一种增加穗粒数的水稻基因OsHGN及其应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种增加穗粒数的水稻基因oshgn及其应用。

背景技术：

水稻是养活世界范围内众多人口的主要口粮作物，其产量是遗传育种和生产上被广泛关注的重要农艺性状。单株穗数、单穗粒数和粒重这三个性状决定了水稻的产量，其中穗粒数是关键因素。增加穗粒数是提高单产的最重要的问题，促使低单穗粒数的水稻向高单穗粒数的转变是水稻高产遗传育种的首要需求。

目前已经发现一些基因参与水稻单穗粒数的调控。osckx2/gn1a编码一种可以降解细胞分裂素的酶，该基因被降低表达后可以提高水稻体内细胞分裂素水平从而积累花序分生组织提高繁殖器官，因而提高单穗粒数最终达到增加产量的效果(ashikari等，2005,science.309:741-745)。编码新型锌指转录因子的水稻基因dst超量表达后会造成株高降低、穗枝梗数减少以及籽粒数目减少，而抑制该基因表达能增加穗粒数提高产量，且研究显示dst可以直接调控osckx2/gn1a的表达来影响水稻产量(huang等，2009，gene&development.23:1805-1817；li等，2013，pnas.110:3167-3172)。dep1编码与磷脂酰乙醇胺结合蛋白有类似功能的氨基酸，dep1基因的突变能够促进细胞分裂，降低穗颈节长度使穗粒变密增加单穗的粒数，能使水稻增产15％-20％。且该基因的自然遗传突变在我国东北和长江中下游种植直立或半直立穗型的高产水稻品种中均存在，表明dep1基因在我国水稻增产中发挥关键作用(huang等，2009，naturegenetics.41:494-497)。

lax1和lax2均编码水稻转录因子，lax1编码bhlh转录因子而lax2未知功能的核蛋白，这两个水稻基因参与调控水稻种子粒数，lax1突变造成种子减少，lax2突变造成稀穗表型，而且二者同时突变后稀穗表型加强(komatsu等，2001.developmentalbiology,231:364-373；tabuchi等，2011.theplantcell,23:3276-3287)。fzp具有erf转录激活因子的功能，有阻止腋芽分生组织形成并建立花分生组织的作用，该基因突变促进穗分枝(komatsu等，2003.development,130:3841-3850)。gnp1/osga20ox1编码ga20氧化酶，是催化赤霉素生物合成倒数第二步的关键反应酶。osga20ox1通过增加水稻穗分生组织的细胞分裂素活性来提高籽粒数目从而达到增产的目的(wu等，2016.plosgenetics,12:e1006386)。

研究显示水稻生育期对于穗长和穗粒数的增加有直接关系，目前已经发现的一些与抽穗开花时期相关的水稻基因参与穗粒数的调控。dth7/ghd7.1是一个控制水稻光周期敏感性和穗粒数产量的主效遗传位点，编码pseudo响应调节蛋白，长日照下dth7/ghd7.1可以作用于光敏色素b下游，延迟开花(gao等，2014.pnas,111:16337-16342；yan等，2013.cellresearch,23:969-971)。dth8/ef8编码一个297个氨基酸组成的多肽，其突变体在短日照下无显著差异，但在长日照下突变体每穗粒数减少，叶片中叶绿素增加(feng等，2014.plantcellreports,33:2003-2014；yan等，2011.molecularplant,4:319-330)。

高产是水稻育种的重要目标，一定程度而言单株有效穗数达到一定水平之后，如何提高单穗的粒数或单穗重量才是高产育种的目标。通过物理诱变、化学诱变以及其他基因工程的方法目前已经获得了一些提高单穗粒数的突变体水稻，但是这些突变体伴随许多未知性，其作用多项性对于大规模应用具有难度。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明提供了一个从水稻中分离鉴定的增加单穗粒数的突变体以及对应的相关基因完整编码区段的dna片段，命名为oshgn，并通过功能验证确认了该基因的表达可以调控水稻单穗粒数从而提高水稻产量。利用本发明，可将oshgn基因应用于水稻的高产育种和种质材料的培育。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种增加穗粒数的水稻基因oshgn，所述水稻基因oshgn的序列如seqidno.1所示。

该基因的编码区全长为1023bp，由4个外显子和3个内显子组成。

本发明的第二方面，提供一种由上述水稻基因oshgn编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示。

携带上述水稻基因oshgn的重组表达载体、转基因细胞系或基因工程菌也是本发明的保护范围。

本发明的第三方面，提供如下a)-d)中任一项所述的dna片段作为调控穗粒数的基因在调控植物产量和/或穗粒数中的应用；

a)seqidno.1所示的dna片段；

b)编码seqidno.2所示氨基酸序列的dna片段；

c)dna片段，与a)或b)限定的dna片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与seqidno.2所示的蛋白等价；

d)dna片段，其在严格条件下与a)或b)的dna片段杂交，且编码seqidno.2所示的蛋白。

上述应用中，通过下调a)-d)中任一项所述的dna片段的表达，增加穗粒数。

优选的，所述植物为水稻。

本发明的第四方面，提供如下1)-3)中任一项所述的蛋白在调控植物产量和/或穗粒数中的应用；

1)氨基酸序列是seqidno.2所示的蛋白；

2)将seqidno.2所示的氨基酸序列经过一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入得到的与seqidno.2所示的蛋白具有相同功能的蛋白；

3)在seqidno.2所示的蛋白的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白。

上述应用中，通过下调1)-3)中任一项所述的蛋白的表达量和/或活性，增加穗粒数。

优选的，所述植物为水稻。

本发明的第五方面，提供能够下调a)-d)中任一项所述的dna片段在植物中表达的基因表达调控剂在提高植物产量和/或增加穗粒数中的应用；

优选的，所述基因表达调控剂选自t-dna或干扰rna。

本发明的第六方面，提供能够下调1)-3)中任一项所述的蛋白的表达量和/或活性的调节剂在提高植物产量和/或增加穗粒数中的应用。

本发明的第七方面，提供一种培育穗粒数增加的水稻的方法，所述方法包括：下调seqidno.1所示的水稻基因oshgn的表达，筛选得到穗粒数增加的水稻植株；

或下调seqidno.2所示的蛋白的表达量和/或活性，筛选得到穗粒数增加的水稻植株。

上述方法中，下调水稻基因oshgn的表达的方法包括：突变或敲除水稻中seqidno.1所示基因的全部或者部分序列；或者使用干扰rna干扰seqidno.1所示基因的表达；或者使用基因沉默系统使seqidno.1所示基因沉默。

作为优选，所述突变的方式为crispr/cas9或tellen技术或t-dna插入或ems诱变；更优选的，所述突变的方式为t-dna插入。

本发明的有益效果：

本发明首次提供了一个从水稻插入突变体库中分离得到一个单穗粒数增加的水稻突变体oshgn，通过鉴定发现该突变体插入基因位置并命名为oshgn，由于插入失活导致该基因表达大幅降低从而产生单穗粒数显著增加的表型，且该突变体单株有效穗数不受影响，从而达到提高单株产量的作用。基于本发明新发现的oshgn基因，通过分子标记辅助育种、遗传转化和基因编辑等技术，可用于改良现有水稻等禾本科植物的穗粒数，培育和创制穗粒数高的中间材料和生产品种，进而提高产量。

附图说明

图1：oshgn突变体水稻t-dna插入位置示意图；图中所示为oshgn基因结构以及t-dna插入位点示意图，黑色框标示为编码区，白色透明框为非编码区，直线表示为内含子，三角形示意t-dna插入位置。

图2：pcr检测oshgn突变体水稻株系分离鉴定示意图；图示为oshgn突变体水稻插入突变体纯合株系的筛选；从左往右第一个泳道显示为2000bpmarker,第二个泳道为阴性对照，第三个泳道为纯合突变体，第四个泳道为阴性植株，第五、六个泳道为杂合突变体，第七个泳道为野生型水稻dj对照。上部dna条带为oshgn基因组特异性引物扩增，下部dna条带为基因组和插入t-dna特异性引物组合扩增。

图3：荧光定量pcr检测oshgn突变体水稻中oshgn基因表达量示意图。

图4：oshgn突变体水稻单穗示意图；图示显示了野生型dj水稻和突变体oshgn水稻的单穗状态，左边三个单穗为dj，右边三个单穗为突变体oshgn。

图5：oshgn突变体水稻分蘖数统计结果示意图；图中所示为单株水稻分蘖数统计图，纵坐标显示分蘖数目，左侧为dj水稻，右侧为oshgn突变体。

图6：oshgn突变体水稻单穗粒数统计示意图；图示为每个单穗上种子粒数统计图，左侧为dj水稻，右侧为oshgn突变体。

图7：oshgn突变体水稻单穗穗重统计示意图；图示为每个单穗的重量统计图，左侧为dj水稻，右侧为oshgn突变体。

图8：oshgn突变体水稻种子千粒重统计示意图；图示为千粒水稻种子的重量统计图，左侧为dj水稻，右侧为oshgn突变体。

图9：oshgn突变体水稻单株产量统计图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，高产是水稻育种的重要目标，通过物理诱变、化学诱变以及其他基因工程的方法目前已经获得了一些提高单穗粒数的突变体水稻，但是这些突变体伴随许多未知性，其作用多项性对于大规模应用具有难度。突变体作为水稻功能基因组学研究的重要材料，对于水稻基因功能的研究起着重大的作用。但由于水稻基因组巨大并且复杂，用于标记水稻基因组中基因的突变体数量极大。从庞大的水稻突变体数据库中筛选并分离得到穗粒数显著增加的突变体本身就极具难度，进一步确定t-dna插入突变体的插入位置以及插入的具体基因，技术难度更是成几何倍的增加。

本发明人通过大量的工作，从t-dna水稻插入突变体库中发现并分离得到一个穗粒数显著增加的突变体oshgn。进一步的，本发明人通过特异性引物利用pcr扩增验证该插入突变体的插入位置以及插入的具体基因，命名为oshgn，其基因的序列如序列表seqidno.1所示；其编码的氨基酸序列如序列表seqidno.2所示。

本发明通过鉴定并分离得到纯合的插入突变体水稻，并进一步利用荧光定量pcr验证了突变体中oshgn的表达量发现其显著降低。然后在田间种植该突变体纯合株系的水稻，统计每株水稻的分蘖数发现与野生型dj水稻无显著差异，但株高变高且抽穗期延缓。待水稻生长结束收获种子后观察突变体和野生型对照的稻穗差异，发现突变体的单穗明显大于野生型对照，每个单穗上的种子更加密集。统计每个单穗上的种子数量，可以发现突变体水稻单穗粒数相比野生型对照增加70％左右，有效粒数增加60％左右。突变体水稻单穗重量也显著的增加，增幅超过50％。综合比较每株水稻的产量发现，突变体水稻单株可以增产40％左右。

本发明包括与oshgn基因同源的dna片段，只要它们编码的蛋白与seqidno.2所示的蛋白功能等价。本文所指的“与seqidno.2所示的蛋白功能等价”意味着目标dna片段所编码的蛋白在生物学功能和生理生化特征等方面与本发明中seqidno.2所示的蛋白相同或相近。seqidno.2所示的蛋白典型的生物学功能是调控水稻单穗粒数。通过下调seqidno.2所示的蛋白的表达量和/或活性，可以增加水稻单穗粒数。

这些与oshgn基因同源的dna片段包括本发明核苷酸序列(seqidno.1)对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因；它们编码的蛋白类似于本发明seqidno.2所示的蛋白，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入现象，都属于本发明内容。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的oshgn基因的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明oshgn基因的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码的蛋白与seqidno.2所示的蛋白具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明seqidno.1所示的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。氨基酸或核苷酸序列的等同率可采用blast算法测定(altschuletal.1990.journalofmolecularbiology215:403-410；karlinandaltschul.1993.proceedingsofthenationalacademyofsciences90:5873-5877)。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

从应用角度出发，通过对本发明的水稻oshgn基因(seqidno.1)进行表达调控，很可能创制出穗粒数增加的表型。这里所指的“调控表达”包括dna转录水平、cdna翻译水平和蛋白产物活性三个层面，包括上调和下调两种程度。比如说，根据本发明水稻oshgn基因(seqidno.1)或其同源基因挖掘到的能够激活或提高该基因的转录水平或翻译水平或蛋白活性等的dna片段。再比如，对于水稻oshgn基因(seqidno.1)或其同源基因，或存在与之作用的微小rna分子(microrna，mirna)、干扰小rna(smallinterferingrna，sirna)或与之作用的人工mirna(artificialmicrorna，amirna)；通过合理控制特异小rna分子(amirna、mirna和sirna)的表达，从而下调oshgn基因或其同源基因mrna的积累，获得穗粒数增加的表型。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例和对比例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：oshgn突变体水稻鉴定

1.oshgn突变体水稻获得：

oshgn突变体水稻来源于韩国水稻突变体库，是通过t-dna插入导致基因突变，利用数据库相关信息分析该基因结构和插入位置得到图1所示，该基因编码区全长1023bp,四个外显子和三个内显子组成，oshgn突变体则是t-dna插入在第二个外显子末端，破坏了该基因的编码区。

2.pcr鉴定纯合插入突变体

经水稻基因组数据库获得oshgn相关序列信息，综合突变体库相关信息，设计引物利用pcr检测oshgn突变体插入位置准确性以及纯合突变体的鉴定，从基因组上设计引物lp1(5′-tccctagctagctctcacacg-3′，其序列如序列表seqidno.3所示)和lp2(5′-ctcggtttagcttcgttgatc-3′，其序列如序列表seqidno.4所示)，以及t-dna载体上引物lb2(5′-cgtccgcaatgtgttattaagt-3′，其序列如序列表seqidno.5所示)，利用lp1和lp2可以检测扩增基因组序列，lb2和lp2可以检测t-dna插入基因组序列。种植获得的突变体oshgn水稻，分单株取样叶片并提取基因组，搭配lp1lp2和lb2lp2分别进行pcr扩增，结果如图2所示，作为对照的野生型dj水稻可以通过lp1lp2扩增出相应条带而lb2lp2无法扩增出条带；oshgn-1单株仅lb2lp2扩出，说明该株t-dna插入且为纯合插入突变；oshgn-2单株仅lp1lp2扩出，说明无t-dna插入为完全阴性植株；oshgn-3和oshgn-4单株lp1lp2和lb2lp2均可以扩增出相应条带，说明该株有t-dna插入，但为杂合突变体。通过鉴定获得的纯合突变体oshgn可进一步繁殖获取大量后代以备用。

3.荧光定量pcr检测oshgn突变体基因表达

野生型dj和突变体oshgn水稻种植生长6周左右取叶片，液氮冷冻匀样后利用trizol提取叶片的rna，取适量的rna利用反转录试剂盒获得cdna作为荧光定量pcr检测的模板。取适量模板cdna，以水稻actin作为内参基因，检测oshgnc的表达。所用actin定量检测正向引物为5′-caggccgtcctctctctgta-3′，如序列表seqidno.6所示，反向引物为5′-aaggatagcatgggggagag-3′，如序列表seqidno.7所示，oshgnc定量检测引物为正向5′-tcggtggcatctttcatgtg-3′，如序列表seqidno.8所示，反向为5′-cctgctccagaacttcttgtagtac-3′，如序列表seqidno.9所示。相对表达量采用△cct法进行定量计算，所得结果如图3所示，以dj水稻oshgn相对actin的表达量为1，而突变体oshgn中oshgn的表达量下降超过90％，说明oshgn在突变体中表达量显著降低了。

实施例2：oshgn田间生长表型鉴定

取dj和oshgn水稻种子若干，保湿控温37度约2天使种子萌发，后转移至28度保温控湿3天，待长出根和芽后即可置光照培养室进行土壤移栽育苗。苗期生长5周左右处于分蘖期后移栽至大田中生长，期间需保水施肥保证足够营养。生长80天左右进入孕穗期，此时统计单株有效分蘖数，总共统计dj和oshgn水稻各30株单株分蘖数，如图5所示，野生型dj水稻的单株有效分蘖数为10左右，突变体oshgn平均有9.5个有效分蘖，二者无显著差异，说明oshgn突变对水稻分蘖不产生显著影响。

实施例3：oshgn穗果和种子表型鉴定

dj和oshgn水稻生长130天左右收获种子，取单穗进行分析。数取dj和oshgn水稻各50个单穗上的有效种子粒数和空壳数，并分析得到每穗粒数的平均值，结果如图6所示，dj水稻单穗上平均大约有110粒种子，而oshgn单穗上平均接近200粒种子，具有非常显著的差异，说明oshgn可以显著增加单穗的粒数。将水稻穗37度烘箱烘干处理3天使种子水分蒸发，并称取50个单穗的每个单穗重量，得到如图7所示，dj水稻每穗干重为3克左右，而oshgn突变体水稻则达到了4.7g，显著提高了单穗产量。数取10组饱满种子，每组1000粒并称取重量可得千粒重，算取千粒重均值得到图8所示，dj的种子千粒重接近30克，而oshgn为28克，说明oshgn单穗的粒数增加但单粒种子重量减少。统计每株水稻的有效种子的总重量如图9所示，dj水稻单株产量为32克左右，而oshgn则达到了45克，显著提高了单株产量。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

sequencelisting

<110>山东农业大学

<120>一种增加穗粒数的水稻基因oshgn及其应用

<130>2018

<160>9

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1023

<212>dna

<213>水稻

<400>1

atggcaacgacgcagttgctgtccaccgtcgagcaccgggagacgctcccggagggctat60

gctcggcctgagtccgaccggccgcggctcgccgaagttgccacggacagcaacatcccg120

ctcatcgacctcgcctcgccggacaagccgcgggtcatcgccgagattgctcaggcctgt180

cgcacctacggcttcttccaggtcaccaaccacgggatagcagaggagctactggagaag240

gtgatggccgtggcgttggagttcttcaggctgccgccggaggagaaggagaagctgtat300

tccgatgagccatccaagaaaatcagactctctacgagctttaacgtccgcaaggagaca360

gtacacaactggagagattatctccgccttcactgccacccgctggaggaattcgtaccc420

gagtggccctctaatccggcacagttcaaggagattatgagcacgtactgccgagaagtc480

cggcaactggggctccggcttctcggcgccatctctgtcagcctcggcctcgaggaggac540

tacatcgagaaggtgctcggcgagcaggagcagcacatggctgtgaactactacccgcgg600

tgtccggagccggacctgacctacggccttcccaagcacacggaccccaacgccctcacc660

atcctcctccccgatccccatgtcgccggcctccaggtcctcagggacggcgaccagtgg720

atcgtcgtcaacccacgccccaacgctctcgtcgtcaacctaggcgaccagatacaggct780

ctgagcaatgacgcgtacaagagcgtgtggcaccgtgcggtggttaacgcggtgcaagag840

cgcatgtcggtggcatctttcatgtgtccgtgcaacagcgcggtgatcagcccggcgagg900

aagctcgtcgcggacggggacgcgcccgtgtaccggagcttcacctacgacgagtactac960

aagaagttctggagcaggaacctggaccaggagcactgcctagagctcttcaaaggccag1020

tag1023

<210>2

<211>340

<212>prt

<213>水稻

<400>2

metalathrthrglnleuleuserthrvalgluhisarggluthrleuprogluglytyr

15101520

alaargprogluseraspargproargleualagluvalalathraspserasnilepro

25303540

leuileaspleualaserproasplysproargvalilealagluilealaglnalacys

45505560

argthrtyrglyphepheglnvalthrasnhisglyilealaglugluleuleuglulys

65707580

valmetalavalalaleugluphepheargleuproprogluglulysglulysleutyr

859095100

seraspgluproserlyslysileargleuserthrserpheasnvalarglysgluthr

105110115120

valhisasntrpargasptyrleuargleuhiscyshisproleuglugluphevalpro

125130135140

glutrpproserasnproalaglnphelysgluilemetserthrtyrcysarggluval

145150155160

argglnleuglyleuargleuleuglyalaileservalserleuglyleuglugluasp

165170175180

tyrileglulysvalleuglygluglngluglnhismetalavalasntyrtyrproarg

185190195200

cysprogluproaspleuthrtyrglyleuprolyshisthraspproasnalaleuthr

205210215220

ileleuleuproaspprohisvalalaglyleuglnvalleuargaspglyaspglntrp

225230235240

ilevalvalasnproargproasnalaleuvalvalasnleuglyaspglnileglnala

245250255260

leuserasnaspalatyrlysservaltrphisargalavalvalasnalavalglnglu

265270275280

argmetservalalaserphemetcysprocysasnseralavalileserproalaarg

285290295300

lysleuvalalaaspglyaspalaprovaltyrargserphethrtyraspglutyrtyr

305310315320

lyslysphetrpserargasnleuaspglngluhiscysleugluleuphelysglygln

325330335340

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tccctagctagctctcacacg21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ctcggtttagcttcgttgatc21

<210>5

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

cgtccgcaatgtgttattaagt22

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

caggccgtcctctctctgta20

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

aaggatagcatgggggagag20

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

tcggtggcatctttcatgtg20

<210>9

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

cctgctccagaacttcttgtagtac25