一种利用蛋白IHF-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法与流程

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种利用蛋白ihf-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法。

背景技术：

抗菌肽属于内源性肽类，是构成先天免疫系统的重要组成部分，通常含有少于50个氨基酸，其中约50％属于疏水性氨基酸，并且抗菌肽绝大多数具有耐热性。抗菌肽具有两个显著的特性，第一，具有广泛的抗菌活性；其次，它们主要针对微生物膜阻碍微生物的生长发育。目前耐药性细菌对动物和人类健康造成了严重威胁，这些多肽因其具有较强的抗菌活性和独特的杀菌机理而受到越来越多的关注，被认为有望成为新型饲料和医药抗生素替代品，因此需要制备大量的高纯度抗菌肽来满足基础研究和临床试验的需要。

当前抗菌肽的获得主要有化学合成、直接在自然中分离获取、重组蛋白的三种方法。而化学合成、直接获取抗菌肽的成本太高，也不便于大规模的生成。重组蛋白方法虽易于量产，但这些重组方法多利用昂贵的分离柱纯化，成本较高，在工业规模上目前还不具备生产抗菌肽的能力与条件。

另外，现在的融合标签多选择硫氧还蛋白、gst等来构成重组蛋白，而这些标签因蛋白过大，促可溶性表达效果差，给重组蛋白的纯化带来了极大的障碍。

宿主整合因子(integrationhostfactor，ihf)是一种由α和β亚基组成的杂二聚体蛋白，具有热稳定的性质，ihf-α亚基由hima编码(11.35kd)和，ihf-β亚基由hip编码(10.65kd)。

ihf-α是一种耐热的、不结合核酸的蛋白，ihf-β是一种核酸结合的蛋白。将ihf-α与抗菌肽进行融合设计，可以将抗菌肽对宿主菌的致死性隐藏，同时抗菌肽的体积小、阳离子性高，使其极易发生蛋白质降解，融合表达构建了一种有效克服耐热性抗菌肽表达障碍的一种方案。选择ihf-α亚基也避免了ihf中的ihf-β亚基与核酸结合，在表达后的纯化过程也避免了因引入了核酸而添加去除核酸的pei和peg高分子化合物，而pei和peg有毒。将ihf-α与抗菌肽进行融合设计表达抗菌肽，为今后抗菌肽作为绿色添加剂应用于食品、农业、畜牧业和临床医学提供一种可行方案。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明通过巧妙设计和大量的反复试验，提供一种利用蛋白ihf-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法，该方法可以极大地减少成本，为蛋白重组的大规模工业化提供了一种可能性。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种利用蛋白ihf-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法，包括如下步骤：

一、表达载体构建：选取耐热性抗菌肽与ihf-α设计融合蛋白，合成后卡入到pet-22b质粒表达载体中，融合蛋白的合成与表达采用常规方法；

二、转化克隆、蛋白表达纯化步骤：

1)转化

对融合蛋白质粒表达载体进行热激法转化：

将bl21感受态细胞置于冰上，加入重组质粒，冰上静置30min，置于金属浴42℃中热激75s，冰上静置5min，加入lb液体培养基，225rpm，37℃培养1h，取菌液涂布于lb固体培养基平板，将平板倒置于37℃培养箱内过夜培养；

2)蛋白诱导

2).1在lb液体培养基中加千分之一体积数的100μg/ml氨苄西林amp，挑取单菌落，混匀置于37℃，225rpm摇床中培养过夜12小时；

2).2扩培，在lb液体培养基中加入千分之一体积数的100μg/ml氨苄西林amp，再加入百分之一体积数的过夜培养的菌液，置于37℃、225rpm摇床中培养，培养至进入对数生长期测定od600值为0.6-0.8后，加入诱导剂iptg诱导，诱导条件为低温16℃、225rpm诱导13小时；

3)提取蛋白

3).1将诱导过的菌液，离心13000rpm，1min，4℃，收集沉淀部分为离心菌体；

3).2离心菌体加入buffera缓冲溶液充分吹打混匀；

3).3离心13000rpm，10min，4℃，保留沉淀；

3).4在沉淀中加入buffera缓冲溶液，重悬沉淀，使沉淀充分溶解在溶液中；

3).5利用超声破碎机在超声强度为20％的条件下，每次间隔5s持续超声破碎5s，直至溶液呈半透明状态；

3).6离心13000rpm，4℃，30min后，弃去沉淀保留上清溶液；

4)蛋白纯化

4).1将上一步获得的上清溶液，加入30％-80％的饱和硫酸铵溶液，充分混匀，随后置于4℃冰箱静置2-6h；

4).4将溶液在85℃金属浴中加热，20min；

4).5离心13000rpm，4℃，30min，除去不可溶解以及不耐热的蛋白杂质，弃去沉淀，保留上清溶液。

进一步，所述耐热性抗菌肽为牛乳铁蛋白肽lfcinb、乳酸链球菌素nisin、ll-37的衍生肽saap-148中的任一种。

进一步，所述饱和硫酸铵溶液体积百分数为50％。

本发明的有益效果：

1、本发明以ihf-α蛋白作为融合标签，将抗菌肽在大肠杆菌的毒性隐藏，保护抗菌肽免受细胞蛋白酶的侵害，宿主大肠杆菌则免受抗菌肽的侵害。

2、本发明利用ihf-α蛋白构建重组蛋白不仅可以可融性表达，而且利用ihf-α和抗菌肽的耐热性质也可以简化纯化步骤，相较于其他的可融表达重组蛋白纯化采用的过柱层析以及释放的抗菌肽是通过高效液相色谱(hplc)进行纯化的方法，本发明方法极大地减少了成本，为重组方法的大规模工业化生产提供了一种可能性。

3、选择ihf-α亚基也避免了ihf中的ihf-β亚基与核酸结合，在表达后的纯化过程也避免了因引入了核酸而添加去除核酸的pei和peg高分子化合物，而pei和peg有毒。将ihf-α与抗菌肽进行融合设计表达抗菌肽，为今后抗菌肽作为绿色添加剂应用于食品、农业、畜牧业和临床医学提供一种可行方案。

附图说明

图1为超声裂解提取ihfα-lfcinb总蛋白的tricine-sds-page电泳图，其中：m是蛋白marker；1是未加iptg诱导的全菌菌液；2是加iptg诱导的全菌菌液；3是离心后沉淀；4是离心后上清。

图2为加不同硫酸铵沉淀纯化ihfα-lfcinb蛋白的tricine-sds-page电泳图，其中m是蛋白marker；1是加了体积分数40％的硫酸铵；2是加了体积分数50％的硫酸铵；3是加了体积分数60％的硫酸铵；4是加了体积分数70％的硫酸铵；5是加了体积分数80％的硫酸铵。

图3为纯化后ihfα-lfcinb蛋白的tricine-sds-page电泳图，其中m是蛋白marker；1是纯化前的蛋白lfcinb-ihfα；2是上清a；3是沉淀a；4是纯化后lfcinb-ihfα蛋白。

图4为ihfα-lfcinb蛋白酶切的tricine-sds-page电泳图，其中m是蛋白marker；1是纯化的ihfα-lfcinb；2是lfcinb。

图5为纯化后nisin-ihfα的tricine-sds-page电泳图，m是小分子量蛋白marker；1是加体积分数30％的硫酸铵。

图6为纯化后saap-148-ihfα的tricine-sds-page电泳图，m是小分子量蛋白marker；1是加体积分数30％的硫酸铵；2是加体积分数40％的硫酸铵。

具体实施方式

为了达到上述目的与功效，进一步理解本发明的技术方案，以下特举出较佳实施例，并配合附图，详细说明如下：

以下实施例中所使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。

实施例1

本实施例选取牛乳铁蛋白肽lfcinb作为耐热性抗菌肽，lfcinb与ihf-α设计融合基因，从而带动耐热性抗菌肽lfcinb表达。

表达载体构建

利用ncbi查找大肠杆菌k-12mg1655菌株的ihf-α基因，基因库编号为nc_000913.3。同样利用ncbi查找lfcinb的基因，基因库编号为ay383481.1，该基因序列为密码子优化过的序列，有利于在大肠杆菌中表达lfcinb。

将lfcinb与ihf-α进行融合基因设计，其中将ihf-α基因设计在5’端，lfcinb基因设计在3’端，胃蛋白酶可以有效的识别芳香族氨基酸并酶解，lfcinb与ihf-α蛋白的连接处正好是芳香族氨基酸苯丙氨酸(f)，ihf-α氨基酸序列中有7处胃蛋白酶酶切位点，因此选择胃蛋白酶可以有效将纯化的融合蛋白切开，同时胃蛋白酶也会酶解ihf蛋白，破坏其结构，使其失去耐热活性。将基因送无锡青兰公司合成并卡入到pet-22b质粒表达载体中。ihf-α-lfcinb的融合基因序列如seqidno.1所示。

转化克隆、蛋白表达纯化的具体步骤：

1、转化

取含ihf-α-lfcinb基因的pet22b质粒1μl(10ng/μl)，进行热激法转化，操作过程如下：

将100μlbl21感受态细胞置于冰上，加入1μl重组质粒pet22b-lfcinb-ihfα，冰上静置30min。置于金属浴42℃中热激75s，冰上静置5min。加入300μllb液体培养基，225rpm，37℃培养1h。取100μl菌液涂布于lb固体培养基平板，将平板倒置于37℃培养箱内过夜培养。

其中，lb液体培养基成分为：蛋白胨10g，酵母粉5g，nacl10g，蒸馏水1000ml。高温灭菌121℃，30min。4℃保存备用。

lb固体培养基成分为：蛋白胨10g，酵母粉5g，nacl10g，琼脂15g，加蒸馏水定容到1000ml。高温灭菌121℃，30min后，温度降至55℃加1ml氨苄西林，混匀后倒平板。4℃保存备用。

2、ihf-α-lfcinb蛋白诱导

2.1在5ml的lb液体培养基，加5μl氨苄西林amp(100μg/ml)，挑取单菌落，混匀置于37℃，225rpm摇床中培养过夜12小时；

2.2扩培，80mllb液体培养基中加入80μl氨苄西林amp(100μg/ml)，再加入800μl过夜培养的菌液，置于37℃、225rpm摇床中培养，培养至进入对数生长期测定od600值为0.6-0.8后，加入200μl诱导剂iptg(100mmol/l)诱导，诱导条件为低温16℃、225rpm诱导13小时。同时，保存未诱导的菌液。

3、ihf-α-lfcinb蛋白提取

3.1将诱导过的菌液每10ml为一个样品，离心13000rpm，1min，4℃，收集沉淀部分为离心菌体，同时未诱导菌液也做同样处理，下同；

3.2离心菌体加入1.5mlbuffera缓冲溶液(20mmtris-hcl，1mmedta，0.5mmdtt，1mmpmsf，下同)充分吹打混匀；

3.3离心13000rpm，10min，4℃，保留沉淀；

3.4在沉淀中加入1.5ml的buffera缓冲溶液，重悬沉淀，使沉淀充分溶解在溶液中；

3.5利用超声破碎机在超声强度为20％的条件下，每次间隔5s持续超声破碎5s，直至溶液呈半透明状态；

3.613000rpm，4℃，离心30min后，弃去沉淀保留上清溶液。tricine-sds-page电泳检测离心后上清样品中是否有融合蛋白。实验结果如图1。与未诱导菌液条带1相比，条带2的15kd处有明显的蛋白痕迹，可知融合蛋白ihf-α-lfcinb在大肠杆菌可以表达，没有出现毒性基因。并在条带3和条带4中对比，可知ihf-α-lfcinb在上清中大量出现，融合蛋白在宿主细胞中是可溶性表达，没有形成包涵体。

4、ihf-α-lfcinb蛋白纯化

4.1将上一步获得的上清溶液，加入不同量的饱和硫酸铵溶液，具体加入量见表1，加入饱和硫酸铵之后，充分混匀，随后置于4℃冰箱静置2-6h；

表1不同体积分数饱和硫酸铵加入量

4.213000rpm，4℃，离心30min，弃去上清a，收集沉淀a；

4.3在沉淀a中加入与蛋白上清液等量的buffera缓冲溶液重悬沉淀，使沉淀重新溶解在buffera缓冲溶液中，4℃冰箱静置2h；

4.4将溶液在85℃金属浴中加热，20min；

4.513000rpm，4℃，离心30min，除去不可溶解以及不耐热的蛋白杂质，弃去沉淀，保留上清溶液。tricine-sds-page电泳检测纯化后的ihfα-lfcinb蛋白。图2为不同体积分数的饱和硫酸纯化ihfα-lfcinb蛋白的tricine-sds-page电泳，随着硫酸铵的加入量逐渐加大，加50％体积分数的饱和硫酸铵纯化的ihf-α-lfcinb蛋白最为干净、浓度最高，所以将加入50％的饱和硫酸铵确定为ihf-α-lfcinb蛋白纯化的最优加入量。将加入50％的饱和硫酸铵沉淀融合蛋白进行tricine-sds-page电泳结果如图3所示。融合蛋白的大小在15kd，在加入硫酸铵体积分数为50％，并进行加热后得到一条带大小在15kd，这与目的条带大小相同，且具有耐热性能，进一步证明该条带为目的融合蛋白。

5、ihf-α-lfcinb蛋白酶切

5.1配置胃蛋白酶10mg/ml，并用hcl调节ph值为3-5；

5.2将上一步得到50％体积分数的硫酸铵沉淀的上清液，使用1mhcl调节ph值为3-5。蛋白上清取600μl已调过ph的蛋白样品，然后加入10mg/ml胃蛋白酶66.6μl，混合均匀；

5.4在37℃金属浴中加热，3h；

5.4在85℃金属浴中加热，20min；

5.5使用1mnaoh调节ph至中性；

5.613000rpm，4℃，离心30min，保留上清。上清进行tricine-sds-page电泳检测酶切结果。结果如图4所示，在条带2中的3kd左右有蛋白痕迹，而抗菌肽的lfcinb的大小在2.5kd，抑菌实验验证具有抑菌作用，并通过质谱验证氨基酸序列信息正确，与实验设计的lfcinb的序列比对相同。

实施例2

本实施例是选取乳酸链球菌素(nisin)作为耐热性抗菌肽，nisin与ihf-α设计融合基因，从而带动耐热性抗菌肽nisin表达。

利用ncbi查找大肠杆菌k-12mg1655菌株的ihf-α基因，基因库编号为nc_000913.3。同样利用ncbi查找nisin的基因，基因库编号为m27277。将nisin与ihf-α基因进行融合基因设计，考虑到nisin复杂的成熟过程，及n端信号肽序列以及翻译后修饰加工才能得到有活性蛋白的重要性。在融合基因设计中，应将nisin的基因设计在5端，并在连接处添加tat基因芳香族氨基酸苯丙氨酸(f)作为切点。送无锡青兰公司合成，并将基因卡入到pet-22b质粒表达载体中。nisin-ihfα的融合基因序列如seqidno.2所示。

转化克隆、蛋白表达纯化的具体步骤：

1、转化

取pet22b含nisin-ihfα基因质粒1μl(10ng/μl)，热激法进行转化，操作过程如下：

将100μlbl21感受态细胞置于冰上，加入1μl重组质粒pet22b-nisin-ihfα，冰上静置30min。置于金属浴42℃中热激75s，冰上静置5min。加入300μllb液体培养基，225rpm，37℃培养1h。取100μl菌液涂布于lb固体培养基平板，将平板倒置于37℃培养箱内过夜培养。

2、nisin-ihfα蛋白诱导

2.1在5ml的lb液体培养基，加氨苄西林amp5μl(100μg/ml)，挑取单菌落，混匀置于37℃，225rpm摇床中培养过夜12小时。

2.2扩培，80mllb液体培养基中加入80μl氨苄西林amp(100μg/ml)，再加入800μl过夜培养的菌液，当进入对数生长期测定od600值为0.6-0.8后，加入iptg200μl(100mmol/l)诱导，诱导条件是37℃、225rpm诱导4小时。

3、nisin-ihfα蛋白提取

3.1将诱导过的菌液每10ml为一个样品，离心13000rpm，1min，4℃，收集沉淀部分为离心菌体。同时未诱导菌液也做同样处理，下同；

3.2沉淀加入1.5mlbuffera缓冲溶液充分吹打混匀；

3.313000rpm，4℃，离心10min，离心后保留沉淀；

3.4沉淀加入1.5ml的buffera缓冲溶液，重悬沉淀，使沉淀充分溶解；

3.5超声强度为20％的条件下，每次间隔5s持续超声破碎5s，超声破碎6次左右，直至溶液半澄清；

3.613000rpm，4℃，离心30min，保留上清。

4.nisin-ihfα蛋白纯化

4.1在上一步获得的上清液中，加入30％体积分数的饱和硫酸铵溶液，充分混匀，随后置于4℃冰箱静置4h；

4.213000rpm，4℃，离心30min，弃去上清，收集沉淀；

4.3在沉淀中加入与蛋白上清液等量的buffera缓冲溶液重悬沉淀，使沉淀重新溶解在buffera缓冲溶液中。4℃冰箱静置2h；

4.4将溶液在85℃金属浴中加热，20min；

4.513000rpm，4℃，离心30min，除去不可溶解以及不耐热的蛋白杂质，弃去沉淀，保留上清溶液。tricine-sds-page电泳检测纯化后的nisin-ihfα蛋白。结果如图5所示，参照分子质量标准，在15kd处有与目标融合蛋白nisin-ihfα大小相同的条带，表示nisin-ihfα融合蛋白可以在表达并纯化。

5、nisin-ihfα蛋白酶切

5.1配置胃蛋白酶10mg/ml，并用hcl调节ph值为3-5；

5.2将上一步硫酸铵体积分数30％条件下得到的上清液，取80μl已调过ph的蛋白样品，然后加入10mg/ml胃蛋白酶11μl，混合均匀；

5.3在37℃金属浴中加热，3h；

5.4在85℃金属浴中加热，20min；

5.513000rpm，4℃，离心30min，保留上清。并通过质谱验证氨基酸序列信息正确，与实验设计的nisin序列比对相同。

实施例3

本实施例是选取ll-37的衍生肽saap-148作为耐热性抗菌肽，saap-148与ihf-α设计融合基因，从而带动耐热性抗菌肽saap-148表达。

saap-148基因的来源于文献theantimicrobialpeptidesaap-148combatsdrug-resistantbacteriaandbiofilms，根据大肠杆菌的密码子选择偏好性，将氨基酸序列翻译为基因序列，并根据文献要求不宜对序列进行突变修改，因此选择肠激酶酶切位点作为切割点。saap-148-ihfα基因表达载体的构建过程：将saap-148与ihf-α进行融合基因设计，为了使saap-148不引入多余的氨基酸序列，将其设计在ihf-α的3’端，saap-148基因设计在5’端，其中两个基因片段之间加入gatgacgatgacaaa基因序列作为肠激酶酶切位点，然后将基因卡入到pet-22b质粒表达载体中。基因送无锡青兰公司合成并卡入质粒。saap-148-ihfα的融合基因序列如seqidno.3所示。

转化克隆、蛋白表达纯化的具体步骤如下：

1、转化

取pet22b含saap-148-ihfα基因质粒1μl(10ng/μl)，热激法进行转化，操作过程如下：

将100μlbl21感受态细胞置于冰上，加入1μl重组质粒pet22b-saap-148-ihfα，冰上静置30min。置于金属浴42℃中热激75s，冰上静置5min。加入300μllb液体培养基，225rpm，37℃培养1h。取100μl菌液涂布于lb固体培养基平板，将平板倒置于37℃培养箱内过夜培养。

2、saap-148-ihfα蛋白诱导

2.1在5ml的lb液体培养基，加氨苄西林amp5μl(100μg/ml)，挑取单菌落，混匀置于37℃，225rpm摇床中培养过夜12小时。

2.2扩培，过夜培养液按1：100比例加入lb液体培养基中，也就是80mllb培养基中有800μl菌液，80μl氨苄西林amp(100μg/ml)，当进入对数生长期测定od600值为0.6-0.8后，加入iptg200μl(100mmol/l)诱导，诱导条件是37℃、225rpm诱导4小时。

3、saap-148-ihfα蛋白提取

3.1将诱导过的菌液每10ml为一个样品，离心13000rpm，1min，4℃，收集沉淀部分为离心菌体。同时未诱导菌液也做同样处理，下同；

3.2沉淀加入1.5mlbuffera缓冲溶液充分吹打混匀；

3.313000rpm，4℃，离心10min，离心后，保留沉淀；

3.4沉淀加入1.5ml的buffera缓冲溶液，重悬沉淀，使沉淀充分溶解在溶液中；

3.5超声强度为20％的条件下，每次间隔5s持续超声破碎5s，超声破碎6次左右，直至溶液半澄清；

3.613000rpm，4℃，离心30min，保留上清。

4、saap-148-ihfα蛋白纯化

4.1在上一步获得的上清液中，加入30％、40％体积分数的饱和硫酸铵溶液，充分混匀，随后置于4℃冰箱静置4h；

4.213000rpm，4℃，离心30min，弃去上清，收集沉淀；

4.3在沉淀中加入与蛋白上清液等量的buffera缓冲溶液重悬沉淀，使沉淀重新溶解在buffera缓冲溶液中。4℃冰箱静置2h；

4.4将溶液在85℃金属浴中加热，20min；

4.513000rpm，4℃，离心30min，除去不可溶解以及不耐热的蛋白杂质，弃去沉淀，保留上清溶液。sds-page电泳检测纯化后的saap-148-ihfα蛋白，结果如图6所示，参照分子质量标准，在15kd处有与目标融合saap-148-ihfα蛋白大小相同的条带，表明saap-148-ihfα蛋白可以在大肠杆菌中表达，并在纯化后可以得到一条达到电泳纯度的融合蛋白。

5、saap-148-ihfα蛋白酶切

5.1将硫酸铵体积分数30％、40％条件下得到的上清液，使用bca测定蛋白浓度为0.1mg/ml，取200μl然后分别加入10u/μl重组肠激酶0.1μl，混合均匀。

5.2在25℃水浴锅中反应，16h。

5.3在85℃金属浴中加热，20min。

5.413000rpm，4℃，离心30min，保留上清，并通过质谱验证氨基酸序列信息正确，与实验设计的saap-148序列比对相同。

序列表

<110>华侨大学

<120>一种利用蛋白ihf-α构建和表达耐热性抗菌肽融合蛋白的方法

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>384

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

catatggcgcttacaaaagctgaaatgtcagaatatctgtttgataagcttgggcttagc60

aagagggatgccaaagaactggttgaactgtttttcgaagagatccgtcgcgctctggaa120

aacggcgaacaggtgaaactctctggttttggtaacttcgatctgcgtgataagaatcaa180

cgcccgggacgtaacccgaaaacgggcgaggatattcccattacagcaaggcgcgtggtg240

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ttcaaatgccgccgttggcagtggcgtatgaaaaaactgggtgcgccgtctattacctgc360

gtgcgtcgcgcgttctgactcgag384

<210>2

<211>417

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

catatgattacaagtatttcgctatgtacacccggttgtaaaacaggagctctgatgggt60

tgtaacatgaaaacagcaacttgtcattgtagtattcacgtaagcaaatatatggcgctt120

acaaaagctgaaatgtcagaatatctgtttgataagcttgggcttagcaagagggatgcc180

aaagaactggttgaactgtttttcgaagagatccgtcgcgctctggaaaacggcgaacag240

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gggcagaagttaaaaagcagggtcgaaaacgcttcgcccaaagacgagtgactcgag417

<210>3

<211>396

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

catatggcgcttacaaaagctgaaatgtcagaatatctgtttgataagcttgggcttagc60

aagagggatgccaaagaactggttgaactgtttttcgaagagatccgtcgcgctctggaa120

aacggcgaacaggtgaaactctctggttttggtaacttcgatctgcgtgataagaatcaa180

cgcccgggacgtaacccgaaaacgggcgaggatattcccattacagcaaggcgcgtggtg240

accttcagacccgggcagaagttaaaaagcagggtcgaaaacgcttcgcccaaagacgag300

gatgacgatgacaaactgaaacgtgtgtggaaacgagtgtttaaactgctgaaacgatat360

tggcgacagctgaaaaaaccggtgcgttgactcgag396