGMCC No. 9740活化培养后离心获得菌体，离心后的菌体经洗涤、离心得到植物乳 杆菌CGMCC No. 9740生物制剂。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，还包括将洗涤、离心得到的菌体用保护剂 重悬达到IO8~10 9CFU/mL，悬浮培养一段时间后冷冻干燥得植物乳杆菌CGMCC No. 9740菌 粉生物制剂。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述保护剂为脱脂乳、海藻糖或蔗糖。6. 根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述保护剂是以水为溶剂含有 80-120g/L脱脂奶粉、80-120g/L海藻糖、120-160g/L蔗糖的保护剂。7. 权利要求2所述的生物制剂的应用。8. 权利要求1所述植物乳杆菌CGMCC No. 9740在降解食品中的生物胺中的应用方法。9. 权利要求1所述植物乳杆菌CGMCC No. 9740在生产发酵食品中的应用方法。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述发酵食品包括发酵乳、泡菜、泡椒凤 爪、鱼露、豆鼓、醋。
【专利摘要】本发明公开了一种能降低食品中生物胺含量的植物乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明所提供的植物乳杆菌具有耐酸性，在体外对8种生物胺(色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、亚精胺、精胺)具有较强的清除能力，将菌体数为1×1010CFU/mL的植物乳杆菌与8种生物胺(每种生物胺浓度为100mg/L，总胺浓度为800mg/L)共培养24h，总胺含量降低近70％，每种生物胺含量降低30％-100％不等，其中对于毒性最大的组胺清除率达到96.69％，同时具有快速产酸能力，8小时即可将pH降到4以下，具有良好发酵潜力。所述的植物乳杆菌用于降解食品尤其是发酵食品中的生物胺，具有非常广泛的应用前景。CGMCC No. 974020140928
【IPC分类】A23L1/30, C12R1/25, C12N1/20, A23L1/015
【公开号】CN105132308
【申请号】CN201510443635
【发明人】陈卫, 田丰伟, 佟婷婷, 王刚, 赵建新, 张秋香, 刘小鸣, 翟齐啸, 张灏
【申请人】江南大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年7月24日