本发明涉及细胞培养技术领域，尤其是涉及一种克氏原螯虾成熟卵细胞的分离及其原代培养方法。
背景技术：
克氏原螯虾又称红色沼泽螯虾，俗称小龙虾，在动物分类学上隶属甲壳纲、十足目、螯虾科、原螯虾属，原产于美国北部、墨西哥南部地区，是一种世界性食用虾类，20世纪初传入日本，30年代由日本传入中国南京附近，虽然只有短短的几十年历史，但蔓延、发展的速度十分迅猛，现已遍布全国，归化为我国一个新型淡水经济虾类品种。
克氏原螯虾在自然状态下，5-9月份为交配季节，其中6-8月份为高峰期。由于小龙虾独特的生理生化特点，不是交配后马上就产卵，而是在交配后7-30天的时间才产卵。交配时，雄虾用螯足钳住雌虾的螯足，用步足抱住雌虾，将雌虾翻转。雄虾的钙质交接器与雌虾储精囊连接，雄虾的精夹顺着交接器进入雌虾的储精囊。雌虾从第三对步足基部的生殖孔排卵并随卵排出较多蛋清状胶质，将卵包裹，卵经过储精囊时，胶质状物质促使储精囊内的精夹释放出精子，使卵受精。最后胶质状物质包裹着受精卵到达雌虾的腹部，受精卵黏附在雌虾的腹足上，腹足不停地摆动以保证受精卵孵化时所必需的溶氧供应。
在人工放养的水族箱中，成熟的小龙虾只要是在水温合适的情况下都会交配，但产卵的虾较少且产卵时间较晚。在自然状况下，雌雄亲虾交配之前，就开始掘洞筑穴，雌虾产卵和受精卵孵化过程多数在洞穴中完成。
克氏原螯虾肉味鲜美，风味独特，蛋白质含量高，脂肪含量低，虾黄具有蟹黄味，尤其钙、磷、铁质含量丰富，是营养价值较高的动物性食品。据农业部渔业渔政管理局、全国水产技术推广总站日前发布的《2017中国小龙虾产业发展报告》数据显示，2016年我国小龙虾消费量达到了87.93万吨，产值564.10亿元，经济总产值1466.10亿元，全产业链从业人员近500万人。这意味着小龙虾产业已经强势跻身新“千亿级”市场。自20世纪初以来，不少养殖工作者一直致力于龙虾人工育苗、养殖技术等的研究。然而，在小龙虾幼虾培育方面，迄今仅取得非常有限的进展，一些技术上的难题仍未能攻破，大规模育苗生产还不能实现。
技术实现要素：
针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种克氏原螯虾成熟卵细胞的分离及其原代培养方法。本发明建立的卵细胞体外分离及原代培养方法，为体外克氏原螯虾的生殖行为和繁殖特性研究提供了理论依据，也为人工授精、细胞毒理等相关领域的研究提供细胞工具和支撑。
本发明的技术方案如下：
一种克氏原螯虾成熟卵细胞的分离及其原代培养方法，所述方法包括如下步骤：
(1)对性成熟阶段克氏原螯虾雌虾进行解剖，初分离胶质包裹的卵细胞，转移到离心管中，用预先充氧的pbs溶液冲洗，加入复合酶静置消化，重复1～3次，每次0.5～1h，制得卵细胞混合液；
(2)在无菌工作台中，取消化后的克氏原螯虾卵细胞混合液，用预先充氧的细胞消化液清洗3次，用超微显微镜观察卵细胞密度和活性，无菌吸管反复吹打，经过细胞筛过滤，滤液转移至离心管中800～1200r/min离心5～10min，获得卵细胞悬液；卵细胞悬液用台盼蓝进行染色，用血球计数板计数；
(3)吸取卵细胞悬液，加入含100ui/ml青霉素和100ug/ml链霉素的2*l-15培养基中，吹打均匀后接种至96孔板中，将96孔板放置于co2细胞恒温培养箱中培养，温度为28℃，培养2小时后，在倒置显微镜下观察视野内卵细胞脱落和贴壁的情况，计算贴壁率。
步骤(1)中所述复合酶为淀粉酶与胰酶的混合物，两者的质量比为1:1。
步骤(2)中所述细胞消化液为上海培源公司的
步骤(3)中所述l-15培养基制备方法为：取1l规格l-15干粉溶解于500ml蒸馏水中，在无菌环境下0.22um滤膜过滤除菌。
本发明克氏原螯虾成熟卵细胞原代培养在72小时内存活率高于50％。
本发明有益的技术效果在于：
本发明通过分析克氏原螯虾卵细胞生殖生理学特征，针对性得考虑到卵细胞从第三生殖孔排出含有蛋清状胶质包裹的卵细胞，而这种蛋清状胶质主要成分是大分子多糖组成的糖被，因次，建立了一种可以预先消化这种糖被的细胞消化液，即淀粉酶/胰酶按照比例混合(1:1)，结果表明可以在一定程度上消化糖被的保护层，分离活性卵细胞，实现原代培养。克氏原螯虾雌虾的产卵率不高，平均在300-500左右。因此，本发明建立的卵细胞体外分离及原代培养方法，为体外克氏原螯虾的生殖行为和繁殖特性研究提供了理论依据，也为人工授精、细胞毒理等相关领域的研究提供细胞工具和支撑。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
一种克氏原螯虾成熟卵细胞的分离及其原代培养方法，所述方法包括如下步骤：
(1)对性成熟阶段克氏原螯虾雌虾进行解剖，初分离胶质包裹的卵细胞，转移到1.5ml离心管中，用预先充氧的pbs溶液冲洗，加入淀粉酶/胰酶(50u:50u)静置消化，重复3次，每次1小时；
(2)在无菌工作台中，取消化后的克氏原螯虾雌虾卵细胞混合液，用预先充氧的上海培源公司的
(3)吸取卵细胞悬液，加入含100ui/ml青霉素和100ug/ml链霉素的2*l-15培养基中，吹打均匀后接种至96孔板中，将96孔板放置于co2细胞恒温培养箱中培养，温度为28℃，培养2小时后，在倒置显微镜下观察视野内卵细胞脱落和贴壁的情况，计算贴壁率为85％；
步骤(3)中所述l-15培养基制备方法为：取1l规格l-15干粉溶解于500ml蒸馏水中，在无菌环境下0.22um滤膜过滤除菌。
本实施例中克氏原螯虾成熟卵细胞原代培养在72小时内存活率为65％。
实施例2
一种克氏原螯虾成熟卵细胞的分离及其原代培养方法，所述方法包括如下步骤：
(1)对性成熟阶段克氏原螯虾雌虾进行解剖，初分离胶质包裹的卵细胞，转移到1.5ml离心管中，用预先充氧的pbs溶液冲洗，加入淀粉酶/胰酶(50u:50u)静置消化，重复2次，每次0.5小时；
(2)在无菌工作台中，取消化后的克氏原螯虾雌虾卵细胞混合液，用预先充氧的上海培源公司的
(3)吸取卵细胞悬液，加入含100ui/ml青霉素和100ug/ml链霉素的2*l-15培养基中，吹打均匀后接种至96孔板中，将96孔板放置于co2细胞恒温培养箱中培养，温度为28℃，培养2小时后，在倒置显微镜下观察视野内卵细胞脱落和贴壁的情况，计算贴壁率为86％；
步骤(3)中所述l-15培养基制备方法为：取1l规格l-15干粉溶解于500ml蒸馏水中，在无菌环境下0.22um滤膜过滤除菌。
本实施例中克氏原螯虾成熟卵细胞原代培养在72小时内存活率为70％。
实施例3
一种克氏原螯虾成熟卵细胞的分离及其原代培养方法，所述方法包括如下步骤：
(1)对性成熟阶段克氏原螯虾雌虾进行解剖，初分离胶质包裹的卵细胞，转移到1.5ml离心管中，用预先充氧的pbs溶液冲洗，加入淀粉酶/胰酶(50u:50u)静置消化，重复2次，每次1小时；
(2)在无菌工作台中，取消化后的克氏原螯虾雌虾卵细胞混合液，用预先充氧的上海培源公司的
(3)吸取卵细胞悬液，加入含100ui/ml青霉素和100ug/ml链霉素的2*l-15培养基中，吹打均匀后接种至96孔板中，将96孔板放置于co2细胞恒温培养箱中培养，温度为28℃，培养2小时后，在倒置显微镜下观察视野内卵细胞脱落和贴壁的情况，计算贴壁率为90％；
步骤(3)中所述l-15培养基制备方法为：取1l规格l-15干粉溶解于500ml蒸馏水中，在无菌环境下0.22um滤膜过滤除菌。
本实施例中克氏原螯虾成熟卵细胞原代培养在72小时内存活率为70％。