一株高产碱性蛋白酶的生孢缺陷型克劳氏芽孢杆菌的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株高产碱性蛋白酶的生孢缺陷型克劳 氏芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 碱性蛋白酶（alkalineprotease)具有巨大的市场潜力。我国的碱性蛋白酶研究 较国外晚，国内工业生产蛋白酶的菌株多是经枯草芽孢杆菌2709选育而来。碱性蛋白酶是 工业酶中占据比例最大的酶类，约占全世界每年工业酶总销量的60%左右（MalaB.R.等， 1998,MicrobiologyandMolecularBiologyReviews)，其能够广泛应用于洗涤、食品、医 疗、酿造、丝绸和制革等行业，尤其是作为市场上畅销的洗涤和皮革脱毛添加剂，有着良好 的市场价值。目前碱性蛋白酶这巨大的市场份额还是被国外两大巨头诺维信和杰能科占据 着。开发新菌种也是未来众多研究者的发展新方向。
[0003] 作为碱性蛋白酶天然分泌的优势菌株之一，克劳氏芽孢杆菌（Bacillusclausii) 的菌落小，呈乳白色，粘稠，边缘不整齐，不透明，具有很好的耐受性，能在极端环境下生长， 并且生存范围十分广泛。在环境恶劣或养分不足时，克劳氏芽孢杆菌可产生芽孢，休眠体， 称为隐藏的生命，在营养充足时又重新萌发为营养体。产生芽孢这一特性虽然在遗传上较 有优势，使得克劳氏芽孢杆菌在恶劣环境下不易死亡，但在工业生产中却是急需解决的难 题之一。因为在发酵过程中，如果发生停电等短时间发酵条件的突变，菌体会马上产生休眠 体芽孢，条件恢复后也不再萌发产酶，发酵不得不停止。所以如何使芽孢杆菌菌体丧失产芽 孢的能力，是进行菌株改造的一个重要环节，对于提高生产菌株的发酵能力具有重要的意 义。
【发明内容】
[0004] 本发明为解决现有技术问题，提供了一株高产碱性蛋白酶的生孢缺陷型克劳氏芽 孢杆菌。所述克劳氏芽孢杆菌是通过紫外诱变的方法筛选到的一种突变菌株，不仅不产芽 孢，还能高效分泌表达碱性蛋白酶，为碱性蛋白酶的低成本、规模化生产奠定了基础。
[0005] 本发明一方面涉及一种克劳氏芽孢杆菌突变株，为克劳氏芽孢杆菌 TDB1(BacillusclausiiTDB1)，已于2015年7月5日保藏于中国武汉武汉大学的中国典 型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2015429。
[0006] 本发明另一方面涉及上述克劳氏芽孢杆菌的应用。
[0007] 本发明通过紫外诱变的方法获得了一株克劳氏芽孢杆菌突变株。所述突变株在发 酵过程中不产芽孢，并且产酶效果没有损失，500mL摇瓶发酵酶活为181U/ml，较出发菌提 高了 30%。此外，所述克劳氏芽孢杆菌突变株分泌表达的碱性蛋白酶的酶学性质较出发菌 没有发生改变，可广泛应用于洗涤剂领域，市场前景广阔。
【附图说明】
[0008] 图1为出发菌株克劳氏芽孢杆菌TDB和突变菌株平板培养60h显微镜切片比较。
【具体实施方式】
[0009] 下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更 好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方 法步骤。
[0010] 对于本发明所涉及的术语及相关测定方法解释如下：
[0011] 1、蛋白酶酶活测定方法：采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法 (GB/T25327-2009) 〇
[0012] 2、酶活单位的定义：lg固体酶粉（或lmL液体酶），在一定温度和pH值条件下， lmin水解酪蛋白产生1yg酪氨酸，S卩为1个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。
[0013] 3、碱性蛋白酶运用福林法测定蛋白酶的活力，使用到的溶液包括：福林使用溶液 (一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀），碳酸钠溶液（42. 4g/L)，三氯乙酸（65. 4g/L)， 梯度pH值缓冲液，酪蛋白溶液（10.Og/L)。反应过程如下：试管中加入lmL酶液，40°C温浴 2min，加入酪蛋白溶液lmL，摇匀后40°C温浴lOmin，加入2mL三氯乙酸溶液，摇匀（空白对 照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液）。取出静止lOmin，慢速定性滤纸过滤。取lmL滤 液，加碳酸钠溶液5mL，加福林试剂使用溶液lmL，40°C显色20min，于680nm波长，用10mm比 色皿测定吸光度。
[0014] 实施例1克劳氏芽孢杆菌TDB的紫外诱变与筛选
[0015] 1. 1菌悬液制备
[0016] 将克劳氏芽孢杆菌TDB(该菌株由发明人齐建于2014年1月筛选自青岛市崂山区 林场土壤中）在含lyg/mL红霉素的牛肉膏蛋白胨斜面（牛肉膏0. 5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，琼脂1.5%，？117.2)上划线接种，37°(：培养4811;加入51^0.9%生理盐水，将斜面上 的菌全部冲洗下来，转入无菌的含有玻璃珠的试管中；涡旋振荡l〇min，完全打成单细胞菌 体；将菌悬液全部转入15mL离心管，6000rpm离心3min收集菌体；去上清，用10mL生理盐 水悬浮菌体；洗涤细胞两次，最后调整细胞浓度至〇D_= 0. 2。
[0017] 1. 2紫外诱变处理及诱变剂量确定
[0018] 打开9W紫外灯开关，预热约30min。取直径9cm无菌平皿，加入上述细胞浓度为 0D_= 0. 2的菌悬液10mL，放入一根无菌磁力搅拌器；打开磁力搅拌器，然后打开皿盖，在 垂直距离为15cm处，分别搅拌照射〇8、58、1〇8、158、2〇8、258、3〇8，盖上皿盖，关闭紫外灯， 黑暗中孵育30min。
[0019] 将照射后的菌悬液用0. 9%生理盐水10倍稀释法梯度稀释成10 1~10 5,对照0s 稀释到10 6;取10 3、10 4、10 5三个稀释度的菌悬液各100yL，涂布牛肉膏蛋白胨平板，每个 稀释度涂布三个平板，均匀涂满整个平板表面；以同样的操作，取未经紫外线照射的菌液稀 释10 4、10 5、10 6涂平板作对照。将上述涂布均匀的平板，用黑布或报纸包好后，置37°C过 夜培养。
[0020] 统计不同照射时间时每个稀释度下平板上长出的单菌落数，若在某个稀释度下平 板上长出的单菌落数在30~300个之间，则认为该稀释度合适。将该稀释度下三个平板上 长出的单菌落数求平均值，按下列公式计算菌悬液浓度：
[0021] 菌悬液浓度（CFU/mL)=某个稀释度下的菌落平均数X稀释倍数X10
[0022] 按下列公式计算某个紫外处理剂量下的致死率：
[0023]
[0024] 经计算，不同紫外诱变剂量下克劳氏芽孢杆菌TDB的致死率如表1所示。
[0025] 表1 :紫外线诱变致死率
[0026]
[0027] 从表1的数据可以看出，菌悬液经紫外照射5s后致死率就达到95%以上，但因时 间太短不便于控制，因此最终确定诱变时间为l〇s。
[0028] 1.3透明圈初筛
[0029] 紫外照射处理10s后，菌悬液中活细胞浓度约106个/mL;在每个牛肉膏蛋白胨平 板（含红霉素1yg/mL)上均匀涂布100yL上述菌悬液；用黑布或报纸包好，37°C培养3天， 获得菌落明显透明而不是乳白色的形态突变子200多个。重新点种牛肉膏蛋白胨平板（含 红霉素1yg/mL)，37°C培养72h，每个菌落分别制作切片观察有无产孢，生长状态是否比出 发菌好。最终申请人筛选出经5次传代后，72h内仍不产芽孢，并且生长状态较出发菌株好 的突变菌株共5株，分别命名为TDB1，TDB2,TDB3,TDB4,TDB5。
[0030] 1. 4摇瓶复筛
[0031] 挑取上述五株突变菌的单菌落分别接种于100mLLB液体培养基中（pH9. 0)，37°C 培养72h，同时以出发菌克劳氏芽孢杆菌TDB作为对照。酶活测定结果显示，上述突变菌株 中TDB1的发酵上清液酶活最高，达181U/mL，比出发菌提高了约30%。通过进一步对突变 菌株TDB1进行显微镜观察发现，在摇瓶发酵过程中，突变菌株TDB1均不产芽孢（图1)，保 持了遗传上的稳定性。
[0032] 实施例2克劳氏芽孢杆菌TDB1所产蛋白酶的酶学性质分析
[0033] 2. 1最适pH分析
[0034] 分别用pH值为7. 0、8. 0、9. 0、10. 0、11. 0、12. 0、13. 0的缓冲液稀释突变菌克劳氏 芽孢杆菌TDB1和出发菌克劳氏芽孢杆菌TDB的发酵上清液，在40°C条件下分别测定其发酵 上清液的酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果表明，本发 明获得的突变菌克劳氏芽孢杆菌TDB1产碱性蛋白酶的最适作用pH值为11. 5,与出发菌株 TDB产碱性蛋白酶的最适作用pH值一致。
[0035] 2. 2最适温度分析
[0036] 分别在 30°C、40°C、50°C、60°C、70°C、80°C、90°C，pH10. 5 的条件下测定突变菌克 劳氏芽孢杆菌TDB1和出发菌克劳氏芽孢杆菌TDB发酵上清液的酶活，以最高酶活为100%， 计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果表明，本发明获得的突变菌克劳氏芽孢杆菌TDB1产碱性蛋白酶的最适作用温度为60°C，与出发菌株TDB产碱性蛋白酶的最适作用温度 一致。
[0037] 综上，本发明通过紫外诱变方法获得的突变菌株克劳氏芽孢杆菌TDB1不但具有 不产芽孢的表型，还能显著提高碱性蛋白酶的表达量，摇瓶发酵酶活高达181U/ml，而出发 菌TDB提高了 30%，而且，与出发菌相比，其所产碱性蛋白酶的酶学性质也没有发生改变， 取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于碱性蛋白酶的生产，有利于提高 碱性蛋白酶的产量，降低生产成本。
[0038] 申请人已于2015年7月5日将克劳氏芽孢杆菌TDBl(BacillusclausiiTDB1) 保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2015429。
【主权项】
1. 一种克劳氏芽孢杆菌，其特征在于，所述的克劳氏芽孢杆菌的保藏号为CCTCC NO : M2015429。2. 包含权利要求1所述的克劳氏芽孢杆菌的微生物制剂。3. 权利要求1所述的克劳氏芽孢杆菌在碱性蛋白酶生产中的应用。
【专利摘要】本发明涉及功能微生物筛选技术领域，具体提供了一种高产碱性蛋白酶的生孢缺陷型克劳氏芽孢杆菌。所述克劳氏芽孢杆菌是通过紫外诱变方法获得的突变株，保藏编号为CCTCC？NO：M2015429。所述突变株在发酵过程中不产芽孢，并且产酶效果没有损失，500mL摇瓶发酵酶活为181？U/ml，较出发菌提高了30%。此外，所述克劳氏芽孢杆菌突变株分泌表达的碱性蛋白酶的酶学性质较出发菌没有发生改变，可广泛应用于洗涤剂领域，市场前景广阔。CCTCC NO: M201542920150705
【IPC分类】C12N1/20, C12N9/54, C12R1/07
【公开号】CN105132304
【申请号】CN201510388354
【发明人】郭小飞, 石增秀, 齐建, 管轶男, 徐玉婷, 付娟, 张晓舟
【申请人】青岛蔚蓝生物集团有限公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年7月6日