分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用。
背景技术：
：单克隆抗体是生物制药行业最重要的组成部分之一，尤其是在自身免疫性疾病和肿瘤领域占据主要地位。截止2013年，有35种单克隆抗体获得美国fda的批准，其中，免疫球蛋白g(igg)占绝大多数。因此，人们对igg的生产最为关注。单克隆抗体是一个由轻链lc和重链hc组装成的异四聚体蛋白质。根据不同的重链，可以将单克隆抗体分成5类免疫球蛋白：igg、igm、igd、iga和ige。igg抗体是由两个相同重链(hc)和两个相同轻链(lc)组成的对称抗体，每一个都通过二硫键相连。egfr是表皮生长因子受体家族成员之一，是原癌基因c-erbb1的表达产物。egfr可以在细胞核中积累聚集，并对细胞增殖、dna修复、肿瘤发生、炎症等产生影响。截止2017年1月，共有10种以egfr为靶点的药物获得fda批准上市，包括4种大分子药物(cetuximab、nimotuzumab、panitumumab和necitumumab)和6种小分子药物(erlotinib、gefitinib、lcotinib、afatinib、osimertinib和olmutinib)。cetuximab(西妥昔单抗)由德国默克里昂制药公司生产，主要用于治疗结肠直肠癌，商品名为爱必妥，是针对egf受体的igg单克隆抗体。它的前身抗体225是通过杂交瘤技术产生的。西妥昔单抗与人egfr的细胞外结构域结合，竞争性阻断受体与天然配体的结合，如egf和tgf-α。较高亲和力的西妥昔单抗阻止egfr形成其开放的活性构象和二聚化，造成egfr的磷酸化和后续信号级联的蛋白质减少。西妥昔单抗与egfr特异性结合后，会阻断细胞内信号转导途径，进而抑制癌细胞的增殖，诱导癌细胞的凋亡。目前，在大肠杆菌中成功表达全长igg抗体的例子有限。2002年，simmons等人发表在journalofimmunologicalmethods上的文献expressionoffull-lengthimmunoglobulinsinescherichiacoli:rapidandefficientproductionofaglycosylatedantibodies.首次实现了在大肠杆菌中表达全长igg单克隆抗体，并优化了igg的轻链和重链的比例，从而获得高产igg的大肠杆菌工程菌株。2007年，yarvm等人发表在naturebiotechnology上的文献isolationofengineered,full-lengthantibodiesfromlibrariesexpressedinescherichiacoli.公开了构建igg单抗的组合文库系统，筛选出高产igg的大肠杆菌突变菌株。分子伴侣是一类蛋白质，它能够识别并结合折叠不完全的蛋白质，帮助多肽的正确转运、折叠。折叠酶和周质空间伴侣蛋白是常见的分子伴侣，它们的共表达可以防止蛋白质的聚集，并提高周质空间中重组蛋白质的表达量。表达抗tnf抗体fab片段的重组大肠杆菌工程菌这篇中文专利于2016年申请公布，该专利公开了多个分子伴侣如dsbc、ppib、skp等分子伴侣对fab表达的影响。然而，在大肠杆菌中共表达抗egfr抗体igg的多种分子伴侣中，哪种分子伴侣最适合，可以最大化提高igg的表达量并且促进完整igg的形成，需要大量的实验研究确定。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用。本实验以e.colimg1655为出发菌株，提供了一种在大肠杆菌中表达全长igg抗体的方法，同时共表达了分子伴侣，促进全长igg的正确形成，提高igg抗体的产量，为将来的工业化生产提供理论依据。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用；所述分子伴侣具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：本发明提供了具有dsba、dsbc和/或skp的核苷酸序列；ii、具有如i所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；iii、与如i所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与dsba、dsbc和/或skp表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；iv、如i、ii或iii所示序列的互补序列。在本发明的一些具体实施方案中，所述单克隆抗体为igg。在此基础上，本发明海提拱了一种表达模块，包括分子伴侣以及单克隆抗体；所述分子伴侣具有如下所示的核苷酸序列中的任意一项：i、具有dsba、dsbc和/或skp的核苷酸序列；ii、具有如i所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列；iii、与如i所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列或翻译后所得蛋白与dsba、dsbc和/或skp表达的蛋白功能相同或相近的核苷酸序列；iv、如i、ii或iii所示序列的互补序列。在本发明的一些具体实施方案中，所述单克隆抗体为igg。本发明还提供了所述的表达模块在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用。本发明还提供了表达载体，包括本发明所述的表达模块。在此基础上，本发明还提供了所述的表达载体在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用。本发明还提供了菌株，包括本发明所述的表达载体。在本发明的一些具体实施方案中，出发菌株为e.colimg1655，启动子为bad。本发明还提供了所述的菌株在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用。单克隆抗体及其衍生物广泛应用于研究和临床，已被开发为预防、治疗和诊断试剂。本实验以e.colimg1655为出发菌株，提供了一种在大肠杆菌中表达全长igg抗体的方法，同时共表达了分子伴侣，促进全长igg的正确形成，提高igg抗体的产量，为将来的工业化生产提供理论依据。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示大肠杆菌中表达igg的质粒示意图；图2(a)示dsba和dsbc作用机理示意图；图2(b)示共表达分子伴侣的质粒示意图；图2(c)示分子伴侣对单克隆抗体表达的影响；图3示图2(c)对应的dsbc的生物统计学结果；其中，1.00-为野生型数据，2.00-为改造后数据；p＝0.004<0.01；图4示图2(c)对应的dsba的生物统计学结果；其中，1.00-为野生型数据，2.00-为改造后数据；p＝0.000<0.01；图5示图2(c)对应的skp的生物统计学结果；其中，1.00-为野生型数据，2.00-为改造后数据；p＝0.019<0.05。具体实施方式本发明公开了分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。基因的体外合成和扩增单抗的轻链和重链氨基酸序列(来源于人源)从ncbi数据库获得，在jcat网站中对序列进行了优化，并在优化的序列中避免了xbai，ndei，spei和hindiii限制性酶切位点。dsbc基因序列(来源于大肠杆菌mg1655)也从ncbi数据库获得，在jcat网站中对序列进行了优化，并在优化的序列中避免了xbai，ndei，spei和hindiii限制性酶切位点。dsba和skp基因与dsbc基因的获得方式相同。轻链(如seqidno.1所示)、重链(如seqidno.2所示)、dsbc(如seqidno.5所示)、dsba(如seqidno.4所示)和skp(如seqidno.6所示)基因均在体外合成。所用的大肠杆菌菌株和质粒在所有实验中，大肠杆菌transt1用于基因克隆，大肠杆菌mg1655用于单抗表达。单抗基因连接到包含pbr322复制子的p2a4载体中。dsbc、dsba和skp基因连接到包含p15a复制子和bad启动子的p3c5bad载体。构建方法：单抗基因：p2a4空质粒载体的蛋白表达区域是由lacuv5启动子引导的，后面连接乳糖操纵子，之后有一段核糖体结合位点，之后的序列中包含ecori、xbai、ndei、spei和psti酶切位点。通过用ndei和spei酶切空质粒载体后连接上述体外合成的单抗基因；分子伴侣：p3c5bad空质粒载体的蛋白表达区域是由bad启动子引导的，后面连接操纵子，之后有一段核糖体结合位点，之后的序列中包含ecori、xbai、ndei、spei和psti酶切位点。通过用ndei和spei酶切空质粒载体后连接上述体外合成的dsbc、dsba或skp基因。名词及术语解释e.coli：大肠杆菌单克隆抗体：简称单抗igg：免疫球蛋白g轻链(lc)：单克隆抗体的轻链区域，由vl和cl构成重链(hc)：单克隆抗体的重链区域，由vh，ch1,ch2和ch3区域构成pcr：聚合酶链式反应pbs：磷酸缓冲盐溶液美国fda：美国食品药品监督管理局lb培养基：5g/l酵母提取物；10g/l蛋白胨；10g/l氯化钠iptg：异丙基硫代半乳糖苷l-ara：l-阿拉伯糖。本发明提供的分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用中所用出发菌株及试剂均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1构建方法单抗基因：p2a4空质粒载体的蛋白表达区域是由lacuv5启动子引导的，后面连接乳糖操纵子，之后有一段核糖体结合位点，序列中包含ecori、xbai、ndei、spei和psti等一系列酶切位点；其中，启动子和操纵子位于ecori和xbai酶切位点之间，核糖体结合位点位于xbai和ndei酶切位点之间。首先通过用ndei和spei酶切将轻链(lc)和重链(hc)的基因分别连接入p2a4质粒空载体上；然后将含有重链(hc)的p2a4，通过xbai和psti酶切，连接到含有轻链(lc)的p2a4质粒载体上，从而将轻链(lc)和重链(hc)基因连接到同一个p2a4质粒上。在这个质粒上，轻链和重链前面均有一段核糖体结合位点，轻链在前，重链在后，并且通用一个lacuv5启动子进行诱导表达。如图1所示。分子伴侣：p3c5bad空质粒载体的蛋白表达区域是由bad启动子引导的，后面连接操纵子，之后有一段核糖体结合位点，序列中包含ecori、xbai、ndei、spei和psti等一系列酶切位点；其中，启动子和操纵子位于ecori和xbai酶切位点之间，核糖体结合位点位于xbai和ndei酶切位点之间。通过用ndei和spei酶切将dsbc、dsba或skp基因分别连接入p3c5bad质粒空载体上。如图2(b)所示。实施例2摇瓶发酵将单个大肠杆菌细胞在lb液体培养基和适当的抗生素(100μg/ml氨苄青霉素和/或34μg/ml氯霉素)中培养，37℃和220rpm下过夜培养；将培养物以1:100比例转接入50ml新鲜lb培养基(250ml摇瓶)中，并在37℃下生长。当600nm处的光密度(od600)达到约0.6时，培养箱温度降至25℃，平衡温度20分钟。加入异丙基硫代半乳糖苷(iptg)，使其终浓度为1mm。当共表达分子伴侣时，在加入iptg诱导的同时加入终浓度为1mm的l-阿拉伯糖，细胞在25℃下生长16小时。实施例3单克隆抗体的纯化将发酵后的培养物，6500rpm和4℃收集并离心。细胞用0.01mpbs(ph＝7.2-7.4)洗涤。用pbs重悬细胞并进行超声破碎处理，5s脉冲，10s间歇，总工作时间为20分钟。然后，将细胞裂解物在10,000rpm和4℃下离心30分钟，收集上清液。然后使用0.45μm滤膜进行过滤。在本实验中，抗体纯化磁珠试剂盒用于纯化单克隆抗体。1.样品处理：取抗体含量约0.1-0.15mg的样品置于新的1.5mlep管中，加入抗体结合缓冲液至总体积为500μl(如样品体积大于500μl，则无需加入)，混合均匀。2.磁珠预处理：将抗体纯化磁珠涡旋震荡30s，使磁珠充分重悬；取100μl磁珠悬液置于另一新的1.5mlep管中.对磁珠悬液进行磁性分离(使磁珠被吸附在管壁至溶液澄清；该操作描述以下省略，弃上清液。从磁性分离器上取下ep管，管中磁珠可直接用于抗体分离)。3.抗体吸附：在步骤2预处理的磁珠管中加入步骤1处理的样品溶液，涡旋震荡均匀，在室温下(约25℃)置于翻转混合仪上，促使样品和磁珠充分接触并吸附，翻转约15min后进行磁性分离，移弃上清液。4.磁珠洗涤：向ep管中加入1ml抗体结合缓冲液，振荡重悬磁珠后进行磁性分离，移弃上清液；该操作重复两次。5.抗体洗脱：在上述完成磁珠洗涤的ep管中加入1ml抗体结合缓冲液，涡旋震荡迅速重悬，然后在室温下置于翻转混合仪上，翻转10min后进行磁性分离，收集上清液至新的ep管。6.抗体透析：因抗体洗脱缓冲液含有较高浓度的盐分，收集的抗体溶液不能直接用于sds-page检测，但可以用抗体洗脱缓冲液调零进行抗体浓度测定。抗体洗脱缓冲液呈偏酸性，用自行配制的中性低盐溶液立即对收集的抗体溶液进行透析处理，以降低抗体失活率，获得较高活性和稳定性的抗体溶液。所述自行配制的中型低盐溶液为0.01mpbs溶液：氯化钠137mmol/l；氯化钾2.7mmol/l；磷酸氢二钠10mmol/l；磷酸二氢钾2mmol/l。实施例4sds-page发酵后，将1ml待测试的培养液吸出，以10,000rpm离心2分钟，弃去上清液。用0.01mpbs溶液洗涤细胞3次，弃去上清液。再用200ulpbs重悬细胞。然后将适量的上样缓冲液加入重悬溶液中并充分混合。将混合液煮沸10分钟并放置在-80℃储存。点样前，用12,000rpm离心2min，然后吸取适量的上清液上样点胶。实施例5elsia(酶联免疫吸附剂测定)1.稀释样品(此步骤选做)。2.每孔加入100μlassaybuffer，分别将10μl样品或不同浓度标准品加入相应孔中，轻轻摇板进行简单混合，用封板膜封住反应孔，室温下(18-25度)孵化30min。3.揭掉封板膜，吸弃孔内液体。用300μl稀释的washbuffer洗涤3次，在干净的纸上拍干。4.每孔加入100μl准备好的hrpconjugate。5..用新的封板膜密封。室温孵化30min。6..重复步骤3。7.每孔加入100μltmbsubstratesolution。8.黑暗条件下室温孵化10分钟(不封膜)。9.加入100μlstopsolution停止反应。轻轻摇板进行简单混合，孔内颜色由蓝变黄。10.以空白孔调零，30min内使用酶标仪在450nm测定每孔的吸光度。效果例大肠杆菌中抗egfr抗体igg的表达图1为大肠杆菌中表达抗egfr抗体igg的质粒示意图。本文选用lacuv5启动子用于表达igg。在轻链(lc)和重链(hc)的前端，分别引入一段stii信号肽序列(如seqidno.3所示)，保证轻链和重链可以分泌到周质空间中。周质空间是指细胞壁与细胞膜之间的狭小空间。周质空间中蛋白酶比胞质中少且活性低，因此，目的蛋白处于周质空间中可以减少其降解，利于其稳定存在。共表达折叠因子和分子伴侣蛋白质的折叠、分泌和组装对于可溶性重组蛋白的形成是至关重要的。通常用折叠酶和分子伴侣共表达来增加蛋白质的溶解度并提高重组蛋白质的产量。在本实验中，研究了dsba、dsbc和skp这三个分子伴侣，以评估它们在大肠杆菌中对igg表达的影响。dsba(periplasmicproteindisulfideisomerasei)和dsbc(proteindisulfideisomeraseii)均是蛋白质二硫键异构酶(属于折叠酶)，位于周质空间。其中，dsba的分子量为23.1kd，而dsbc是由两个分子量为23.3kd亚基组成的同源二聚体蛋白质。它们可以催化轻链与重链间二硫键和两个重链之间二硫键的形成，以获得完整的igg抗体，其作用机制如图2a所示。skp(periplasmicchaperone)又叫做omph，是一种分子伴侣，位于周质空间。它可以促进重组蛋白的折叠，并且增加轻链和重链的溶解度和分泌表达。图2b是用于共表达分子伴侣的质粒示意图，选用bad启动子用于共表达分子伴侣。实验发现dsba、dsbc和skp这三种分子伴侣的共表达均对igg单抗的表达产生了影响，如图2c、表1所示，elisa结果证实dsbc、dsba和skp的共表达均提高了完整igg的产量。特别是，当共表达dsba时，igg产量增加最多，是空白对照的2倍左右(空白对照为不共表达分子伴侣的野生型大肠杆菌菌株)。结果表明igg的产生依赖于上述三种伴侣蛋白的共表达，尤其高度依赖于dsba的共表达。从结果可以看出，三种伴侣蛋白中，dsba对igg表达影响最大，可以最大化提高igg的表达量并且促进完整igg的形成。表1od450均值标准偏差wt0.2430.012dsbc0.3160.018dsba0.4830.016skp0.2850.015生物学统计结果见图3～5。其中，图3示dsbc与野生型数据相比，p＝0.004<0.01；图4示dsba与野生型数据相比，p＝0.000<0.01；图5示skp与野生型数据相比，p＝0.019<0.05。表明dsbc、dsba和skp的共表达均提高了完整igg的产量。特别是，当共表达dsba时，igg产量增加最多，是空白对照的2倍左右(空白对照为不共表达分子伴侣的野生型大肠杆菌菌株)。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>天津大学；扬州奥锐特药业有限公司；扬州联澳生物医药有限公司<120>分子伴侣在促进单克隆抗体的形成和/或提高单克隆抗体的表达量中的应用<130>mp1813964<160>6<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>645<212>dna<213>轻链(lc)<400>1gacatcctgctgacccagtctccggttatcctgtctgtttctccgggtgaacgtgtttct60ttctcttgccgtgcttctcagtctatcggtaccaacatccactggtaccagcagcgtacc120aacggttctccgcgtctgctgatcaaatacgcttctgaatctatctctggtatcccgtct180cgtttctctggttctggttctggtaccgacttcaccctgtctatcaactctgttgaatct240gaagacatcgctgactactactgccagcagaacaacaactggccgaccaccttcggtgct300ggtaccaaactggaactgaaacgtaccgttgctgctccgtctgttttcatcttcccgccg360tctgacgaacagctgaaatctggtaccgcttctgttgtttgcctgctgaacaacttctac420ccgcgtgaagctaaagttcagtggaaagttgacaacgctctgcagtctggtaactctcag480gaatctgttaccgaacaggactctaaagactctacctactctctgtcttctaccctgacc540ctgtctaaagctgactacgaaaaacacaaagtttacgcttgcgaagttacccaccagggt600ctgtcttctccggttaccaaatctttcaaccgtggtgaatgctaa645<210>2<211>1343<212>dna<213>重链(hc)<400>2caggttcagctgaaacagtctggtccgggtctggttcagccgtctcagtctctgtctatc60acctgcaccgtttctggtttctctctgaccaactacggtgttcactgggttcgtcagtct120ccgggtaaaggtctggaatggctgggtgttatctggtctggtggtaacaccgactacaac180accccgttcacctctcgtctgtctatcaacaaagacaactctaaatctcaggttttcttc240aaaatgaactctctgcagtctaacgacaccgctatctactactgcgctcgtgctctgacc300tactacgactacgaatttgcttactggggtcagggtactctcgttaccgtaagcgctgct360tctaccaaaggtccgtctgttttcccgctggctccgtcttctaaatctacctctggtggt420accgctgctctgggttgcctggttaaagactacttcccggaaccggttaccgtttcttgg480aactctggtgctctgacctctggtgttcacaccttcccggctgttctgcagtcttctggt540ctgtactctctgtcttctgttgttaccgttccgtcttcttctctgggtacccagacctac600atctgcaacgttaaccacaaaccgtctaacaccaaagttgacaaacgtgttgaaccgaaa660tctgacaaaacccacacctgcccgccgtgcccggctccggaactgctgggtggtccgtct720gttttcctgttcccgccgaaaccgaaagacaccctgatgatctctcgtaccccggaagtt780acctgcgttgttgttgacgtttctcacgaagacccggaagttaaattcaactggtacgtt840gacggtgttgaagttcacaacgctaaaaccaaaccgcgtgaagaacagtacaactctacc900taccgtgttgtttctgttctgaccgttctgcaccaggactggctgaacggtaaagaatac960aaatgcaaagtttctaacaaagctctgccggctccgatcgaaaaaaccatctctaaagct1020aaaggtcagccgagggagccgcaggtatacaccctcccgccgtctcgtgacgaactgacc1080aaaaaccaggtttctctgacctgcctggttaaaggtttctacccgtctgacatcgctgtt1140gaatgggaatctaacggtcagccggaaaacaactacaaaaccaccccgccggttctggac1200tctgacggttctttcttcctgtactctaaactgaccgttgacaaatctcgttggcagcag1260ggtaacgttttctcttgctctgttatgcacgaagctctgcacaaccactacacccagaaa1320tctctgtctctgtctccgggtaa1343<210>3<211>69<212>dna<213>stii信号肽(stiisignalpeptide)<400>3atgaaaaagaacatagcgtttcttcttgcatctatgttcgttttttctattgctacaaac60gcgtatgca69<210>4<211>627<212>dna<213>dsba<400>4atgaaaaagatttggctggcgctggctggtttagttttagcgtttagcgcatcggcggcg60cagtatgaagatggtaaacagtacactaccctggaaaaaccggtagctggcgcgccgcaa120gtgctggagtttttctctttcttctgcccgcactgctatcagtttgaagaagttctgcat180atttctgataatgtgaagaaaaaactgccggaaggcgtgaagatgactaaataccacgtc240aacttcatgggtggtgacctgggcaaagatctgactcaggcatgggctgtggcgatggcg300ctgggcgtggaagacaaagtgactgttccgctgtttgaaggcgtacagaaaacccagacc360attcgttctgcttctgatatccgcgatgtatttatcaacgcaggtattaaaggtgaagag420tacgacgcggcgtggaacagcttcgtggtgaaatctctggtcgctcagcaggaaaaagct480gcagctgacgtgcaattgcgtggcgttccggcgatgtttgttaacggtaaatatcagctg540aatccgcagggtatggataccagcaatatggatgtttttgttcagcagtatgctgataca600gtgaaatatctgtccgagaaaaaataa627<210>5<211>711<212>dna<213>dsbc<400>5atgaagaaaggttttatgttgtttactttgttagcggcgttttcaggctttgctcaggct60gatgacgcggcaattcaacaaacgttagccaaaatgggcatcaaaagcagcgatattcag120cccgcgcctgtagctggcatgaagacagttctgactaacagcggcgtgttgtacatcacc180gatgatggtaaacatatcattcaggggccaatgtatgacgttagtggcacggctccggtc240aatgtcaccaataagatgctgttaaagcagttgaatgcgcttgaaaaagagatgatcgtt300tataaagcgccgcaggaaaaacacgtcatcaccgtgtttactgatattacctgtggttac360tgccacaaactgcatgagcaaatggcagactacaacgcgctggggatcaccgtgcgttat420cttgctttcccgcgccaggggctggacagcgatgcagagaaagaaatgaaagctatctgg480tgtgcgaaagataaaaacaaagcgtttgatgatgtgatggcaggtaaaagcgtcgcacca540gccagttgcgacgtggatattgccgaccattacgcacttggcgtccagcttggcgttagc600ggtactccggcagttgtgctgagcaatggcacacttgttccgggttaccagccgccgaaa660gagatgaaagaattcctcgacgaacaccaaaaaatgaccagcggtaaataa711<210>6<211>486<212>dna<213>skp<400>6atgaaaaaatggctgctggctgctggtctgggtctggctctggctacctctgctcaggct60gctgacaaaatcgctatcgttaacatgggttctctgttccagcaggttgctcagaaaacc120ggtgtttctaacaccctggaaaacgaattcaaaggtcgtgcttctgaactgcagcgtatg180gaaaccgacctgcaggctaaaatgaaaaaactgcagtctatgaaagctggttctgaccgt240accaaactggaaaaagacgttatggctcagcgtcagaccttcgctcagaaagctcaggct300ttcgaacaggaccgtgctcgtcgttctaacgaagaacgtggtaaactggttacccgtatc360cagaccgctgttaaatctgttgctaactctcaggacatcgacctggttgttgacgctaac420gctgttgcttacaactcttctgacgttaaagacatcaccgctgacgttctgaaacaggtt480aaataa486当前第1页12